Die Analyse der Herzkranzgefäße in Gelöscht Embryonale Herz

Wir präsentieren ein Protokoll für die Analyse der Herzkranzgefäße in ganzen embryonalen Maus-Herzen bis E15.5, durch optische Clearance und der konfokalen Mikroskopie, gefolgt von immunologischen Standard Färbemethoden verwendet wird. Diese Technik ermöglicht die Darstellung von Blutgefäßen während des gesamten Herzens ohne die Notwendigkeit für zeitaufwendige Analyse von Serienschnitten.

Das übergeordnete Ziel dieser BABB-Methode zur Reinigung von Basisgewebe ist es, eine nicht-invasive Bildgebung von markierten Strukturen tief in interessierenden Proben zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der kardiovaskulären Entwicklung zu beantworten, z. B. welche Zellen oder Moleküle zur normalen Koronarbildung beitragen. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie einfach durchzuführen ist, keine teuren Reagenzien benötigt und im Vergleich zu anderen Gewebereinigungsmethoden schnell ist.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie der koronaren Herzkrankheit, da das Verständnis der Gefäßbildung zu therapeutischen Strategien zur Vorbeugung von Krankheiten oder zur Wiederherstellung der normalen Herzfunktion führen kann. Verwenden Sie am Tag des Eingriffs ein Präpariermikroskop und eine Pinzette, um die eutherischen Säcke einer zeitlich begrenzten schwangeren Maus vorsichtig zu öffnen. Entfernen des Dottersacks von jedem Embryo und Durchtrennen der Nabelschnur.

Um das Herz zu entfernen, verwenden Sie Minutemen-Stifte aus Edelstahl, um jeden Embryo auf seinem Rücken in einer mit PBS gefüllten 35-Millimeter-Petrischale aus Silikonelastomer zu befestigen. Und benutzt eine feine Pinzette, um den Brustkorb vorsichtig zu öffnen und das Innere des großen Gefäßes zum Herzen hin zu durchtrennen. Wenn Sie mit der Pinzette hinter das Herz greifen, werden die hinteren Herzgefäße erfasst und sanft gezogen, um das Organ zu entfernen.

Legen Sie das Herz in eine frische 35-Millimeter-Petrischale, die PBS enthält. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um das Lungengewebe bei Bedarf abzuschneiden, und übertragen Sie das Herz in 1 Vertiefung einer 48-Well-Platte mit kaltem PBS. Wenn alle Herzen gesammelt wurden, verwenden Sie eine Pasteur-Pipette aus Kunststoff mit feiner Spitze, um das PBS in jeder Vertiefung durch 0,5 Milliliter 4%iges Paraformaldehyd in einem Abzug zu ersetzen.

Entfernen Sie am Ende der Fixierzeit das Fixiermittel und spülen Sie die Herzen zweimal in kaltem PBS aus. Um die Herzen für die Immunfärbung des gesamten Mount zu permeabilisieren, geben Sie die Proben in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und spülen Sie das Gewebe mit drei 10-minütigen Wäschen in 0,5 bis 1 Milliliter PBST mit Rotation bei Raumtemperatur. Nach der dritten Wäsche die Herzen eine Stunde lang mit Rotation bei Raumtemperatur in 1 Milliliter frisch zubereitetem 10-prozentigem Ziegenserum in PBST blockieren.

Ersetzen Sie dann das Serum durch 400 bis 500 Mikroliter des primären Antikörpers von Interesse in frischem Blockpuffer für eine Rotation über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag entfernen Sie den Antikörper und waschen die Herzen mit sechs einstündigen Spülungen in einem Milliliter PBST mit Rotation bei Raumtemperatur. Nach der letzten Wäsche ersetzen Sie den PBST durch frischen Blockierungspuffer und setzen den entsprechenden Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper für eine lichtgeschützte Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius fort.

Waschen Sie dann die Herzen sechsmal mit PBST, wie gerade gezeigt. Um mit Silikonelastomer beschichtete Schalen für die konfokale Mikroskopie vorzubereiten, setzen Sie in einem Abzug eine Kappe aus einem Vier-Milliliter-Fläschchen mit Schraubverschluss in die Mitte einer Kulturschale mit optischem Glasboden für jedes Herz. Füllen Sie dann mit einer Schutzbrille jede Schale bis zu einer Tiefe von etwa 0,5 Zentimetern mit Silikonelastomer.

Verwenden Sie eine Applikatorpatrone, um die beiden Komponenten zu mischen, während sie gemäß den Anweisungen des Herstellers aufgetragen werden. Lassen Sie die Verbindung mindestens 24 Stunden lang aushärten und achten Sie darauf, dass die Kappe des Fläschchens in der Mitte jeder Schale bleibt. Entfernen der Kappen von den Platten, wenn das Elastomer ausgehärtet ist.

