Der Aufbau Finite-Elemente-Modelle zu Zebrabärbling Jaw Biomechanik Untersuchen

Das übergeordnete Ziel dieser Modellierungstechnik ist es, die mechanische Umgebung zu simulieren, die bei der Entwicklung von Zebrafischkiefern auftritt. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im muskuloskelettalen Bereich zu beantworten, wie z.B. wie sich die Muster mechanischer Belastung im Laufe der Zeit verändern. Und wie stimulieren diese Belastungen das Zellverhalten?

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, Muster der Genexpression und Veränderungen des Zellverhaltens im Kontext der mechanischen Umgebung zu analysieren. Diese Methode kann Aufschluss über die Entwicklung des Skeletts geben. Es kann auch auf jede andere biologische Struktur angewendet werden, die mechanisch belastet wird, wie z. B. die Skelettelemente bei höheren Wirbeltieren oder das Herz-Kreislauf-System.

Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Terminologie und die Software einen technischen Hintergrund voraussetzen. Um die Form der Skelettelemente zu visualisieren, die Muskeln zu quantifizieren und die genaue Position der Muskelansätze zu identifizieren, wird der Fisch im richtigen Alter immungefärbt auf Skelettmyosin und Typ-II-Kollagen. Fixieren Sie zunächst eine Fischlarve eine Stunde lang in 4%Paraformaldehyd und PBS.

Waschen Sie dann das Fixiermittel mit zwei PBT-Waschmitteln ab. Als nächstes dehydrieren Sie die Larve fünf Minuten lang in 50 % Methanol und PBT, gefolgt von 100 % Methanol für fünf Minuten. Die Larven können dann bis zur Verwendung in 100%igem Methanol gelagert werden.

Bei Bedarf rehydrieren Sie die Larve fünf Minuten lang in 50 % Methanol und PBT. Waschen Sie es dann fünf Minuten lang in PBT. Permeabilisieren Sie nun die Larve mit 0,25 % Trypsin und PBT auf Eis für fünf bis sechs Minuten.

Waschen Sie es dann fünf Minuten lang in PBT und wiederholen Sie die PBT-Wäsche noch dreimal. Blockieren Sie die Larve vor dem Auftragen der Antikörper für zwei bis drei Stunden in 5%Serum und PBT. Inkubieren Sie dann die Larve in der empfohlenen Verdünnung von Kaninchen-Anti-Typ-II-Kollagen und Maus-Anti-Myosin-Antikörpern mit 5 % Serum und PBT.

Führen Sie diese Inkubation eine Stunde lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius durch. Nach dem Auftragen der Primärantikörper waschen Sie die Larve insgesamt sechsmal pro Waschgang für 15 Minuten in PBT. Tragen Sie nach den PBT-Waschungen ein 5%iges Serum und einen PBT-Block für ein bis zwei Stunden auf.

Tragen Sie nun die Sekundärantikörper auf und halten Sie das Präparat von nun an so weit wie möglich im Dunkeln. Verwenden Sie fluoreszenzmarkierte Anti-Maus- und Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper in 5 % Serum und PBT. Nach dem Auftragen der Sekundärantikörper waschen Sie die Larve sechsmal für 10 Minuten pro Waschgang in PBT.

Jede Larve, die wie beschrieben gefärbt ist oder fluoreszierende Markierungen exprimiert, kann nun mit einem Konfokalmikroskop wie folgt abgebildet werden. Nehmen Sie einen konfokalen Bildstapel des interessierenden Bereichs mit dem 10-fach-Objektiv mit etwa 2,5-fachem Digitalzoom auf. Stimulieren Sie den grünen und roten Kanal mit einem 488-Nanometer-Laser und einem 561-Nanometer-Laser.

Nehmen Sie dann Bilder mit 512 Quadratpixeln in einem Z-Ebenen-Intervall von 1,3 Mikrometern mit drei Linienmittelwerten auf. Etwa 100 Z-Abschnitte füllen den Stapel. Exportieren Sie die Daten als TIFF-Bildstapel.

