Synthese von Protein Biokonjugate über Cystein-maleimid Chemie

Das übergeordnete Ziel der Synthese von Protein-Biokonjugaten mittels Cystein-Maleimid-Chemie besteht darin, die Spezifität an der Modifikationsstelle des Proteins sicherzustellen. Dies wiederum wirkt sich auf die Aktivität des resultierenden Biokonjugats aus, beispielsweise Antikörper-Wirkstoff-Konjugate. Wenn Sie sich für die Struktur oder Funktion von Proteinen interessieren und in der Nanomedizin, Fluoreszenzmikroskopie oder Systemchemie forschen, dann hilft Ihnen diese Technik bei der Beantwortung Ihrer Fragen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie hochspezifisch und unter mehr Bedingungen ertragreich ist. Um dieses Verfahren zu beginnen, lösen Sie 12 Milligramm lyophilisiertes Cytochrom C in sechs Millilitern 20 Millimolar Phosphatpuffer. Pipettieren Sie 16 Mikroliter frisch zubereiteter einmolare DTT-Lösung in die Proteinlösung, um den Cytochrom-C-Gehalt zu reduzieren. Nach dem Mischen der Lösung filtrieren Sie sie durch einen 0,22-Mikron-PBDF-Spritzenvorsatzfilter mit geringer Proteinbindung, bevor Sie sie auf ein chromatographisches Medium injizieren.

Anschließend wird die reduzierte rohe Cytochrom-C-Lösung durch schnelle Protein-Flüssigchromotographie oder FPLC gereinigt. Nachdem Sie eine starke kationische seltsame Säule äquilibriert haben, laden Sie einen Milliliter der Lösung in die Injektionsschleife des Geräts. Als nächstes starten Sie eine Gradientenmethode von 328 für 450 millimolares Natriumchlorid über fünf Säulenvolumina.

Überwachen Sie die 280- und 410-Nanometer-Kanäle des UV-Detektors und erfassen Sie den größten Peak. Erhöhen Sie nun die Salzkonzentration auf ein Molar für zwei Säulenvolumen, um ISO2-Cytochrom C zu plündern. Nachdem die Säule gespült wurde, stellen Sie das Gleichgewicht mit zwei Säulenvolumina mit 20 millimolarem Phosphatpuffer wieder her, bevor Sie das nächste rohe Aliquot injizieren. Lösen Sie zu diesem Zeitpunkt 0,9 Milligramm des entsprechenden Rutheniummaleimid-Komplexes in 600 Mikrolitern Acetonitril.

Bereiten Sie eine 10 Millimolare TCEP-Lösung vor, indem Sie 2,87 Milligramm TCEP in einem Milliliter Reinstwasser auflösen. Mischen Sie 11,4 Milliliter Reinstwasser, drei Milliliter einer 100 Millimolare Phosphat-EDTA-Stammlösung in ein 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen. Geben Sie dann 0,15 Mikromol gereinigtes Cytochrom C in die Phosphat-EDTA-Lösung.

Geben Sie 7,5 Mikroliter der TCEP-Stammlösung zur Proteinlösung. Und lassen Sie es fünf Minuten lang rühren, um das Protein zu reduzieren, das möglicherweise aufgrund der Cysteinoxidation dimerisiert wurde. Geben Sie anschließend 600 Mikroliter der Rutheniummaleimid-Komplexlösung in die reduzierte gepufferte Cytochrom-C-Lösung und lassen Sie das Reaktionsgemisch 24 Stunden lang im Dunkeln bei Raumtemperatur rühren.

Die Reihenfolge der Addition ist von größter Bedeutung. Es ist wichtig, zuerst das Protein hinzuzufügen, dann das Reduktionsmittel und zuletzt Maliemid. Am folgenden Tag wird das Reaktionsgemisch durch Zentrifugation mit einem 3,5 Kilodalton Molekulargewichts-Cutoff-Spin-Filter konzentriert.

Die Zentrifugation wird zwei- bis dreimal mit frischem 20 millimolaren Phosphatpuffer wiederholt, bis das Filtrat klar ist. Für die Reinigung auf Nickelbasis waschen Sie eine Milliliter mobilisierte Metallaffinitätschromatographiesäule mit drei Millilitern Reinstwasser, drei Millilitern 100 Millimolar Nickelacetatlösung und sechs Millilitern Reinstwasser. Befestigen Sie anschließend die mit Nickel beladene Säule an der FPLC zwischen der Injektionsschleife und dem UV-Viz-Detektor.

