Synthese von thermogelierenden Poly (N-isopropylacrylamid) -Pfropf-Chondroitinsulfat Composites mit Alginate Mikroteilchen für Tissue Engineering

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, sowohl die adhäsiven Eigenschaften als auch die zelluläre Biokompatibilität des vorgeschlagenen Hydrogel-Komposits für das Bandscheibengewebe-Engineering des Nucleus pulposus zu bewerten. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich des Tissue Engineering zu beantworten, z. B. wie thermisch reversible Hydrogele mit bioadhäsiven Eigenschaften für die Zellverkapselung entworfen und hergestellt werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir in der Lage sind, In-vitro-Studien mit einem injizierbaren, thermisch empfindlichen Komposit zu demonstrieren, um seine Verwendung als potenzieller Ersatz für den Nucleus pulposus zu bewerten.

In der vorliegenden Studie evaluieren wir ein neuartiges Hydrogel-Gerüst, indem wir sowohl mechanische Zugtests als auch zelluläre Viabilitätstests durchführen. Die Biokompatibilitäts-Assays werden von Emily Schmidt, Mark Dittmer, Edward Goldschmidt und Frantzeska Giginis, Studenten aus den Fachbereichen Biowissenschaften und Biochemie, vorgeführt. Vor der Synthese des bioadhäsiven Hydrogels NIPAAm-Monomer und mCS aufreinigen, wie im Textprotokoll beschrieben.

Lösen Sie dann 10 Gramm gereinigtes NIPAAm und 2,209 Gramm mCS in 232 Millilitern entionisiertem Wasser auf. Reinigen Sie die Lösung von Sauerstoff mit inertem Stickstoffgas. Halten Sie einen kräftigen, aber niedrigen Gasdurchfluss aufrecht, um zu verhindern, dass die Lösung 15 Minuten lang übersprudelt.

Spülen Sie die Lösung weiter mit Stickstoffgas und fügen Sie 0,976 Milliliter TEMED hinzu. Als nächstes wird die Polymerisationsreaktion eingeleitet, indem 97,6 Milligramm Ammoniumpersulfat gemischt werden. Mischen Sie die Lösung etwa 20 Sekunden lang und verschließen Sie die Lösung schnell, um zu verhindern, dass Luft in das Gefäß eindringt.

Lassen Sie die Lösung 24 Stunden lang unter Fluoreszenzlicht polymerisieren, bevor Sie die Probe zu einem feinen Pulver verarbeiten, wie im Textprotokoll beschrieben. Stellen Sie eine Öl-Wasser-Mischung her, indem Sie 100 Milliliter Rapsöl, einen Milliliter TWEEN 20 und 20 Milliliter 2% Alginat kombinieren. Emulgieren Sie die Mischung 10 Minuten lang mit einem Homogenisator bei 15.000 U/min.

Mischen Sie zusätzlich mit einem magnetischen Rührstab bei 200 U/min, um große Mikropartikel zu erzeugen, oder mit 2.000 U/min, um kleine Mikropartikel zu erzeugen. Aspirieren Sie die 2%ige Calciumchloridlösung mit einer Spritze mit einer 18-Gauge-Nadelspitze. Geben Sie das Calciumchlorid langsam tropfenweise in die Emulsion.

Nachdem Sie die Mikropartikel 10 Minuten lang vernetzen gelassen haben, verteilen Sie die Charge der Mikropartikel gleichmäßig in verschlossene konische 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie zwei Minuten lang bei 1.400 mal G, um die erste Schicht Rapsöl zu entfernen, bevor Sie die Mikropartikel waschen und lyophilisieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie das resultierende gefriergetrocknete Polymerpulver, um eine PNIPPAm-Transplantat-CS-Lösung mit einem Volumen von 5 % herzustellen, indem Sie zuerst 50 Milligramm Hydrogelpulver in einem Milliliter 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS auflösen.

Mischen Sie die Lösung mit einem Vortexer, bevor Sie sie 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius im Kühlschrank abkühlen. Sobald sich die viskose Lösung gebildet hat, stellen Sie ein homogenes Komposit her, indem Sie der Hydrogellösung 25 oder 50 Milligramm gefriergetrocknete Alginat-Mikropartikel hinzufügen und vortexen. Lagern Sie das Komposit für die spätere Verwendung bei vier Grad Celsius im Kühlschrank.