Öffnen Sie den TIFF-Bildstapel und zeigen Sie alle Kanäle in der entsprechenden Software an. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Knorpelkanal, wählen Sie Orthosslice aus, und erstellen Sie ihn. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf den Knorpelkanal und wählen Sie Bildverarbeitung, Glätten und Entrauschen, wählen Sie den Bildfilter aus und schalten Sie die Gaußsche Glättung um.

Klicken Sie in der Projektansicht mit der rechten Maustaste auf das gefilterte Bild, wählen Sie Bildsegmentierung und dann neues Label bearbeiten. Erstellen Sie für jedes Material, z. B. Knorpel und Gelenk, ein neues Etikett. Wählen Sie dann den Knorpelbereich des Bildes mit dem Zauberstab-Werkzeug aus, während alle Segmente aktiviert sind, und verwenden Sie das Pinselwerkzeug, um Rauschen aus den Konturen zu entfernen.

Wählen Sie anschließend den Gelenkbereich mit dem Pinselwerkzeug aus, weisen Sie ihn der Gelenkkomponente zu und wiederholen Sie die Aktion im gesamten Gelenk. Um mehrere Segmente gleichzeitig zu glätten, wählen Sie im oberen Menü Segmentierung und dann Beschriftungen glätten aus. Um dann ein 3D-Oberflächenrendering der Komponente zu erstellen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und wählen Sie Oberfläche generieren.

Klicken Sie nun auf die gerenderte Oberfläche und speichern Sie die Daten als HMASCII-Datei für die Vernetzung software. 3D die Netzgenerierung ist ein wichtiger Schritt bei der Generierung eines guten Modells. Sie müssen einen Kompromiss zwischen einem Netz finden, das die wahre Form der Struktur darstellt, die Sie modellieren möchten, ohne so viele Details einzubeziehen, dass Sie problematische Elemente einführen, z. B. solche mit einem zu kleinen oder zu großen Winkel.

Um das Netz zu generieren, importieren Sie das 3D-Modell in ein leistungsfähiges Softwarepaket. Um ein zweidimensionales Netz der Knorpel- und Gelenkflächen zu erzeugen, verwenden Sie das Werkzeug Schrumpffolie im Menü 2D. Wählen Sie eine Elementgröße zwischen 1,5 und 2,5.

Eine Reihe von Oberflächennetzen unterschiedlicher Größe kann erstellt werden, um eine 3D-Netzoptimierung durchzuführen. Um sicherzustellen, dass das Netz zwischen der Gelenk- und der Knorpeloberfläche durchgehend ist, müssen alle Elemente an der Begrenzung gemeinsame Knoten aufweisen. Um dies zu erreichen, entfernen Sie die Innenfläche der Fuge und lassen Sie ein hohles Rohr zurück.

Verwenden Sie die Funktionstaste F2, um auf die Verknüpfung zum Menü Elemente löschen zuzugreifen. Wählen Sie die zu löschenden Elemente aus. Passen Sie die Grenzknoten an die Knorpeloberfläche an.

Verwenden Sie eine Kombination aus den Funktionstasten F2, F3 und F6, um Knoten zu löschen, zu verschieben bzw. neue Elemente zu erstellen. Duplizieren Sie abschließend die Knorpeloberfläche am Gelenk mit dem Menü "Komponenten organisieren". Verwenden Sie die Funktionstaste F2, um alle nicht verbundenen Elemente zu löschen.

Führen Sie anschließend Qualitätsprüfungen durch, indem Sie zum Bereich Elemente prüfen gehen. Überprüfen Sie, ob das Netz duplizierte Elemente, Einfügungen und Durchdringungen aufweist. Wenn Sie sie finden, bearbeiten Sie sie auf der Registerkarte Werkzeuge.

