Name: Genomweite Kartierung der Drug-DNA-Wechselwirkungen in Zellen mit COSMIC (Vernetzung von kleinen Molekülen, um Chromatin isolieren) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Erfahren Sie, wie COSMIC die genomweite Kartierung von DNA-bindenden Molekülen ermöglicht. Diese Methode misst direkte Ligand-DNA-Wechselwirkungen und liefert Einblicke in Wirkmechanismen für die Arzneimittelentwicklung.

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Wir danken den Mitgliedern des Ansari-Labors und Prof. Parameswaran Ramanathan für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch NIH-Stipendien CA133508 und HL099773, das H. I. Romnes Faculty Fellowship und den W. M. Keck Medical Research Award an A.Z.A. G.S.E. unterstützt. wurde durch ein Peterson Fellowship des Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215 unterstützt. A.E. wurde durch das Morgridge Graduate Fellowship und das Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship unterstützt, und D.B. wurde durch das NSEC-Stipendium der NSF unterstützt.

1. Die Vernetzung in lebenden Zellen <ol><li> Beginnen Sie mit ~ 2,5x10 7 H1 Zellen oder anderen kultivierten Zellen. HINWEIS: Diese Anzahl von H1-Zellen entspricht fünf 10-cm-Schalen (ca. 40% Konfluenz). </li><li> Wachsen Zellen in E8 Medien auf einer Fläche, die pluripotenten Stammzellen unterstützt beschichteten Schalen (siehe Materialliste) und inkubieren sie bei 37 ° C in der feuchten Atmosphäre von 5% CO 2. Ernten Sie die Zellen enzymatisch (siehe Materialliste). Hinweis: Nicht in H1-Zellen zu 90% Konfluenz überschreiten; Konfluenz induziert die spontane Differenzierung der H1-Zellen. Um Zellen zu zählen, wachsen eine zusätzliche 10-cm-Schale von Zellen, heben Sie die Zellen enzymatisch wie in den Abschnitten 1,8 bis 1,10 beschrieben, und zählen sie mit einer Zählkammer. <ol><li> Vorbereitung E8 Kulturmedien, wie in Chen et al. 54 </li></ol></li><li> Vor der Zugabe von Polyamid, Entfernen des verbrauchten Kulturmedien mit einer Pasteur-Pipette in ein Vakuumfalle befestigt sind. In frischem Medium mit soerological Pipette und Pipettenspender (8 ml pro 10-cm-Schale). Hinweis: Fügen Sie die Medien auf die Seite der Schale, um zu vermeiden Aufbrechen der Zellen. Ab diesem Zeitpunkt schützen die Zellen vor Licht zu vorzeitigem Photovernetzung zu vermeiden. </li><li> Hinzufügen Polyamid mit einer Pipette (8 ul 400 uM Polyamid in DMSO, 400 nM Endkonzentration), die direkt zu den Kulturmedien jeder Schale. Schwenken Sie die Schüssel, um das Polyamid gleichmäßig in den Medien zu dispergieren. HINWEIS: Konzentration kann variiert werden, aber sicherzustellen, daß keine zelluläre Toxizität für die ausgewählte Behandlung beobachtet. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen 24 h 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2, und sicherzustellen, dass sie vor Licht geschützt. HINWEIS: Die Inkubationszeit kann Polyamid zu messen, die Bindung über die Zeit variiert werden. </li><li> Waschen Sie jede 10-cm-Schale mit 4 ml PBS (1,05 mM monobasisches Kaliumphosphat, 155,17 mM Natriumchlorid, 2,97 mM dibasisches Natriumphosphat) unter Verwendung einer serologischen Pipette und Pipetten dispenser. Absaugen PBS und 3 ml E8 Kulturmedien. </li><li> Mit dimmen die Lichter, entfernen Sie den Deckel von 5 Kulturschalen und legen Sie die Zellen auf einer ebenen Fläche außerhalb der Haube. Legen Sie ein Glasfilter über die 5-Kulturschalen mit λ &lt;300 nm ausfiltern Licht. Legen Sie die UV-Quelle auf der Oberseite des Filters. Vernetzungs Proben 30 min lang mit 365 nm UV-Bestrahlung (2,4 mW / cm 2). HINWEIS: Vernetzungszeit sollte empirisch bestimmt werden. </li><li> Bringen Kulturschalen wieder auf der Motorhaube. Saugen Sie das Medium mit einer Pasteurpipette auf eine Vakuumfalle angebracht. Jedes 10-cm-Schale