Präklinische Orthotopische Mausmodell der menschlichen Prostata-Krebs

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Etablierung eines orthotopen Xenotransplantatmodells für Prostatakrebs der Maus, das einen nützlichen Ansatz zur Untersuchung der molekularen Ereignisse der Primärtumorentwicklung in den frühen Ereignissen der metastasierenden Kaskade bietet. Dieses Modell kann dazu beitragen, Schlüsselfragen zu den spastischen Wechselwirkungen zwischen genetisch und molekular veränderten Tumorzellen in der Mikroumgebung des wachsenden Tumors zu beantworten. Es kann auch bei der präklinischen Bewertung neuer Therapieansätze gegen den menschlichen Prostatakrebs helfen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber den spontanen Metastasierungsmodellen besteht darin, dass sie die Untersuchung der molekularen Ereignisse der Primärtumorentwicklung und auch die Rekapitulation der Anfangsphase der Metastasierung vor dem Eintritt und der Embolie der Tumorzellen in den Blutkreislauf fördert. Das orthotope Modell des Prostatakrebses ist eines der besten präklinischen Modelle, um zu verstehen, wie Prostatakrebszellen in verschiedene Organe metastasieren. Die meisten Prostatakrebspatienten sterben an Metastasen, daher ist dieses Modell sehr wichtig, um die molekularen Mechanismen der Metastasierung zu untersuchen.

Mit diesem Modell können wir bessere Strategien für die Behandlung von Metastasen entwickeln, indem wir neuronale Verbindungen verwenden, die spezifisch für Metastasen sind. Dieses Verfahren wird von Melissa Colden, einer Doktorandin, und Dr. Varahram Shahryari, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter unseres Labors, demonstriert. Waschen Sie vor Beginn des Eingriffs die gewünschte Tumorzellkultur mit PBS und inkubieren Sie die Zellen mit 2 Millilitern 05 Prozent Trypsin für 3 bis 5 Minuten im Zellkultur-Inkubator.

Wenn sich die Zellen abgelöst haben, stoppen Sie die Reaktion mit 5 Millilitern vollständigem Medium und zählen Sie die Zellen durch Trypanblau-Ausschluss. Verdünnen Sie die Zellen auf 2,5 mal 10 bis 5 Zellen pro 10 Mikroliter mittlerer Konzentration und mischen Sie die Zellsuspension mit 10 Mikrolitern Basalmembran-ähnlichem extrazellulärem Matrixextrakt. Halten Sie die Zellen auf Eis, legen Sie dann eine betäubte, sechs bis acht Wochen alte immungeschwächte männliche Versuchsmaus in Rückenlage auf ein steriles Heizkissen und bestätigen Sie, dass es keine Reaktion auf das Einklemmen der Zehen gibt.

Tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf und entfernen Sie die Haare vom Unterbauch. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit 10 Prozent Povidon-Jod-Peeling, gefolgt von 70 Prozent Ethanol etwa 1 bis 2 Zentimeter über der Penishülle und etwa 2 bis 3 Zentimeter unterhalb der Unterseite des Brustkorbs. Heben Sie mit einer feinen Pinzette 2 Millimeter Haut über die Präputialdrüse.

Machen Sie mit einem Skalpell einen 1 Zentimeter langen Schnitt in der Mittellinie durch die Haut, gefolgt von einem 1 Zentimeter langen Schnitt durch die Muskelschicht. Lokalisiere die gelbe, hellbraune Kugelblase direkt unter dem Schnitt. Greifen Sie dann mit der feinen Pinzette die Blase und heben Sie das Organ nach oben und aus der Körperhöhle in Richtung Penisscheide, um die Samenbläschen freizulegen.

Schieben Sie mit einem feuchten Wattestäbchen in jeder Hand die Vesikel vorsichtig nacheinander nach außen und legen Sie sie mit der Blase in der Mitte von oben nach unten auf die Außenfläche des Bauches. Anschließend kippen Sie mit den Wattestäbchen die Samenbläschen an der Einstichstelle in der Nähe des Blasenhalses vorsichtig in Richtung Penisscheide zurück, so dass die beiden dorsalen Prostatalappen deutlich sichtbar sind. Verwenden Sie nun eine Mikropipette, um die Zellen in einer Einzelzellsuspension wieder zu suspendieren und mit Luciferin zu markieren.

Aspirieren Sie 25 Mikroliter der Zellen in eine 0,5-cm³-Spritze, die mit einer 28,5-Gauge-Nadel ausgestattet ist, und übertragen Sie die Maus unter ein Präpariermikroskop. Führen Sie dann die Spritzennadel in einen dorsalen Prostatalappen ein und injizieren Sie langsam 20 Mikroliter der Zellsuspension, bis eine Bullabildung beobachtet wird. Wenn alle Zellen verabreicht wurden, ziehen Sie die Nadel zurück und drücken Sie einige Sekunden lang mit einem Wattestäbchen leicht auf die Injektionsstelle, um ein Auslaufen zu verhindern.

Verwenden Sie dann die Tupfer, um die Vesikel vorsichtig nacheinander in die Körperhöhle zurückzubringen, gefolgt von der Blase. Nachdem Sie die Organe wieder in die Körperhöhle eingesetzt haben, nähen Sie die Muskelschicht zuerst in einem unterbrochenen Muster mit resorbierbaren 4-0 Chrom-Katzendarmnähten, gefolgt von dem Hautverschluss mit nicht resorbierbaren chirurgischen 4-0-Nylonnähten. Die Haut kann auch zusammengezogen und mit chirurgischen Klammern verschlossen werden, um den Schnitt vollständig zu schließen.

Bilden Sie dann sofort ein Bild des Tieres ab und setzen Sie die Maus in einen sauberen Käfig unter einer Wärmelampe mit Überwachung, bis sie vollständig geborgen ist. Nach der soeben gezeigten orthotopen Implantation von Luciferin-markierten Prostatakrebszellen in den hinteren Prostatalappen zeigt die wöchentliche Bildgebung mittels Biolumineszenz-Bildgebung bei lebenden Tieren eine erfolgreiche Besiedlung der Prostatalappen durch die Tumorzellen. In der Tat ist eine Zunahme der Biolumineszenz im Laufe der Zeit ein Hinweis auf die Vergrößerung des Primärtumors im Verlauf des Experiments, was die Wirksamkeit dieser Technik in der nicht-invasiven, röntgenlogischen, fluoreszierenden oder lumineszierenden Bildgebung für das Tumorwachstum und die Überwachung metastasierender Läsionen bestätigt.

Bei diesem Eingriff ist zu beachten, dass bei der intraprostatischen Injektion eine offene Bauchoperation erforderlich ist. Daher sollte sie in einer pathogenfreien Umgebung mit geeigneten aseptischen chirurgischen Techniken durchgeführt werden. Die Arbeit mit menschlichen Krebszellen kann äußerst gefährlich sein, und Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung und das Arbeiten innerhalb der Biosicherheitsstufe zwei, sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.

Dieses Modell ebnete den Weg für die Transplantation histologisch intakter Tumorfragmente, um die Auswirkungen potenzieller medikamentöser Therapien auf das Tumorwachstum oder die ursprüngliche Lymphknotenmetastasierung zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Krebszellen in die dorsalen Prostatalappen implantiert werden, um ein orthotopes Xenotransplantat-Mausmodell für den menschlichen Prostatakrebs zu etablieren.