Untersuchung der Rolle von Alveolarmakrophagen in Metastasierung von Brustkrebs

Hier beschreiben wir das Modell und den Ansatz zur Untersuchung der Funktionen von Lungenalveolarmakrophagen bei der Metastasierung von Krebs. Um die Rolle dieser Zellen bei der Metastasierung zu demonstrieren, wurde das syngene (4T1) Modell des Brustkrebses in Verbindung mit der Depletion von Alveolarmakrophagen mit Clodronat-Liposomen verwendet.

Das übergeordnete Ziel dieser Experimente ist es, die Rolle der pulmonalen Alveolarmakrophagen bei der Krebsmetastasierung unter Verwendung eines syngenaischen Modells von Brustkrebs zu bestimmen. Diese Methode kann einige der Schlüsselfragen in der Tumorimmunologie und in der Krebsmetastasierung beantworten, z. B. warum die Lunge eines der häufigsten Ziele für hepathogene Krebsmetastasen ist. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie ein sehr gut etabliertes Brustkrebsmodell mit einer sehr spezifischen Methode der pulmioären Alveolarmikrophagen verwendet.

Dieses Verfahren wird von Surya Kumari Vadrevu, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter in meinem Labor, demonstriert. Am Tag der Tumorzellinjektion legen Sie zunächst eine rasierte, betäubte Maus auf eine chirurgische Unterlage. Als nächstes aspirieren Sie einmal 10 bis die fünfte Tumorzelle in 100 Mikrolitern PBS in eine Nullkomma-Fünf-Milliliter-Insulinspritze, die mit einer 29-Gauge-Nadel ausgestattet ist.

Heben Sie dann mit Daumen und Zeigefinger die Haut in der Nähe der zweiten und dritten Brustwarze an und führen Sie die Nadel unter der Haut in das Brustfettpolster direkt unter der dritten Brustwarze ein. Injizieren Sie die Zellen langsam subkutan, um eine Blase unter der Haut zu bilden, und bringen Sie das Tier unter Überwachung in seinen Käfig zurück, bis es sich vollständig erholt hat. Vier bis fünf Tage nach der Inokulation tasten Sie zur Messung der Tumore die Tumorstelle ab und verwenden Sie einen Messschieber, um sowohl den größten als auch den kleinsten Durchmesser der Tumoren zur Bestimmung des Tumorvolumens zu verwenden.

Um die injizierten 41GFP-Zellen abzubilden, platzieren Sie die anästhesierte Maus auf einem beweglichen Tisch im Imager und bilden Sie die Tumorstelle durch Fluoreszenzmikroskopie ab. In einer Laminer-Biosicherheitswerkbank mit Luftstrom werden die Liposomen sechs Tage nach der Injektion der Tumorzellen verwirbelt, um die Partikel gleichmäßig zu verteilen, und 60 Mikroliter der Suspension in eine sterile Pipettenspitze aspiriert. Platzieren Sie die Spitze in der Nähe des Nasenlochs des anästhesierten, tumorgeimpften Tieres und geben Sie langsam fünf Mikroliter der Liposomenlösung ab, damit die Maus den Tropfen einatmen kann.

Es ist wichtig, die Liposomenlösung langsam zu verabreichen und dabei das angemessene Anästhesieniveau beizubehalten, damit das Tier während der Entbindung regelmäßig atmen kann. Wenn die gesamten 60 Mikroliter verabreicht wurden, lassen Sie die Maus sich vollständig erholen und bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück. Um die Metastasen der Lungenoberfläche zu zählen und zu bewerten, legen Sie die Lunge unter das Dissektionsmikroskop und fokussieren Sie das Objektiv, bis eine klare Sicht auf die Lungenoberfläche erhalten ist.

Zählen Sie dann manuell die Metastesen auf der vorderen und hinteren Seite beider Lungen und bilden Sie die Tumoren durch Fluoreszenzmikroskopie ab. Nach dem Zählen und Darstellen der Metastasen wird die Lunge mit einer chirurgischen Schere und einer Pinzette zerkleinert und die Gewebestücke in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit drei Millilitern Verdauungspuffer überführt. Testen Sie die Fragmente 40 Minuten lang auf einem rotierenden Schüttler in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator und zerkleinern Sie dann die Aufschlämmung, um das Gewebe zu dissoziieren.

Filtrieren Sie anschließend die Gewebesuspension durch ein 40-Mikron-Sieb, um Klumpen zu entfernen, und drücken Sie die größeren Stücke bei Bedarf mit einem Spritzenkolben durch das Sieb. Wenn eine einzellige Suspension erreicht wurde, werden die Zellen durch Zentrifugation entnommen und die roten Blutkörperchen mit ACK-Puffer 10 Minuten lang bei Raumtemperatur lysiert. Waschen Sie das Pellet dann zweimal in acht Millilitern RPMI.

Nach der zweiten Zentrifugation suspendieren wir die Zellen in drei Millilitern vollständigem RPMI-Medium zur Zählung und schleudern die Zellen wieder herunter. Verdünnen Sie nun die Zellen auf eins mal 10 bis sechste Zellen pro 100 Mikroliter FAX-Pufferkonzentration und übertragen Sie 100 Mikroliter Eloquote von Zellen in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit V-Boden. Sammeln Sie die Zellen am Boden der Vertiefungen durch Zentrifugation und drehen Sie dann die Platte um, damit der Puffer abfließen kann.

Blockieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern CD16 CD32 FC, blockieren Sie sie für 15 Minuten bei vier Grad Celsius und zentrifieren Sie die Platte erneut. Drehen Sie dann die Platte um, um den Überstand zu entfernen, wie gerade gezeigt, und geben Sie den gewünschten Antikörpercocktail in die entsprechenden Vertiefungen. Nach 30 Minuten bei vier Grad Celsius pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation, gefolgt von einer Wäsche mit 200 Mikrolitern FAX-Puffer.

Suspendieren Sie dann die Pellets erneut in 200 Mikrolitern frischem PBS und färben Sie die Proben 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit Viabilitätsfarbstoff. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation in weiteren 200 Mikrolitern PBS und fixieren Sie die Proben in 100 Mikrolitern mit einem Prozent Paraformaldehyd für die Lagerung bei vier Grad Celsius. Unmittelbar vor der Analyse werden die Zellsuspensionen in Polypropylen-Durchflusszytometrieröhrchen überführt.

Die Injektion von 4T1GFP-Tumorzellen in das Brustfettpolster führt zur Bildung von Maustumoren, die die metastasierende Ausbreitung von menschlichem Brustkrebs rekapitulieren, wie die sich schnell bildenden Metastasen in der Lunge zeigen. Die stabile Transfektion von 4T1-Zellen mit GFP ermöglicht die Verfolgung metastasierender Tumorzellen und die Quantifizierung der Metastasierungslast. Auch die routinemäßige Hastologie in Verbindung mit digitalen Pathologiealgorithmen stellt ein gutes Werkzeug zur Quantifizierung und Verifizierung von Metastasen dar.

Darüber hinaus ermöglicht die kykometrische Mehrfarbenflussanalyse die Charakterisierung auch seltener Zellpopulationen, wie z.B. CD11b-negative, CD11c F80-positive Alveolarmakrophagen. Die Depletion von Bicloternat kann durch das Fehlen dieser CD11c F480-positiven Zellen in den dissoziierten Lungen von mit Lyposomen behandelten Tieren bestätigt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Tumorzellen in das Brustfettpolster injiziert, das Tumorwachstum und die Metastasierung überwacht, Alveolarmakrophagen erschöpft und Lungenzellen für die zytokometrische Durchflussanalyse vorbereitet.