mit 4 ml PBS waschen. Saugen Sie das PBS. In 3 ml Enzym für Zelldissoziation (siehe Materialliste) pro 10-cm-Schale, um die Zellen zu trennen. Inkubiere 5 min bei 37 ° C. HINWEIS: Nicht Vorwärmung des Enzyms. </li><li> Stillen Sie das Enzym mit 3 ml E8 Medien pro Schale. Transfer dissoziierten Zellen in eine 15-ml konischen Röhrchen. HINWEIS: Legen Sie Zellen auf Eis ab diesem Zeitpunkt. </li><li> Centrifuge dissoziierten Zellen 5 min, 500 × g bei 4 ° C. Überstand wird abgesaugt, um Enzym und Medien zu entfernen. ANMERKUNG: Pause Punkt. Zellen können schockgefroren in flüssigem Stickstoff, bei -80 ° C für die nachfolgende Verarbeitung zu einem späteren Zeitpunkt gespeichert. </li></ol> 2. Isolierung von Chromatin <ol><li> Wird mit 1,2 ml KOSMISCHER Puffer (20 mM Tris-HCl [pH 8,1], 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton-X100, 0,1% SDS) und Pipette nach oben und unten mehrere Male, um das Zellpellet für jede Probe in resuspendieren 1,2 ml COSMIC Puffer. <ol><li> Add 133 ul von jeweils 100 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 100 mM Benzamidin und 150 &amp; mgr; M Pepstatin Proteaseinhibitoren frisch zu einer Endkonzentration von 1 mM für PMSF und Benzamidin und 1,5 uM für Pepstatin. Split Lösung von Zelllysat in zwei bernsteinfarbenen 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li></ol></li><li> Ultraschallbehandlung mit Ultraschallgerät 35 min (10 s auf 10 s ab, die 60% Energie), das Genom, um zwischen 100 ein Fragmentnd 500 bp. <ol><li> Halten des Pegels des Chromatins Lösung im Reaktionsgefäß parallel zu der Wasserpegel in dem Reservoir. Bestätigen Sie diese Ebene durch eine Sichtprüfung. . HINWEIS: Bestätigen, dass die DNA wurde mit einem 1,5% Agarosegel geschert 55 </li><li> Optimieren Sie die Beschallungszeit empirisch. Verwenden einer minimalen Menge an Eis in den Behälter, um die Proben zu kühlen und sicherzustellen, dass das Eis nicht zwischen den Proben und dem Becher Horn stören. </li></ol></li><li> Zentrifugieren Sie die Probe 12.000 xg 10 min. Speichern Sie die wässrige Lösung, die lösliche Chromatin durch die Übertragung an eine neue Bernstein-Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Pipette enthält. Entsorgen Sie das Pellet. </li><li> Übertragen Sie 110 ul (10%) der Probe in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und beschriften Sie sie Eingang DNA. Bei -80 ° C. Speichern Sie den Rest der Chromatin-Probe auf Eis für den Einsatz in Schritt 3.3. </li></ol> 3. Erfassung von Ligand-DNA-Crosslinks <ol><li> Mit einer Pipette 60 ul streptavi verzichtendin-beschichteten magnetischen Kügelchen in ein Mikrozentrifugenröhrchen. 1 ml COSMIC Puffer und mischen auf einem Kolbenpendel 5 min bei RT. Zeigen magnetischen Kügelchen auf magnetische Trennung Rack 2 min, um Perlen zu erfassen. Entfernen COSMIC-Puffer mit einer Pipette. Hinweis: Schließen Sie nicht zulassen, dass die Perlen austrocknen. Gehen sofort zum nächsten Schritt. </li><li> In Chromatin Probe (~ 1 ml), um Perlen (60 &amp; mgr; l) und Resuspendieren der Kügelchen. Inkubieren Chromatin mit Streptavidin beschichteten magnetischen Kügelchen mindestens 4 h auf einer rotierenden Drehschüttler bei 4 ° C. Falls gewünscht, die Proben unter O / N. </li></ol> 4. Isolierung affinitätsgereinigtem DNA <ol><li> Waschen Sie Perlen mit 7 min Intervall bei RT mit folgenden Waschpuffer, um unspezifische Wechselwirkungen zu entfernen. Verwenden Sie eine magnetische Trennung Rack, um Perlen nach jedem Waschen zu erfassen. Resuspendieren der Kügelchen nach jeder Änderung in Waschpuffer. </li><li> Bereiten Sie den Waschpuffer in destilliertem entionisiertem Wasser und Filter (0,2 um) vor dem Gebrauch. Speicher Waschpuffer 1 und 2 bei 4 ° C für sehrere Monate. Bereiten Sie jeden Tag Waschpuffer 3 frisch. Hinzufügen und Entfernen von