Genomweite Kartierung der Drug-DNA-Wechselwirkungen in Zellen mit COSMIC (Vernetzung von kleinen Molekülen, um Chromatin isolieren)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die genomweiten Bindungsprofile von Polyamiden und anderen DNA-spezifischen kleinen Molekülen in Zellen zu bestimmen. Diese Methode kann dazu beitragen, das Gebiet der DNA-Chemie von Arzneimitteln voranzubringen, indem sie das Genom verwendet, um das Design von DNA-Targeting-Molekülen zu steuern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass direkte Liganden-DNA-Wechselwirkungen gemessen werden, um einen Einblick in den Wirkmechanismus von Liganden zu erhalten, die auf das Genom wirken.

Einige der erfolgreichsten Therapeutika sind kleine Moleküle, die an die DNA binden und in genomische Transaktionen eingreifen. Obwohl diese Methode zur Untersuchung von Polyamiden entwickelt wurde, kann sie auch auf andere Klassen von DNA-Targeting-Molekülen angewendet werden. Die Zellen für dieses Experiment werden in E8 Media auf 10 cm großen Schalen gezüchtet, mit der Oberflächenbeschichtung, die pluripotente Stammzellen bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% Kohlendioxid trägt.

Entfernen Sie vor der Zugabe des Polyamids die verbrauchten Nährmedien und fügen Sie 8 ml frisches Medium pro 10-cm-Schale hinzu. Schützen Sie die Zellen ab diesem Zeitpunkt vor Licht, um eine vorzeitige Photovernetzung zu vermeiden. Geben Sie das Polyamid mit einer Pipette direkt in den Nährboden jeder Schale.

Schwenken Sie die Schale, um das Polyamid gleichmäßig im Medium zu verteilen. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid und stellen Sie sicher, dass sie vor Licht geschützt sind. Waschen Sie am nächsten Tag jede 10-cm-Schale mit 4 ml PBS mit einer serologischen Pipette und einem Pipettenspender.

Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie 3 ml E8-Nährmedien hinzu. Legen Sie die Zellen bei gedimmtem Licht auf eine ebene Fläche außerhalb der Haube und entfernen Sie die Deckel der fünf Kulturschalen. Platzieren Sie einen Glasfilter über den fünf Kulturschalen, um Licht mit einem Lambda von weniger als 300 Nanometern herauszufiltern.

Platzieren Sie die UV-Quelle auf dem Filter. Vernetzen Sie die Proben für 30 Minuten mit 365 Nanometern UVA-Strahlung. Übertragen Sie die Kulturschalen nach der UVA-Bestrahlung zurück in die Haube.

Aspirieren Sie das Medium mit einer Pasteurpipette, die an einer Vakuumfalle befestigt ist, und spülen Sie jede 10-cm-Schale mit 4 ml PBS. Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie 3 ml Enzym für die Zelldissoziation pro 10 cm Schale hinzu. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Das Enzym mit 3 ml E8-Medium pro Schale abschrecken. Übertragen Sie die dissoziierten Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Lege die Zellen ab diesem Zeitpunkt auf Eis.

Zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen bei 500 x g und 4 Grad Celsius für fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand, um das Enzym und das Medium zu entfernen. Um das Verfahren zur Chromatinisolierung zu beginnen, bereiten Sie den kosmischen Puffer mit frischen Proteaseinhibitoren vor.

Geben Sie je 12,1 Mikroliter 100 millimolare PMSF-, 100 millimolare Benzamidin- und 150 mikromolare Pepstatin-Proteasehemmer frisch in den basalen kosmischen Puffer. Geben Sie 1,2 ml des kosmischen Puffers zum Zellpellet und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um es wieder zu suspendieren. Teilen Sie dann die Zelllösung in zwei bernsteinfarbene 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf.

Beschallung mit einem Ultraschallgerät, um das Genom auf Größen zwischen 100 und 500 Basenpaaren zu fragmentieren. Halten Sie den Füllstand der Chromatinlösung im Mikrozentrifugenröhrchen parallel zum Wasserstand im Reservoir. Bestätigen Sie diesen Wert durch Sichtprüfung.

Die Beschallungszeit wurde imperativ optimiert und beschallt mit 60 % Leistung, 10 Sekunden an und 10 Sekunden aus für 35 Minuten. Verwenden Sie eine minimale Menge Eis im Reservoir, um die Proben zu kühlen, und stellen Sie sicher, dass das Eis nicht zwischen den Proben und dem Becherhorn interferiert. Wenn die Beschallung abgeschlossen ist, wird die Probe 10 Minuten lang bei 12 000 g zentrifugiert.

Bewahren Sie die wässrige Lösung, die lösliches Chromatin enthält, auf, indem Sie sie in ein neues bernsteinfarbenes Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Entsorgen Sie das Pellet. Übertragen Sie 110 Mikroliter oder 10 % der Probe in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.

