Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

Das übergeordnete Ziel dieses enzymgebundenen Lektin-Assays ist es, funktionelle Antikörpertiter gegen Neuraminidase, ein Glykoprotein auf der Oberfläche des Influenzavirus, zu messen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Impfstoffe zu beantworten, wie z. B. Gibt es eine Antikörperreaktion auf Neuraminidase nach einer Grippeimpfung oder -infektion? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine praktische Plattform zur Messung von Neuraminidase-Hemmtiternitern in einer großen Anzahl von Serumproben bietet.

Bei der ELLA werden reassortante Influenzaviren verwendet, die die interessierende Neuraminidase und ein Hämagglutinin des H6-Subtyps enthalten. Dadurch wird eine Interferenz von Antikörpern gegen das Hämagglutinin im Impfstoff oder das infizierende infektiöse A-Virus verhindert. Die Arbeit mit lebenden Reassortanten H6-Influenzaviren erfordert eine Genehmigung und die Handhabung im Rahmen von Verfahren der erweiterten Biosicherheitsstufe 2.

H6-Reassortant-Viren, die chemisch inaktiviert wurden, können im Assay verwendet werden. In dieser Demonstration wird ein inaktivierter H6N2-Virus verwendet. Bereiten Sie Virusverdünnungen in einer 96-Well-Platte vor, indem Sie zunächst 120 Mikroliter Probenverdünnungsmittel in die Spalten 1 bis 11 der Verdünnungsplatte geben.

In Spalte 1 werden weitere 96 Mikroliter des Probenverdünnungsmittels hinzugefügt. Tauen Sie das Fläschchen mit dem Virus auf und wirbeln Sie es dann ein, bevor Sie 24 Mikroliter davon in eine Vertiefung in Spalte 1 geben. Dies ergibt eine Verdünnung des Virus im Verhältnis 1:10.

Führen Sie serielle zweifache Verdünnungen des Virus im Probenverdünnungsmittel durch, indem Sie 120 Mikroliter von einer Vertiefung in die nächste übertragen, wobei für jede Verdünnung saubere Pipettenspitzen verwendet werden. Waschen Sie anschließend eine mit Fetuin beschichtete Platte dreimal mit PBS-T. Tupfen Sie dann jede Platte auf ein saugfähiges Papiertuch, um überschüssigen Waschpuffer zu entfernen.

Geben Sie 50 Mikroliter Probenverdünnungsmittel in jede Vertiefung in den Spalten 1 bis 11 der Fetuin-beschichteten Platte. Für die Negativkontrolle werden 100 Mikroliter Probenverdünnungsmittel in Spalte 12 gegeben. Übertragen Sie 50 Mikroliter verdünntes Virus aus den Spalten 1 bis 11 der Verdünnungsplatte in doppelte Vertiefungen der Fetuin-beschichteten Platte.

Zum Mischen leicht klopfen. Und dann die Platte mit einem Plattenversiegeler abdecken. Stellen Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Übertragen Sie die Platte 16 bis 18 Stunden später auf die Bank und entfernen Sie die Plattenversiegelung. Waschen Sie die Platte sechsmal mit PBS-T, drehen Sie sie dann um und tupfen Sie sie auf saugfähige Papiertücher, um sicherzustellen, dass die gesamte Flüssigkeit aus den Vertiefungen entfernt wurde. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter Erdnussagglutinin-Meerrettich-Peroxidase-Lösung pro Vertiefung in alle Vertiefungen und inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang bei Raumtemperatur.

Weniger als 15 Minuten vor dem Ende der Inkubation bereiten Sie die OPD-Lösung vor. Waschen Sie die Testplatten dreimal, um das PNA-HRPO zu entfernen, und tupfen Sie sie trocken, bevor Sie 100 Mikroliter des OPD-Substrats in jede Vertiefung geben. Inkubieren Sie die Platte im Dunkeln genau 10 Minuten bei Raumtemperatur.

Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 100 Mikroliter einer normalen Schwefelsäure pro Vertiefung hinzufügen. Verwenden Sie ein Plattenlesegerät, um die optische Dichte (OD) bei 490 Nanometern für 0,1 Sekunden zu messen. Wählen Sie als Nächstes die Virusverdünnung aus, die für die Serologie verwendet werden soll, wie im Textprotokoll sowie im Abschnitt "Ergebnisse" beschrieben.