Vor der Durchführung von Zugversuchen ist das Knorpelsubstrat aus einem Schweineohr zu extrahieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Befestigen Sie dann das Kraftmessgerät am Arm des Prüfstands. Stellen Sie eine Kochplatte auf den Kraftständer und stellen Sie die Temperatur auf 50 Grad Celsius ein.

Befestigen Sie dann ein Zentimeter mal einen Zentimeter großes Stück Knorpel mit Cyanacrylatkleber und einer Pinzette auf dem Edelstahlblock. Kleben Sie ein zusätzliches Stück Knorpel auf den Delrin-Zylinder und befestigen Sie den Zylinder am Kraftmessgerät. Es ist sehr wichtig, dass beide Knorpeloberflächen einander zugewandt sind und das Hydrogel berühren.

Stellen Sie das Plexiglas-Wasserbad auf die Kochplatte und setzen Sie den Edelstahlblock mit dem Knorpelsubstrat in die Badewanne ein. Senken Sie den Arm des Prüfstandes ab und richten Sie beide Knorpelsubstrate zueinander aus. Heben Sie dann den Arm an und lassen Sie genügend Platz, um das Hydrogel aufzutragen.

Geben Sie mit einer Verdrängerpipette 200 Mikroliter des bioadhäsiven Hydrogels in das untere Knorpelstück. Senken Sie den Arm des Kraftstandes bei einem Milliliter pro Minute ab, bis das Hydrogel das obere Knorpelstück berührt und eine Vorspannkraft von 0,001 Newton ausübt. Gießen Sie die 37 Grad Celsius heiße Kochsalzlösung in das Bad, bis das Volumen den vorgesehenen Wasserstand erreicht.

Überprüfen Sie die Temperatur der Lösung mit einem Thermoelement. Nachdem Sie das Hydrogel insgesamt fünf Minuten lang aushärten gelassen haben, heben Sie den Arm mit einer Geschwindigkeit von zwei Millimetern pro Minute an. Der Test ist abgeschlossen, sobald sich der Bioklebstoff vom Knorpelsubstrat löst oder wenn ein signifikanter Kraftabfall auftritt, der ein Versagen signalisiert.

Sammeln Sie die aufgezeichneten Daten und heben Sie den Arm des Prüfstandes an. Entfernen Sie den Delrin-Zylinder vom Kraftmessgerät. Gießen Sie die Kochsalzlösung in den vorherigen Behälter und erhitzen Sie sie erneut auf 37 Grad Celsius.

Berechnen Sie die Spannungen, wie im Textprotokoll beschrieben. Bevor Sie den Lebend/Tot-Assay mit PNIPAAm graft CS durchführen, bereiten Sie die menschliche embryonale Niere oder HEK 293-Zellen vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Erstellen Sie Positivkontroll-Monolayer, indem Sie mehrere 300-Mikroliter-Volumina der Zellmischung in eine 24-Well-Platte pipettieren, um vier bis sechs Replikatproben zu erzeugen.

Halten Sie die gleiche Zellkonzentration aufrecht, indem Sie die Zellen für jede Replikatprobe in etwa zwei Millilitern PNIPAAm Transplantat CS erneut suspendieren. Pipettieren Sie die Polymerzellmischung mit einer serologischen Pipette auf und ab, bis sie homogen ist. Wenn Sie mit Alginat-Mikropartikeln besiedeln, geben Sie zwei Milliliter der PNIPAAm transplantierten CS-Zellsuspension in eine 35-Millimeter-Kulturschale und geben Sie 200 Milligramm Partikel in die Mischung.

Pipettieren Sie die Zellmischung mit einer serologischen Pipette auf und ab, bis sie homogen ist. Geben Sie dann mit einer serologischen Pipette mehrere 300-Mikroliter-Volumina der Polymerzellmischung in jede der Vertiefungen für die abgetötete Kontrolle, PNIPAAm Graft CS und PNIPAAm Graft CS mit Alginat-Mikropartikeln, um vier bis sechs Replikatproben zu erzeugen. Inkubieren Sie die Platte 10 bis 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und lassen Sie das PNIPAAm-Transplantat CS von einer Flüssigkeit in ein Gel übergehen.

Das Polymer bildet eine undurchsichtige weiße Scheibe. Positionieren Sie einen Diawärmer in der Haube und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein. Verwenden Sie den Objektträgerwärmer, um die Temperatur der Well-Platte aufrechtzuerhalten, und pipettieren Sie 600 Mikroliter vorgewärmtes Medium in jede Well.