Waschpuffer aus der Probe mit einer Pipette. Für 2 bis 4, aus 1 und 3 (5 mM), jeweils in den Wäschen. Die Proben können zusätzlich zweimal mit COSMIC Puffer (einmal 12 Stunden, einmal 4 Stunden) vor der unten aufgeführten Wäschen gewaschen werden. <ol><li> Einmal mit Waschpuffer 1 (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 3% SDS) zu waschen. Einmal mit Waschpuffer 2 (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP40, 1% Natriumdesoxycholat) waschen. Zweimaliges Waschen mit Waschpuffer 3 (4 M Harnstoff, 10 mM Tris-Cl [pH 7,5], 1 mM EDTA, 0,1% NP-40). Zweimaliges Waschen mit Tris-EDTA (TE) -Puffer (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA). </li></ol></li><li> Resuspendieren der Kügelchen in 200 ul TE-Puffer mit einer Pipette. Diese Probe von aufgenommenen DNA wird als affinitätsgereinigtem (AP) DNA bezeichnet. </li><li> Ergänzen Sie die Eingabe und AP-DNA mit 10x Cross Reversal-Puffer (100 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 M KOH, 4 mMEDTA) bis zu einer Endkonzentration von 90 ° C 1x. 56,57 Inkubieren 30 min. HINWEIS: 254 nm UV-Strahlung kann auch verwendet werden, um die Vernetzungs Psoralen, 58 aber Cyclobutyl Pyrimidindimeren aus Bestrahlung bei dieser Wellenlänge gebildet werden umkehren und stören Aufarbeitung von DNA werden. </li><li> Für AP DNA, legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen die Probe auf magnetische Trennung enthält, Rack 2 min bei RT und Mittlerflüssigkeit (DNA) mit einer Pipette. Übertragung der DNA-AP (die von den Kügelchen freigesetzt wurde) zu einem neuen amber Reaktionsgefäß. HINWEIS: Die gewünschte AP-DNA wird in der Flüssigkeit, nicht mehr an die Perlen gebunden. </li><li> Neutralisieren Eingangs- und AP DNA mit konzentrierter HCl auf pH 7 durch Zugabe von ungefähr 1 &amp; mgr; l 6 N HCl pro 100 &amp; mgr; l Probe mit einer Pipette. Bestätigen Sie die Proben durch Zugabe von ~ 0,5 ul auf pH-Papier mit einer Pipette WARNUNG neutralisiert. Konzentrierte HCl ist eine starke ätzende Säure. Griff nach Ihrer Institution217; s Richtlinien für die geeignete persönliche Schutzausrüstung. </li><li> Hinzufügen RNase A (100 mg / ml) auf 0,2 ug / ul Endkonzentration an beide Eingangs und AP DNA. Inkubiere 1 h bei 37 ° C. Hinzufügen Proteinase K (20 mg / ml) auf 0,2 ug / ul Endkonzentration an beide Eingangs und AP DNA, hinzuzufügen. Inkubiere 1 h bei 55 ° C. </li><li> Reinigen die DNA mit einem DNA-Säule Cleanup Kit (siehe Materialliste). 55 Elute DNA in 58 &amp; mgr; l DNA-Grade-H 2 O Shop Ein- und AP-Proben bei -20 oder -80 ° C </li><li> Analysieren AP DNA durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) mit Locus-spezifische Primer und / oder von der nächsten Generation Sequenzierung. Für qPCR Verwenden 2 ul AP DNA pro Locus mit den folgenden Parametern: 1 Zyklus 95 ° C 10 min und 40 Zyklen von 95 ° C 20 sec, 54 ° C oder 56 ° C 20 sec, 72 ° C 40 sec. HINWEIS: Die Glühtemperatur sollte entsprechend der Schmelztemperatur der verwendeten Primerpaare modifiziert werden. Wählen Sie ein Glühen temperature, dass minimiert die Quantifizierung Zyklus ohne unspezifische Amplifikation. HINWEIS: Für die Analyse von Next-Generation-Sequenzierung, Ziel für mindestens 10 Millionen abgebildet liest. Die Anzahl der abgebildeten liest, kann durch Erhöhung der Menge von AP-DNA und durch Kombination weniger Proben in einen Lauf zur Sequenzierung erhöht werden. Mehr liest Verbesserung der Empfindlichkeit. Standardpakete für ChIP-seq-Analyse (zB Homer, 59 MACS, 60 und SPP 61) arbeiten mit COSMIC-seq Daten. Wie bei anderen Methoden, die auf der nächsten Generation Sequenzierung beruhen, einschließlich der Genomsequenzierung und ChIP-seq, repetitive Regionen zu schaffen Unklarheiten in Ausrichtung und Montage und bleibt eine technische Herausforderung also. </li></ol>