Dann äquilibrieren Sie die Säule mit drei Säulenvolumina von 20 Millimolar Phosphat und 0,5 molar Natriumchloridpuffer bei einer Flussrate von 0,5 Millilitern pro Minute. Nach dem Filtrieren durch einen 0,22-Mikron-Spritzenvorsatzfilter werden 100 Mikroliter des rohen Reaktionsgemisches in die Injektionsschleife des Instruments geladen. Waschen Sie die Säule mit drei Säulenvolumina Puffer, um das nicht umgesetzte Cytochrom C zu eluieren. Eluieren Sie dann das Cytochrom C-Biokonjugat mit einem Imidazolgradienten von null bis 125 Millimolar über drei Säulenvolumina.

Sobald das Cytochrom-C-Biokonjugat aus der Säule eluiert ist, waschen Sie es mit 250 millimolaren Imidazol-Puffern für fünf Säulenvolumina. Dann wird die Säule mit 20 Millimolar Phosphat 0,5 molar Natriumchlorid Puffer wieder ins Gleichgewicht gebracht. Ziehen Sie als nächstes die biokonjugierten Fraktionen.

Und konzentrieren Sie durch Zentrifugation mit einem 3,5-Kilodalton-Molekulargewichts-Spin-off-Filter. Nach der Zentrifugation das konzentrierte Biokonjugat in 3,5 Kilodalton Molekulargewicht füllen, Dialysekassetten abschneiden und über Nacht gegen Reinstwasser dialysieren. Am Folgetag wird die Konzentration der reinen konzentrierten Biokonjugatlösung mittels UV-Vis-Spektroskopie bestimmt.

Unter Verwendung des gleichen molaren Absorptionswerts wie ISO1 Cytochrom C bei 410 Nanometern. Lagern Sie das restliche Biokonjugat als 25-Mikroliter-Aliquot bei minus 20 Grad Celsius. Für die Gelelektrophorese bereiten Sie 10 Mikroliter jeder Proteinprobe vor, indem Sie das Biokonjugat mit vorgemischtem Lithiumdodecylsulfatpuffer auf eine Endkonzentration von etwa 20 Mikrogramm pro Vertiefung verdünnen.

Anschließend erhitzen Sie die Proben 10 Minuten lang auf 70 Grad Celsius. Nachdem Sie die Proben auf Raumtemperatur abkühlen gelassen haben, laden Sie sie vorsichtig auf ein vorgegossenes 12%bis Tris-Gel mit einem Millimeter 10-Well-Gel, wobei Sie lange Pipettenspitzen verwenden, um das Laden zu erleichtern. Laden Sie einen vorgefärbten Molekulargewichtsmarker mit 10 Proteinen in eine mittlere Vertiefung des Gels, um die Analyse zu erleichtern.

Lassen Sie das Gel nun 35 Minuten lang bei 200 Volt laufen. Sobald der Lauf abgeschlossen ist, färben Sie das Gel zwei Stunden lang mit einer handelsüblichen Coomassie-Blau-Lösung. Waschen Sie das Gel nach dem Entfernen der Coomassie Blue-Lösung 48 Stunden lang mit ultrareinem Wasser.

Eine Massenzunahme in Abwesenheit von nicht umgesetztem Protein im Multi-tof-Massenspektrum des Cytochrom-C-Biokonjugats zeigte die erfolgreiche äquivalente Bindung des Rutheniummaleimid-Komplexes an Cytochrom C und die anschließende Reinigung des Biokonjugats. Die Ausbeute des Cytochrom-C-Biokonjugats liegt in der Regel zwischen 15 und 27 % und kann aus dem UV-Vis-Spektrum berechnet werden. Das Biokonjugat besteht aus einer Eins-zu-Eins-Bindung des Maleimids an das Protein.

Dies wird durch den Vergleich des Spektrums des Biokonjugats mit einem vorhergesagten Eins-zu-Eins-Additionsspektrum der Ausgangsmaterialien abgeleitet. Darüber hinaus bestätigt das Auftreten eines neuen Peaks im Chromatogramm während der Reinigung die Synthese einer neuen Spezies. Einmal gemeistert, kann dieses Verfahren in drei Tagen durchgeführt werden, wenn es richtig durchgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, Ihre Proteinlösungen sorgfältig mit Handschuhen zu behandeln, um eine Proteineinführung in Ihre Proben zu verhindern. Dieses Verfahren kann für die Konjugation anderer Maleimide an Cystein-haltige Proteine verwendet werden. Um zusätzliche Fragen zu beantworten, z.B. ob sich das Membranprotein in einer lebenden Protozoenmembran befindet.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Biomolekularbiologie, um mehr über die Funktion und Lokalisierung von Proteinen in viscalbasierten Einschränkungen zu erfahren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Cystein-Maleimid-Chemie nutzen können, um Biomakromoleküle in hohen Ausbeuten zu markieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Forschungschemikalien mit unbekannten Eigenschaften äußerst gefährlich sein kann.

Und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens geeignete Vorsichtsmaßnahmen wie PSA getroffen werden sollten.