Spiralganglion Neuron Explantation Kultur und Elektrophysiologie auf Multi-Elektroden-Arrays

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu demonstrieren, wie die elektrophysiologische Aktivität von auditorischen Neuronen auf Multi-Elektroden-Arrays kultiviert und aufgezeichnet werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Hörforschung zu beantworten, wie z.B. die Charakterisierung der elektrophysiologischen Eigenschaften von Hörneuronen und der Stimulation durch die Elektrodenbereiche. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine extrazelluläre nicht-invasive gleichzeitige Aufzeichnung der neuronalen Aktivität einer großen Anzahl von auditorischen Neuronen ermöglicht.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie. Tatsächlich könnten sie verwendet werden, um die Elektroneuronenschnittstelle Ihrer Prothesen wie das Cochlea-Implantat zu implementieren, um das Gehör bei gehörlosen Patienten wiederherzustellen. Um diesen Vorgang zu starten, bereiten Sie die ECM-Beschichtungslösung vor, indem Sie zuerst die ECM-Mischung auf Eis auftauen.

Verdünnen Sie dann die EZM-Mischung in basischem Nährmedium im Verhältnis eins zu 10 und lagern Sie sie auf Eis. Tauchen Sie neue MEAs in einer Laminar-Flow-Haube 30 Sekunden lang in 70 % Ethanol. Anschließend 30 Sekunden lang mit destilliertem Wasser waschen.

Lassen Sie die MEAs dann 30 Minuten trocknen. Um die MEAs zu beschichten, pipettieren Sie 50 Mikroliter Beschichtungslösung mit einer kalten 200-Mikroliter-Pipettenspitze über die MEAs. Lassen Sie die MEAs dann 30 Minuten bis eine Stunde bei Raumtemperatur ziehen.

Entfernen Sie danach die Beschichtungslösung. Fügen Sie 100 Mikroliter Nährmedium hinzu, das mit 10 % FBS und fünf Nanogramm pro Milliliter BDNF angereichert ist, und lassen Sie es bei Raumtemperatur, bis das Gewebe plattiert ist. Stellen Sie dann die Petrischale mit den beschichteten MEAs in eine große Petrischale und fügen Sie eine kleine Petrischale mit PBS zur Befeuchtung hinzu.

Bei diesem Verfahren sterilisieren Sie den Kopf des Welpen mit 70% Ethanol. Schneiden Sie dann die Verbindung zwischen Haut und Schädel entlang der Sagittallinie durch. Schneiden Sie als Nächstes den Schädel sagital ab und entfernen Sie das Gehirn.

Schneiden Sie danach die Schläfenknochen aus dem Schädel ab und legen Sie sie in eine Petrischale, die steriles eiskaltes HBSS enthält. Präparieren Sie unter einem Präpariermikroskop die Trommelfellbulla mit einer feinen Pinzette und isolieren Sie das Innenohr. Entfernen Sie dann den Knochen der Cochlea.

Entfernen Sie als Nächstes das Spiralband und das SV zusammen, indem Sie den basalen Teil des Spiralganglions und das SV mit einer Pinzette festhalten und das SV langsam von der Basis bis zur Spitze abwickeln. Trennen Sie das Corti-Organ vom Spiralganglion in modiolus, indem Sie den basalen Teil des Spiralganglions und das Corti-Organ mit einer Zange halten und das Corti-Organ langsam von der Basis bis zur Spitze abwickeln. Schneiden Sie dann die lateralen Explantate mit einer Pinzette oder einer feinen Mikrodissektionsschere oder einem Messer aus dem Spiralganglion ab.

Übertragen Sie nun die Explantate des Spiralgangliens und das Corti-Organ auf das MEA. Platzieren Sie dann SG-Explantate über dem Elektrodenbereich und dem Corti-Organ in einem Abstand von etwa fünf Millimetern zum Elektrodenbereich. Platzieren Sie die Explantate und das Corti-Organ auf den MEAs und vermeiden Sie dabei eine Schädigung des Gewebes.