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Eine der größten Herausforderungen bei konventionellem ChIP ist die Identifizierung geeigneter Antikörper. ChIP hängt stark von der Qualität des Antikörpers ab, und die meisten kommerziellen Antikörper sind für ChIP nicht akzeptabel. Tatsächlich stellte das Konsortium der Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) fest, dass nur 20 % der kommerziellen Antikörper für ChIP-Assays geeignet sind. 50 Bei COSMIC werden Antikörper durch Streptavidin ersetzt. Da Polyamide mit Biotin funktionalisiert sind, wird Streptavidin...

Die Informationen, um jede Zelle im menschlichen Körper in DNA kodiert. Die selektive Verwendung dieser Informationen regelt das Schicksal einer Zelle. Transkriptionsfaktoren (TF) sind Proteine, die an spezifische DNA-Sequenzen binden, um eine bestimmte Untergruppe der Gene im Genom zu exprimieren, und die Fehlfunktion des TFs ist mit dem Auftreten von einer Vielzahl von Krankheiten in Verbindung gebracht, einschließlich Entwicklungsdefekten, Krebs und Diabetes . 1,2 Wir sind daran interessiert, Moleküle, die wahlweise mit dem Genom binden und modulieren Genregulationsnetzwerken können. Polyamide N -methylpyrrole komponiert und N-Methylimidazol rational entworfene Moleküle, die DNA mit Spezifitäten und Affinitäten, die rivalisierenden natürlichen Transkriptionsfaktoren. 3-6 Diese Moleküle auf bestimmte Sequenzen in der kleinen Furche der DNA binden zielen können. 4,5,7 -11 Polyamide haben sowohl repress beschäftigt und die Expression spezifischer g aktivierenenen. 4,12-19 Sie haben auch interessante antivirale 20-24 und Anti-Krebs-12,13,25-30 Eigenschaften. Ein attraktives Merkmal der Polyamide ist ihre Fähigkeit, DNA-Sequenzen, die methyliert 31,32 sind und um Histon-Proteine ​​gewickelt 9,10,33 zuzugreifen. Um die umfassende Bindungsspezifitäten von DNA-bindenden Moleküle zu messen, erstellt unser Labor die verwandten Standortkennung (CSI) Methode. 34-39 Die vorhergesagte Auftreten von Bindungsstellen auf Basis von in-vitro-Spezifitäten (genomescapes) können auf dem Genom angezeigt werden, weil der In-vitro-Bindungsintensität direkt proportional zur Assoziationskonstanten sind (K a). 34,35,37 Diese genomescapes Einblick in Polyamid Belegung über das Genom aber Messpolyamidbindung in lebenden Zellen eine Herausforderung gewesen. DNA wird fest in den Zellkern, die die Zugänglichkeit der Bindungsstellen beeinflussen könnten verpackt. Das accessibility dieser chromatinized DNA-Sequenzen zu Polyamiden, bleibt ein Rätsel. In jüngster Zeit viele Methoden, um Interaktionen zwischen kleinen Molekülen und Nukleinsäuren entstanden studieren. 40-48 Die chemische Affinitätseinfangen massiv-parallelen DNA-Sequenzierung (Chem-seq) ist eine solche Technik. Chem-seq verwendet Formaldehyd, kleine Moleküle zu einer genomischen Ziel von Interesse und eines biotinylierten Derivats von einem kleinen Molekül von Interesse zu vernetzen, um den Liganden-Target-Wechselwirkung aufzunehmen. 48,49 Formaldehyd-Vernetzung führt zu einer indirekten Wechselwirkungen, Fehlalarme zu erzeugen können. 50 Wir entwickelten eine neue Methode, die Vernetzung von kleinen Molekülen, um Chromatin (COSMIC), 51 mit einem Photovernetzungsmittel zu isolieren, um diese so genannte &quot;Phantom&quot; Spitzen zu beseitigen. 50 zu beginnen, wir entworfen und synthetisiert trifunktionellen Derivate von Polyamiden. Diese Moleküle enthalten eine DNA-Bindungs ​​polyamide ein Photovernetzer (Psoralen) und eine Affinität Griff (Biotin, Abbildung 1). Mit trifunktionalen Polyamide, können wir kovalent erfassen Polyamid-DNA Wechselwirkungen mit 365 nm UV-Bestrahlung, einer Wellenlänge, die nicht DNA schädigt oder zu veranlassen nicht Psoralen-basierte Vernetzung. 51 Als nächstes wir Fragment des Genoms und zur Reinigung des aufgenommenen DNA unter stringenten, halb -denaturing Bedingungen an DNA, die nicht-kovalent gebunden ist verringern. So sehen wir COSMIC als Methode zur chem-seq verwandt, aber mit einer mehr direkte Auslesen der DNA-Targeting. Wichtig ist, dass die schwache (K a 10 3 bis 10 4 M -1) Affinität von Psoralen für die DNA nicht nachweisbar Auswirkungen Polyamid-Spezifität. 51,52 Die angereicherten DNA-Fragmente kann entweder quantitative Polymerase-Kettenreaktion 51 analysiert werden (COSMIC-qPCR) oder mit der nächsten Generation Sequenzierung 53 (COSMIC-seq). Diese Daten ermöglichen eine unvoreingenommene, Genom-geführte Design von Liganden interwirken mit ihren gewünschten genomischen Loci und minimieren Nebeneffekte. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53510/53510fig1.jpg"/> Abbildung 1. Bioactive Polyamide und COSMIC Schema. (A) Hairpin Polyamiden 1-2 Target die DNA-Sequenz 5&#39;-WACGTW-3 &#39;. Linearen Polyamiden 3-4 Ziel 5&#39;-AAGAAGAAG-3 &#39;. Ringe der N-Methylimidazol zur Klarheit fett. Offene und gefüllte Kreise stellen N -methylpyrrole und N-Methylimidazol auf. Platz für 3-Chlorthiophen und Rauten stellen β-Alanin. Psoralen und Biotin sind von P und B bezeichnet sind. (B) COSMIC Schema. Zellen mit trifunktionellen Derivate von Polyamiden behandelt. Nach der Vernetzung mit einer 365 nm UV-Bestrahlung, Zellen lysed und genomische DNA geschert. Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen zugegeben werden, um Polyamid-DNA-Addukte zu erfassen. Die DNA wird freigesetzt und kann durch quantitative PCR (qPCR) oder mit der nächsten Generation Sequencing (NGS) analysiert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53510/53510fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)</td><td>jede Quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzamidin</td><td>jede Quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>jede Quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>jede Quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Life Technologies</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>Andere Quellen können verwendet werden</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Zelldissoziationsreagenz</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Wir haben andere Hersteller von DNA-Säulen mit Erfolg ausprobiert.</td></tr><tr><td>TruSeq ChIP Probenvorbereitungskit</td><td>Illumina</td><td>IP-202-1012</td><td>Dieses Kit kann zur Vorbereitung von COSMIC DNA für die Sequenzierung der nächsten Generation verwendet werden</td></tr><tr><td>Matrigel Basalmembran Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>Wird verwendet, um Platten zu beschichten, um H1-ESCs zu züchten,</td></tr><tr><td>pH-Papier</td><td></td>, bernsteinfarbene <td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>jeder Quelle</td> Mikrozentrifugenröhrchen jeder Quelle <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>jede Quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrex-Filter</td><td>jede Quelle</td><td></td><td>Pyrex-Backformen sind geeignet</td></tr><tr><td>qPCR-Mastermix</td><td>jede Quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>jede Quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl (6 N)</td><td>jede Quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10-cm-Gewebekulturschalen</td><td>jede Quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipetten</td><td>jede Quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten</td><td>Jede Quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen</td><td>Jede Quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml Konische Röhrchen</td><td>Jede Quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Jede Quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Jede Quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>Jede Quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetisch Trenngestell</td><td>für jede Quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Quelle</td><td>CalSun</td><td>B001BH0A1A</td><td>Andere UV-Quellen können verwendet werden, aber die Vernetzungszeit muss empirisch optimiert werden</td></tr><tr><td>Misonix Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>S4000 mit 431C1 Cup Horn</td><td>Andere Ultraschallgeräte können verwendet werden, aber die Beschallungsbedingungen müssen empirisch optimiert werden</td></tr><tr><td>Befeuchteter CO2 Inkubator</td><td>jede Quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biologische Sicherheitswerkbank mit Vakuumauslass</td><td>beliebiger Quelle</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