Beschriften Sie es als Eingangs-DNA" und lagern Sie es bei 80 Grad Celsius. Bewahren Sie den Rest der Chromatinprobe auf Eis auf, um ihn in den nächsten Schritten dieses Protokolls zu verwenden. Um Liganden-DNA-Vernetzungen einzufangen, fügen Sie den Rest der Chromatinprobe zu den mit Streptavidin beschichteten magnetischen Kügelchen hinzu und suspendieren Sie das Gemisch erneut.

Inkubieren Sie das Chromatin mit den Kügelchen mindestens vier Stunden lang auf einem rotierenden Schaukelmischer bei 4 Grad Celsius. Der erforderliche Waschpuffer sollte vor der Verwendung in destilliertem, entionisiertem Wasser hergestellt und mit einem 0,2-Mikrometer-Filter filtriert werden. Puffer 1 und 2 können mehrere Monate bei 4 Grad Celsius gelagert werden, Puffer 3 muss jedoch jeden Tag frisch zubereitet werden.

Wenn die Inkubation des Chromatins mit den mit Streptavidin beschichteten magnetischen Kügelchen abgeschlossen ist, waschen Sie die Probe sieben Minuten lang mit Waschpuffer 1. Legen Sie die Probe in ein magnetisches Trenngestell, um die Kügelchen aufzufangen und den Waschpuffer 1 zu entfernen. Fügen Sie Waschpuffer 2 hinzu und waschen Sie weitere 7 Minuten lang.

Dann zweimal mit Waschpuffer 3 für sieben Minuten pro Waschgang waschen. Zum Schluss zweimal mit TE Buffer waschen. Nach dem letzten Waschen mit TE Buffer die Kügelchen wieder in 200 Mikroliter TE Buffer suspendieren.

Diese Probe der erbeuteten DNA wird als affinitätsgereinigte oder AP-DNA bezeichnet. Ergänzen Sie anschließend die Eingangs-DNA und die AP-DNA mit 10x Cross-Link-Umkehrpuffer bis zu einer Endkonzentration von 1x. 30 Minuten bei 90 Grad Celsius inkubieren.

Stellen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit der AP-DNA für zwei Minuten bei Raumtemperatur auf das magnetische Trenngestell und geben Sie dann die Flüssigkeit mit der AP-DNA in ein neues bernsteinfarbenes Mikrozentrifugenröhrchen. Nach der Neutralisierung der Eingangs- und AP-DNA geben Sie RNase A zu beiden DNA-Proben bis zu einer Endkonzentration von 0,2 Mikrogramm pro Mikroliter. Eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Nach einer Stunde fügen Sie Proteinase K sowohl der Eingangs-DNA als auch der AP-DNA bis zu einer Endkonzentration von 0,2 Mikrogramm pro Mikroliter hinzu. Eine Stunde lang bei 55 Grad Celsius inkubieren. Anschließend werden die Eingangs- und AP-DNA mit einem DNA-Säulenreinigungskit gereinigt und in Wasser in DNA-Qualität eluiert.

Lagern Sie die DNA bei 20 oder 80 Grad Celsius, bis sie für die Analyse bereit ist. Die affinitätsgereinigte DNA sollte immer gegen eine Referenz der Eingabe-DNA normalisiert werden. Repräsentative Ergebnisse aus der quantitativen PCR mit locusspezifischen Primern zeigen eine mehr als 100-fache Zunahme der Polyamidbelegung bei Bestrahlung mit 365 Nanometern Licht.

Angereicherte DNA kann auch durch Next Generation Sequencing analysiert werden. Nach der Sequenzierung werden die Roh-DNA-Lesevorgänge mit dem Genom abgeglichen und Dichtespuren vorbereitet. Dieses Beispiel zeigt die Dichtespur für Linear Polyamide 4, die für AAG-Wiederholungen entwickelt wurde.

Eine Analyse der Polyamidverteilungen in Zellen zeigte, dass geclusterte Bindungsstellen, die ein breites Spektrum von Affinitäten abdecken, die Belegung in Zellen am besten vorhersagen. Es wurde ein Algorithmus entwickelt, um das gesamte Genom für die Bindung mit In-vitro-Daten zur Identifizierung verwandter Stellen zu bewerten. Diese Violinplots zeigen die vorhergesagten Werte für die Bindung von Polyamid 2 und Polyamid 4 über das gesamte Genom.

Repräsentative Genomescapes für Polyamid 4 sind ebenfalls dargestellt. Diese Scoring-Methode zeigte, dass Loci mit mehreren Sequenzen mit niedriger und mittlerer Affinität eine ähnliche Polyamidbelegung aufweisen wie Loci mit wenigen Sequenzen mit hoher Affinität. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Tagen abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Proben vor Licht zu schützen, bis die DNA gereinigt ist. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie RT-PCR und RNase C durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie z.B. den Einfluss der Bindung auf die Genexpression zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit cosmic die genomweiten Bindungsprofile von Polyamiden abbilden können.