Um den Übergang des Polymers in einen flüssigen Zustand weiter zu verhindern, positionieren Sie eine Lampe mit einer Leuchtstofflampe über der Schale, um die Luft darüber zu erwärmen. Inkubieren Sie die Zellen fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Entfernen Sie nach Ablauf von fünf Tagen das Medium aus den Vertiefungen der Monoschicht, PNIPAAm graft CS und PNIPAAm graft CS mit Alginat-Mikropartikeln.

Waschen Sie alle Vertiefungen gründlich, aber vorsichtig mit PBS und entfernen Sie dann das PBS. Lassen Sie die Hydrogelscheiben mit Alginat-Mikropartikeln bei Raumtemperatur verflüssigen und geben Sie zwei Milliliter 50 Millimolar Natriumcitrat in jede der Vertiefungen. Entfernen Sie das Medium aus den abgetöteten Zellvertiefungen.

Lassen Sie die Hydrogel-Scheiben bei Raumtemperatur verflüssigen und geben Sie 300 Mikroliter 70%Methanol in jede Vertiefung, bevor Sie die Platte 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Entfernen Sie die Natriumcitrat- und Methanollösungen aus den Vertiefungen und pipettieren Sie jede der Hydrogelsuspensionen in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 2.000 mal G, um die Zellen von der Hydrogelsuspension zu trennen.

Entfernen Sie vorsichtig die Suspension, indem Sie die Lösung aus dem konischen Röhrchen pipettieren und das Küvettenpellet zurücklassen. Suspendieren Sie das Pellet erneut in 300 Mikrolitern PBS und geben Sie es in die ursprüngliche Well-Platte. Geben Sie als Nächstes 300 Mikroliter der Lebend/Tot-Farbstoffmischung in jede der Vertiefungen.

Wickeln Sie die Well-Platte in Aluminiumfolie ein und inkubieren Sie sie 45 Minuten lang auf einer Wippe bei Raumtemperatur, bevor Sie alle Proben unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop mit einem 10-fachen Objektiv abbilden. Repräsentative Zugfestigkeitsergebnisse sowohl für PNIPAAm graft CS als auch für PNIPAAm graft CS mit unterschiedlichen Alginat-Mikropartikelformulierungen sind hier dargestellt. Die Zugfestigkeit von PNIPAAm graft CS vervierfachte sich durch die Zugabe von 50 oder 75 Milligramm Alginat-Mikropartikeln pro Milliliter.

Wie erwartet zieht sich das PNIPAAm-Transplantat-CS zusammen und schrumpft im Volumen über seine niedrigere kritische Lösungstemperatur. Das Einbringen von Mikropartikeln in das Hydrogel verleiht PBS über einen Zeitraum von sieben Tagen einen Quelleffekt. HEK 293-Zellen, die sowohl in PNIPAAm graft CS als auch in PNIPAAm graft CS mit Alginat-Mikropartikeln verkapselt waren, zeigten nach einem Zeitraum von fünf Tagen eine aktive zelluläre Fluoreszenz mit Lebend/Tot-Farbstoff

Diese Ergebnisse können mit den positiven und negativen Kontrollwellen verglichen werden. Parallel dazu wurde ein quantitativer Assay verwendet, um die Lebend/Tot-Bildgebung zu bestätigen, die keine signifikanten Unterschiede in der zellulären Lebensfähigkeit zwischen PNIPAAm graft CS, PNIPAAm graft CS mit Alginat-Mikropartikeln und der Kontrollmonoschicht zeigte. Für den Ersatz des Nucleus pulposus wurde ein Hydrogel-Komposit aus thermisch empfindlichem Poly(N-isopropylacrylamid) hergestellt, das mit Chondroitinsulfat und Alginat-Mikropartikeln gepfropft wurde.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass das Komposit temperaturempfindlich ist und sich unterhalb seiner niedrigeren kritischen Lösungstemperatur verflüssigt. Einmal gemeistert, können mechanische Zugversuche problemlos durchgeführt werden, solange sorgfältige Präzision praktiziert wird. Quellstudien zeigen die Fähigkeit eines Hydrogels, Wasser zu speichern.

Diese Tests müssen jedoch die native In-vivo-Umgebung nachahmen. Die zelluläre Lebensfähigkeit der thermisch empfindlichen Gele kann durch eine Kombination aus fluoreszenzmarkierenden und metabolisch produzierenden Reagenzien bestätigt und beurteilt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie thermisch empfindliche Injektionen in Bandscheiben und im Tissue Engineering angewendet werden und wie Komposite bestimmte Materialeigenschaften verbessern können.