genomweite kartierung der drug-dna-wechselwirkungen in zellen mit cosmic (vernetzung von kleinen molekülen, um chromatin isolieren)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Das Genom ist das Ziel von einigen der wirksamsten Chemotherapeutika, aber die meisten dieser Medikamente fehlt DNA-Sequenzspezifität, die dosislimitierende Toxizität und viele unerwünschte Nebenwirkungen führt. Targeting des Genoms mit sequenzspezifischen kleine Moleküle können Moleküle mit einem erhöhten therapeutischen Index und weniger Nebeneffekte zu ermöglichen. N -methylpyrrole / N-Methylimidazol Polyamide sind Moleküle, die rational gestaltet werden kann, um spezifische DNA-Sequenzen mit vorzüglicher Präzision abzuzielen. Und im Gegensatz zu den meisten natürlichen Transkriptionsfaktoren, Polyamide können methylierte und chromatinized DNA ohne einen Verlust der Affinität binden. Die Sequenzspezifität der Polyamide wurde ausgiebig in vitro mit zugehörigen Standort-Identifizierung (CSI), die mit traditionellem biochemische und biophysikalische Methoden untersucht, aber die Untersuchung der Bindung an Polyamid genomische Ziele in Zellen weiter Ferne. Eine Methode Wir berichten hier, um die Vernetzung von kleinen Molekülen isolate Chromatin (COSMIC), dass identifiziert Polyamid-Bindungsstellen in das Genom. KOSMISCHER ähnelt Chromatinimmunpräzipitation (Chip), unterscheidet sich jedoch in zwei wichtigen Punkten: (1) ein Photovernetzungsmittel verwendet wird, um selektiv, zeitlich gesteuerte Abscheidung von Polyamid Bindungsereignisse, und (2) das Biotin-Affinität Griff verwendet wird, um Polyamid reinigen Freigabe -DNA-Konjugate unter semi-denaturierenden Bedingungen an DNA, die nicht-kovalent gebunden ist verringern. COSMIC ist eine allgemeine Strategie, die verwendet werden können, um die genomweite Bindungsereignisse von Polyamiden und anderen Genom-Targeting-Chemotherapeutika zu offenbaren.

Um ungleichmäßige Genom Fragmentierung und andere Variablen zu berücksichtigen, sollte die gereinigte DNA immer gegen eine Referenz von Eingang DNA normalisiert werden. Spezifisch für einen Locus von Interesse Primer können verwendet werden. Ist es hilfreich, auch analysieren, einen Ort, bei dem das Molekül nicht erwartet werden, zu binden, als eine negative Kontrolle. Wir sehen eine&gt; 100-fache Steigerung der Polyamid-Belegung bei Bestrahlung mit 365-nm-Licht (Abbildung 2). <p class="jove_content...

Die Ermittlung der direkten Ziele der Genom-Targeting-Moleküle vor eine große Herausforderung. Zu verstehen, wie DNA-bindende Moleküle greifen das Erbgut, eine Methode, die auf die Vernetzung von kleinen Molekülen beruht, um Chromatin zu isolieren (COSMIC) entwickelten wir.