Legen Sie die MEAs anschließend vorsichtig in den Inkubator und kultivieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Am nächsten Tag untersuchen Sie die Explantate visuell auf ihre Befestigung an den MEAs. Fügen Sie dann an fünf aufeinanderfolgenden Tagen täglich 100 Mikroliter Nährmedium mit 10 % FBS und BDNF hinzu.

Am sechsten Tag fügen Sie zwei Milliliter Nährmedium mit 10 % FBS und fünf Nanogramm pro Milliliter BDNF hinzu und kultivieren Sie das Gewebe für weitere 13 Tage. Waschen Sie die MEA-Kultur nach einer kollektiven Kulturdauer von 18 Tagen mit der zuvor hergestellten extrazellulären Lösung bei Raumtemperatur. Trocknen Sie dann die Kontakte des MEA-Chips mit einem Stück Taschentuch ab und montieren Sie die MEAs auf den MEA-Halter.

Installieren Sie abschließend die MEA auf dem Aufnahme-Setup. Fügen Sie anschließend 300 Mikroliter der extrazellulären Lösung hinzu und warten Sie 10 Minuten, damit sich das System stabilisieren kann, bevor Sie aufnehmen. Zeichnen Sie nun die spontane Aktivität von allen Elektroden zwei Minuten lang auf und identifizieren Sie die aktiven Elektroden.

Identifizieren Sie dann die Elektroden, die auf die Stimulation reagieren. Um das Stimulationsartefakt auszuschließen, stimulieren Sie 10 Mal von derselben Elektrode. Wenn die Kultur mindestens acht von zehn Mal reagiert, kann davon ausgegangen werden, dass es sich um eine positive Reaktion auf eine elektrodeninduzierte Stimulation handelt.

Um ein Hintergrundrauschen zu identifizieren, wenden Sie TTX in einer Konzentration von einem Mikromolar auf die Kultur an, um die spannungsgesteuerten Natriumkanäle zu blockieren, und nehmen Sie dann zwei Minuten lang auf. Hier sind die Spuren der Originalaufnahmen von sechs von 63 Elektroden, die spontane Aktivität zeigen, und dies ist das Rasterdiagramm der sechs Elektroden nach der Spike-Detektion. Jeder Balken steht für ein Aktionspotential.

Dieses Rasterdiagramm enthält alle aktiven Elektroden. Die Aktivitäten werden von 63 Elektroden für zwei Minuten aufgezeichnet. Diese Abbildung zeigt, dass ein biphasischer Stimulus mit einer Gesamtdauer von 80 Mikrosekunden und einer Amplitude von 80 Mikroampere für die Kulturstimulation von einer Elektrode verwendet wurde.

Dieses repräsentative Beispiel für Rohdatenspuren zeigt die Aktionspotentiale, alle ohne Reaktionen nach Stimulation. Und hier ist die spiralförmige Ganglienkultur auf den MEAs, die am Ende des Experiments für den neuronalen Marker TUJ immungefärbt wurden, um die neuronale Abdeckung des Elektrodenbereichs zu visualisieren. Die für die Stimulation verwendete Elektrode ist grün und die ansprechenden Elektroden rot gekennzeichnet.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 50 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Obwohl diese Methoden Einblicke in die Elektrophysiologie von Spiralganglienneuronen geben können, können sie auch auf andere Systeme wie Gehirn- oder Rückenmarkskulturen angewendet werden. Nach der Entwicklung ebnet diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Materialwissenschaften und Nanotechnologie, der schnellen Oberflächenmodifikation von Elektroden zur neuronalen Aufzeichnung und Stimulation

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie elektrophysiologische Aktivität kultivieren und aufzeichnen können, indem Sie ein Neuronenexplantat auf Multielektrodenarrays anordnen.