Es ist wichtig, eine Verdünnung innerhalb des linearen Bereichs der Virustitrationskurve zu wählen. Wir bevorzugen eine Verdünnung, die ein Signal nahe dem Maximum liefert, so dass der gesamte Assay-Bereich genutzt wird. Die ELLA wird durchgeführt, nachdem die für den Assay erforderliche Virusverdünnung bestimmt wurde.

Bereiten Sie zunächst die Reagenzien und Ausgangsmaterialien vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Erhitzen und aktivieren Sie die Serumproben in einem Wasserbad bei 56 Grad Celsius für 45 bis 60 Minuten. Tauen Sie ein Fläschchen mit dem Virus auf, wirbeln Sie es vor und resuspendieren Sie es in der Probenverdünnung bei der gewählten Verdünnung.

Bereiten Sie mindestens fünf Milliliter Virus für jede Assay-Platte vor. Bewahren Sie das verdünnte Virus auf Eis auf, bis die Platten gewaschen und Serumproben auf die Platte gegeben wurden. Bereiten Sie Verdünnungen der Serumproben und aller Kontrollen vor, indem Sie serielle zweifache Verdünnungen in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden vornehmen, beginnend mit einer Verdünnung von eins zu zehn im Probenverdünnungsmittel.

Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 Mikroliter jeder Serumkontrolle oder Probenverdünnung von der Verdünnungsplatte in doppelte Vertiefungen einer gewaschenen Fetuin-beschichteten Platte zu übertragen. Die Probenverdünnungen sollten in den Spalten 2 bis 11 zugegeben werden. 50 Mikroliter verdünntes Virus werden in alle Vertiefungen gegeben, mit Ausnahme der Negativkontrolle in Spalte 12.

Geben Sie 50 Mikroliter Probenverdünnungsmittel in die Vertiefungen in Spalte 1 und geben Sie 100 Mikroliter Probenverdünnungsmittel in Spalte 12. Decken Sie die Vertiefungen mit einem Plattenversiegeler ab und mischen Sie dann, indem Sie vorsichtig auf die Seiten der Platte klopfen oder sie 10 Sekunden lang bei mäßiger Geschwindigkeit auf einen Plattenschüttler legen. Stellen Sie die Platte für 16 bis 18 Stunden bei 37 Grad Celsius in einen befeuchteten Inkubator.

Wenn die Inkubation über Nacht abgeschlossen ist, waschen Sie die Platte, bevor Sie PNA-HRPO hinzufügen, und schließen Sie den Assay wie zuvor ab. Lesen Sie die optische Dichte bei 490 Nanometern ab und bestätigen Sie, dass die Testergebnisse gültig sind. Bestimmen Sie den 50%-Endpunkttiter, wie im Textprotokoll und im Abschnitt "Ergebnisse" beschrieben.

Um die Virusverdünnung auszuwählen, die für die Serologie verwendet werden soll, wird ein Diagramm erstellt, das den OD-Wert bei 490 Nanometern bei jeder Virusverdünnung darstellt. Die maximale OD bildet ein Plateau bei den geringsten Virusverdünnungen. Wählen Sie die Virusverdünnung aus, die etwa 90 % des maximalen Signals ergibt und innerhalb des linearen Bereichs liegt.

Vergewissern Sie sich, dass der OD bei der gewählten Verdünnung mindestens zehnmal größer ist als das Hintergrundsignal. Dies ist die ausgewählte Virusverdünnung für die ELLAs, die diesen speziellen Virusbestand verwenden. Es werden repräsentative Ergebnisse eines enzymgebundenen Lektin-Assays gezeigt, der die prozentuale Hemmung der Neuraminidaseaktivität zeigt, die für jede Serumverdünnung berechnet wurde.

Die Serumverdünnung ist auf einer logarithmischen Skala dargestellt, wie in diesem Diagramm dargestellt. Identifizieren Sie die Verdünnung des Serums, die zu einer Hemmung der Neuraminidaseaktivität von mehr oder gleich 50 % führte. In diesem Beispiel führte die Verdünnung des Serums von 1 zu 160 zu einer Hemmung von 74 % und die Verdünnung des Serums von 1 zu 320 zu einer Hemmung von 45 %.

Der Neuraminidase-Hemmtiter beträgt daher 160. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, antigene Unterschiede in den Neuraminidasen der saisonalen Influenzaviren zu untersuchen. Die ELLA wurde auch verwendet, um zu zeigen, dass Neuraminidase-hemmende Antikörper mit dem Schutz vor klinischen Anzeichen von Influenza korrelieren.