Genomweite Kartierung der Drug-DNA-Wechselwirkungen in Zellen mit COSMIC (Vernetzung von kleinen Molekülen, um Chromatin isolieren)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die genomweiten Bindungsprofile von Polyamiden und anderen DNA-zielgerichteten kleinen Molekülen in Zellen zu bestimmen. Diese Methode kann die Weiterentwicklung der Arzneimittel-DNA-Chemie voranbringen, indem das Genom zur Leitung der Konzeption DNA-zielgerichteter Moleküle herangezogen wird. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass direkte Ligand-DNA-Wechselwirkungen gemessen werden, um Einblicke in den Wirkmechanismus von Liganden zu erhalten, die auf das Genom wirken.Einige der erfolgreichsten therapeutischen Wirkstoffe sind kleine Moleküle, die an DNA binden und genomische Vorgänge stören. Obwohl diese Methode zur Untersuchung von Polyamiden entwickelt wurde, kann sie auch auf andere Klassen von DNA-zielgerichteten Molekülen angewendet werden. Die Zellen für dieses Experiment werden in E8-Medium auf 10-cm-Schalen kultiviert, die mit einer Oberflächenbeschichtung versehen sind, die pluripotente Stammzellen bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid unterstützt.Bevor das Polyamid hinzugefügt wird, entfernen Sie das verbrauchte Kulturmedium und geben Sie 8 ml frisches Medium pro 10-cm-Schale hinzu. Schützen Sie die Zellen ab diesem Zeitpunkt vor Licht, um eine vorzeitige photochemische Vernetzung zu vermeiden. Geben Sie das Polyamid mithilfe einer Pipette direkt in das Kulturmedium jeder Schale.Swirlen Sie die Petrischale, um das Polyamid gleichmäßig im Medium zu verteilen. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid und schützen Sie sie vor Licht. Am folgenden Tag waschen Sie jede 10-cm-Petrischale mit 4 ml PBS unter Verwendung einer serologischen Pipette und einer Pipettierhilfe. Entfernen Sie das PBS und geben Sie 3 ml E8-Kulturmedium hinzu. Stellen Sie die Zellen bei gedämpftem Licht auf eine flache Oberfläche außerhalb des Sicherheitswerks und nehmen Sie die Deckel der fünf Kulturschalen ab. Legen Sie einen Glasfilter über die fünf Kulturschalen, um Licht mit einer Wellenlänge unter 300 Nanometern zu filtern.Platzieren Sie die UV-Quelle über dem Filter. Vernetzen Sie die Proben 30 Minuten lang mit UVA-Strahlung von 365 Nanometern. Überführen Sie die Kulturschalen nach der UVA-Bestrahlung zurück in den Sicherheitswerkbank.Entfernen Sie das Medium mit einer Pasteurpipette, die an eine Vakuumfalle angeschlossen ist, und waschen Sie jede 10-cm-Schale mit 4 ml PBS. Entfernen Sie den PBS und geben Sie 3 ml Enzym zur Zelldissoziation pro 10-cm-Schale hinzu. Inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur.Stoppen Sie die Enzymreaktion mit 3 ml E8-Medium pro Platte. Überführen Sie die dissoziierten Zellen in ein 15-ml-Konischgefäß. Lagern Sie die Zellen ab diesem Zeitpunkt auf Eis.Zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen bei 500 x g und 4 Grad Celsius für fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand, um das Enzym und das Medium zu entfernen. Um mit dem Verfahren zur Chromatin-Isolierung zu beginnen, bereiten Sie den Cosmic-Puffer mit frischen Proteaseinhibitoren vor.Fügen Sie jeweils 12,1 Mikroliter frisch zubereiteter Proteaseinhibitoren mit 100 Millimolar PMSF, 100 Millimolar Benzamidin und 150 Mikromolar Pepstatin dem basalen kosmischen Puffer hinzu. Geben Sie 1,2 ml des kosmischen Puffers zum Zellpellet und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um es erneut aufzuschwemmen. Anschließend teilen Sie die Zellsuspension auf zwei braune 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf.Sonifizieren Sie mit einem Sonifikator, um das Genom in Fragmente zwischen 100 und 500 Basenpaaren zu zerlegen. Halten Sie den Füllstand der Chromatinlösung im Mikrozentrifugenröhrchen parallel zum Wasserstand im Reservoir. Überprüfen Sie diesen Füllstand durch visuelle Inspektion. Die Sonikationszeit wurde empirisch optimiert: Sonifizieren Sie bei 60 % Leistung, 10 Sekunden an und 10 Sekunden aus, insgesamt 35 Minuten. Verwenden Sie eine minimale Menge Eis im Reservoir, um die Proben zu kühlen, und stellen Sie sicher, dass das Eis nicht zwischen den Proben und dem Cup-Horn stört. Nach Abschluss der Sonikation zentrifugieren Sie die Probe bei 12 000 g für 10 Minuten.Speichern Sie die wässrige Lösung, die lösliches Chromatin enthält, indem Sie sie in ein neues braunes Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Entsorgen Sie das Pellet. Überführen Sie 110 Mikroliter oder 10 % der Probe in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.Als Eingabe-DNA kennzeichnen und bei 80 Grad Celsius lagern. Den Rest der Chromatinprobe auf Eis aufbewahren, um sie in den nächsten Schritten