Vor dem Reinigen der Herzen werden die Proben jeweils fünf Minuten lang durch ein in der PBS-Serie verdünntes Methanol in folienbeschichteten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen gedreht. Tauchen Sie die Herzen nach der perfekten 75-minütigen Umdrehung in 100 Prozent Methanol. Nach der letzten Dehydrationsdrehung die Herzen bis zum Embryonaltag 13,5 in die Mitte jeder Elastomervertiefung legen.

Ausrichten der Proben mit der dorsalen Seite nach oben unter dem Präpariermikroskop. Verwende eine Pasteur-Pipette aus Kunststoff mit feiner Spitze, um das Methanol um jedes der Herzen herum zu entfernen. Geben Sie dann in einem Abzug mit einer neuen Pipette 50 bis 50 frisch zubereitete BABB in eine Methanollösung in einem ausreichenden Volumen, um die Herzen einzutauchen.

Bestätigen Sie die Ausrichtung, während die Herzen noch undurchsichtig sind. Es ist sehr wichtig, die Probe entsprechend der Position des konfokalen Lasers auszurichten, bevor die Reinigung abgeschlossen ist, um eine gute Abbildung der Herzkranzgefäße oder anderer interessanter Strukturen zu gewährleisten. Füllen Sie die Lösung nach fünf Minuten in eine Glasabfallflasche in der Abzugshaube um und fügen Sie so viel frisches BABB hinzu, dass die Proben in einem Tropfen Lösung liegen.

Die Proben sollten innerhalb von fünf Minuten klar sein. Wenn das Gewebe klar ist, ersetzen Sie die Lösung durch eine minimale Menge BABB. Die Beispiele können nun abgebildet werden.

Am embryonalen Tag 11,5 färbt der PECAM1-Antikörper hauptsächlich die endokardiale Auskleidung des Herzens und der Ausflussgefäße. Es sind aber auch einige Endothelzellen in der linken Ventrikelwand zu beobachten. Hier kann das vergrößerte Gefäßsystem approximal zur Aorta bei einem embryonalen Tag 12,5 des Herzens beobachtet werden.

Diese 12-Schicht-Z-Projektion zeigt den gesamten Parry-Trunkloplexus eines embryonalen Tages 12,5-Herz. Da jedoch einige Gefäße schließlich an das stark PECAM1-gefärbte Allumum der Aorta lokalisiert sind, liefert die Aufteilung des z-Stapels in eine Reihe von Unterstapeln mehr visuelle Informationen. Diese fünfschichtigen Z-Projektionen eines embryonalen Herzes am Tag 15,5 erleichtern die Visualisierung der Aorten- und Pulmonalklappe durch PECAM1-Färbung.

Die Verästelungen und Verbindungen des koronaren Kapillarnetzwerks sind in den kleineren Sub-Stack-Projektionen deutlicher zu sehen. Die Analyse der Bildgebungssoftware ermöglicht die manuelle Segmentierung der Proben, um die Koronararterien mit oder ohne das umgebende Gefäßsystem hervorzuheben. Auch das Gefäßsystem ganzer Embryonen kann mittels PECAM1-Färbung und BABB-Clearance untersucht werden.

Eine weitere Färbung von Embryonen am Tag 11,5 mit PECAM1, die unmittelbar nach der BABB-Clearance oder nach etwa zwei Monaten aufgenommen wurde, zeigt, dass das Fluoreszenzsignal stark genug ist, um nach längerer Lagerung in der Clearing-Lösung abzubilden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa einer Woche von der Präparierung bis zur Bildaufnahme abgeschlossen werden. Allein das Räumen und Einbetten kleiner Proben kann in 30 Minuten erledigt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man embryonale Herzen präpariert, fluoreszierend markiert und mit BABB reinigt, um für die konfokale Mikroskopie bereit zu sein. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die multiphotonische Bildgebung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, zum Beispiel zur zellulären Morphologie bei der Bildung von Herzkranzgefäßen. Diese Technik soll es Forschern auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie ermöglichen, die Entwicklung von Blutgefäßen in embryonalen Herzen von Mäusen und anderen Modellsystemen zu erforschen.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Proben schonend zu behandeln, um eine Beschädigung des empfindlichen embryonalen Gewebes zu vermeiden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit BABB äußerst gefährlich sein kann. Unter Vorsichtsmaßnahmen wie dem Tragen von Handschuhen, einem Laborkittel und einem Augenschutz sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer ein Laborkittel und ein Augenschutz mitgenommen werden.