dieses Protokolls zu verwenden. Um Ligand-DNA-Quervernetzungen anzureichern, den Rest der Chromatinprobe zu den mit Streptavidin beschichteten magnetischen Perlen geben und die Mischung erneut suspendieren.Incubieren Sie das Chromatin mit den Kügelchen mindestens vier Stunden lang in einem rotierenden Schüttelmischer bei 4 Grad Celsius. Der benötigte Waschpuffer sollte in destilliertem, entionisiertem Wasser hergestellt und vor der Verwendung mit einem 0,2-Mikrometer-Filter filtriert werden. Die Puffer 1 und 2 können mehrere Monate bei 4 Grad Celsius gelagert werden, aber Puffer 3 muss täglich frisch hergestellt werden.Wenn die Inkubation des Chromatins mit den mit Streptavidin beschichteten magnetischen Perlen abgeschlossen ist, waschen Sie die Probe sieben Minuten lang mit Waschpuffer 1. Stellen Sie die Probe in einen magnetischen Trennhalter, um die Perlen zu fixieren, und entfernen Sie Waschpuffer 1. Geben Sie Waschpuffer 2 hinzu und waschen Sie weitere 7 Minuten.Anschließend zweimal mit Waschpuffer 3 je sieben Minuten lang waschen. Zuletzt zweimal mit TE-Puffer waschen. Nach dem letzten Waschschritt mit TE-Puffer die Perlen in 200 Mikrolitern TE-Puffer resuspendieren.Dieses Beispiel der gewonnenen DNA wird als affinitätsreinifizierte oder AP-DNA bezeichnet. Anschließend ergänzen Sie die Input-DNA und die AP-DNA mit 10x Cross-Link-Aufhebungspuffer auf eine Endkonzentration von 1x. Inkubieren Sie 30 Minuten bei 90 Grad Celsius.Stellen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit der AP-DNA zwei Minuten lang bei Raumtemperatur auf den magnetischen Trennstand, und überführen Sie anschließend die Flüssigkeit mit der AP-DNA in ein neues braunes Mikrozentrifugenröhrchen. Nach der Neutralisierung der Input- und AP-DNA geben Sie beiden DNA-Proben RNase A bis zu einer Endkonzentration von 0,2 Mikrogramm pro Mikroliter hinzu. Inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.Nach einer Stunde Proteinase K zu beiden Proben, der Input-DNA und der AP-DNA, hinzufügen, sodass eine Endkonzentration von 0,2 Mikrogramm pro Mikroliter erreicht wird. Eine Stunde bei 55 Grad Celsius inkubieren. Anschließend werden die Input- und AP-DNA mit einem DNA-Säulenaufreinigungs-Kit gereinigt und in DNA-graduiertem Wasser eluiert.Lagern Sie die DNA bei 20 oder 80 Grad Celsius, bis sie zur Analyse bereit ist. Die affinitätsgereinigte DNA sollte stets gegen eine Referenz der Input-DNA normalisiert werden. Repräsentative Ergebnisse aus der quantitativen PCR mit locus-spezifischen Primern zeigen eine mehr als 100-fache Zunahme der Polyamid-Besetzung nach Bestrahlung mit 365 Nanometer Licht.An angereicherte DNA kann auch mittels Next-Generation-Sequenzierung analysiert werden. Nach der Sequenzierung werden die rohen DNA-Leserichtungen am Genom ausgerichtet und Dichtespuren erstellt. Dieses Beispiel zeigt die Dichtespur für Linear Polyamide 4, das zur Zielgerichtetheit gegenüber AAG-Wiederholungen konzipiert wurde.Eine Analyse der Verteilung von Polyamiden in Zellen ergab, dass gruppierte Bindungsstellen, die einen weiten Affinitätsbereich abdecken, die Besetzung in Zellen am besten vorhersagen. Es wurde ein Algorithmus entwickelt, um das gesamte Genom hinsichtlich der Bindung anhand von in-vitro-Identifizierungsdaten für komplementäre Bindungsstellen zu bewerten. Diese Violin-Diagramme zeigen die vorhergesagten Bewertungen für die Bindung von Polyamid 2 und Polyamid 4 über das gesamte Genom hinweg.Repräsentative Genomlandschaften für Polyamid 4 sind ebenfalls dargestellt. Diese Bewertungsmethode zeigte, dass Loci mit mehreren niedrigen und mittleren Affinitätssequenzen eine ähnliche Polyamid-Besetzung aufweisen wie Loci mit wenigen hochaffinen Sequenzen. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von zwei Tagen abgeschlossen werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Proben bis zur Reinigung der DNA vor Licht zu schützen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die RT-PCR und die RNase C durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise bezüglich der Wirkung der Bindung auf die Genexpression. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man cosmic verwendet, um die genomweiten Bindungsprofile von Polyamiden abzubilden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Hallo-C-Methode ermöglicht unvoreingenommene, genomweite Identifizierung von Chromatin-Wechselwirkungen (1). Hallo-C Paare Ligationssysteme und massiv parallele Sequenzierung. Die resultierenden Daten können verwendet werden, um genomische Architektur auf mehreren Skalen zu studieren: die ersten Ergebnisse identifizierten Features wie Chromosom Gebiete, Segregation von offenen und geschlossenen Chromatin und Chromatin-Struktur an der Megabasen.

Hallo-C: eine Methode, um die dreidimensionale Architektur des Genoms Study.

Die damit verbundenen Chromosom Trap (ACT)-Assay ist ein neuartiges unvoreingenommene Verfahren zur Identifizierung von Langstrecken-DNA-Wechselwirkungen. Die Charakterisierung der Long Range DNA-Wechselwirkungen wird es uns ermöglichen, die Beziehung der nuklearen Architektur, um die Genexpression zu bestimmen, sowohl die normale Physiologie und in krankhaften Zuständen.

Assoziierte Chromosome-Trap zur Identifizierung weiträumige DNA-Wechselwirkungen

Wir beschreiben hier einen Test durch Kopplung DNA-Adenin-Methyltransferase-Identifikation (DAMiD), um Hochdurchsatz-Sequenzierung (DAMiD-seq). Dieses verbesserte Verfahren bietet eine höhere Auflösung und einen größeren Dynamikbereich und erlaubt die Analyse DAMiD-seq Daten in Verbindung mit anderen Hochdurchsatz-Sequenzierung Daten wie ChIP-seq, RNA-seq usw.

DAMiD-seq: Genomweite Mapping von Protein-DNA-Wechselwirkungen von Hochdurchsatz-Sequenzierung von Adenin-methylierten DNA-Fragmenten

Wir beschreiben die Chromatin-endogene Spaltung, gekoppelt mit der Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChEC-seq), einer Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) -orthogonalen Methode zur Kartierung von Proteinbindungsstellen genomweit mit Mikrokokken-Nuklease (MNase) -Fusionsproteinen.

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Eine einfache Fluoreszenz-Assay wird präsentiert, um die Effizienz von amino-Acyl-tRNA-synthestase/tRNA-Paaren, die Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) in Proteine in Säugetierzellen zu bewerten. Die Anwendung des NcAAs auf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) studieren wird beschrieben, einschließlich Foto-Vernetzung Zuordnung Websites und Bioorthogonal GPCR Kennzeichnung auf lebende Zellen zu binden.

Optimierung der genetischen Einbeziehung der chemischen Sonden in GPCRs für Foto-Vernetzung-Mapping und Bioorthogonal Chemie in Live Säugerzellen

Wir präsentieren ein Protokoll zur Identifizierung funktioneller Implikationen nicht-kodierender Varianten, die durch genomweite Assoziationsstudien (GWAS) anhand dreidimensionaler Chromatin-Wechselwirkungen identifiziert wurden.

Mapping Alzheimer-Krankheit Varianten zu ihren Zielgenen mit Hilfe der Berechnung der Chromatin-Konfiguration

Eine präzise Bestimmung von Proteinbindungsstellen im genomischen Ist wichtig für das Verständnis der Genregulation. Hier beschreiben wir eine genomische Kartierungsmethode, die chromatinimmunpräzipierte DNA mit Exonukleaseverdauung (ChIP-exo) behandelt, gefolgt von hochdurchsatzhoher Sequenzierung. Diese Methode erkennt Protein-DNA-Wechselwirkungen mit nahezu Base-Pair-Mapping-Auflösung und einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis in Säugetierneuronen.

Hochauflösende Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Mausstammzell-abgeleiteten Neuronen mit Chromatin-Immunpräzipitation-Exonuklease (ChIP-Exo)

Hi-C 3.0 ist ein verbessertes Hi-C-Protokoll, das Formaldehyd- und Disuccinimidylglutarat-Vernetzer mit einem Cocktail aus DpnII- und DdeI-Restriktionsenzymen kombiniert, um das Signal-Rausch-Verhältnis und die Auflösung der Chromatin-Interaktionsdetektion zu erhöhen.

Erfassung der Chromosomenkonformation über Längenskalen hinweg

Ein Protokoll zur Kartierung der dreidimensionalen Genomorganisation mit Nukleosomenauflösung unter Verwendung der genomweiten Chromosomenkonformationserfassungsmethode Micro-C-XL wird hier vorgestellt.

Kartierung von 3D-Genominteraktionen von Säugetieren mit Micro-C-XL

Wir stellen eine schnelle und effiziente Methode vor, um häufige Brüche an fragilen Stellen durch native γH2A.X-Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) zu detektieren. Dieser Ansatz reduziert sowohl den Zeit- als auch den Arbeitsaufwand, der mit herkömmlichen γH2A.X ChIP-Assays verbunden ist, erheblich und behält gleichzeitig eine hohe Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse bei.

Erfassung häufiger fragiler Stellenbrüche durch natives γH2A. X ChIP

Erfahren Sie, wie COSMIC die genomweite Kartierung von DNA-bindenden Molekülen ermöglicht. Diese Methode misst direkte Ligand-DNA-Wechselwirkungen und liefert Einblicke in Wirkmechanismen für die Arzneimittelentwicklung.

Genomweite Kartierung der Drug-DNA-Wechselwirkungen in Zellen mit COSMIC (Vernetzung von kleinen Molekülen, um Chromatin isolieren) (Video) | JoVE Journal

Genomweite Kartierung der Drug-DNA-Wechselwirkungen in Zellen mit COSMIC (Vernetzung von kleinen Molekülen, um Chromatin isolieren)

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