Überprüfen Sie die Flächenwinkel mit der Registerkarte Dienstprogramm, die sich in der Option Modellbaum befindet. Um ein 3D-Netz aus den 2D-Oberflächennetzen unterschiedlicher Elementgrößen zu generieren, verwenden Sie das Werkzeug Tetranetz. Vergleichen Sie verschiedene Netzgrößen, und wählen Sie das FE-Modell mit der niedrigsten Netzgröße aus, die nach weiteren Simulationen konvergiert und die Feature-Definition nicht beeinträchtigt

Transformieren Sie anschließend mit dem Abstandswerkzeug das Netz, sodass das Kiefermodell skaliert werden soll. Stellen Sie sicher, dass die Knorpel- und Gelenkkomponenten im Modell verbunden sind, indem Sie ein zusammengeführtes Modell exportieren oder Verknüpfungen verwenden. Wenden Sie anschließend Lasten, Randbedingungen und Materialeigenschaften auf das FE-Modell an, um die Backenfunktion zu simulieren.

Definieren Sie die Muskeln anhand der beschrifteten konfokalen Stacks. Weisen Sie zunächst Knoten zu, die den Muskelansatzpunkten entsprechen. Erstellen Sie dann Vektoren zwischen den Knoten, die den Ursprung und die Insertion der einzelnen Muskeln darstellen.

Nachdem alle Muskeln definiert sind, erstellen Sie einen Verlaufs-Loadcollector, und wenden Sie auf jeden Muskel einen Cload an. Geben Sie die Größe in Newton an, und weisen Sie den zugehörigen Vektor zu. Weisen Sie dann geeignete elastische isotrope Materialeigenschaften zu, die in der Literatur bestimmt sind.

Erstellen Sie als Nächstes einen Kollektor Grenzlast, und wenden Sie einige anfängliche Randbedingungen auf das Modell an. Wählen Sie die Knoten aus, die eingeschränkt werden sollen, und wählen Sie einen Freiheitsgradfaktor aus, der dem natürlichen Bewegungsbereich des Muskels ähnelt, der durch diese Knoten definiert wird. Erstellen Sie nun für jede Art von Bewegung, die simuliert werden soll, einen Lastschritt.

Wählen Sie im Analysemenü alle relevanten Lasten und Randbedingungen aus, um die angegebene Bewegung zu simulieren. Wählen Sie dann statisch aus dem Dropdown-Menü aus. Wenn Sie fertig sind, exportieren Sie das Modell in einem geeigneten Dateiformat, einschließlich des Netzes, der Lasten, der Abhängigkeiten und der Materialeigenschaften.

In diesem Fall wird das INP-Format gewählt. Laden Sie dann das Modell in die FE-Analysesoftware. Erstellen und führen Sie darin einen Auftrag für das Modell aus, und analysieren Sie die Ausgabe auf Spannung, Dehnung, Verschiebung usw.

Wählen Sie drei bis sechs transgene Zebrafischlarven aus und betäuben Sie die Larven leicht mit 0,02 %MS-222, bis sie nicht mehr auf Berührung reagieren, aber ihr Herz noch schlägt. Montieren Sie dann die Larven seitlich auf Deckgläser in lauwarmer Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in Danieau-Lösung. Entfernen Sie anschließend vorsichtig die Agarose mit einer Pinzette um den Kopf und den Kiefer.

Spülen Sie dann mit einer Pasteur-Pipette frische Danieau-Lösung über den Kopf der Larve, um das Anästhetikum zu entfernen. Tun Sie dies, bis die normale Mundbewegung wieder aufgenommen wird. Verwenden Sie jetzt eine Filmaufnahmesoftware, um fluoreszierende Hochgeschwindigkeitsvideos der Mundbewegungen aufzunehmen.

Filmen Sie so lange mit der höchsten Bildrate, wie es für die Aufzeichnung mehrerer Backenöffnungszyklen erforderlich ist. Analysieren Sie später die maximale Verschiebung des Kiefers. Wählen Sie die Rahmen, die den Kiefer am weitesten öffnen, und messen Sie den Abstand zwischen der vorderen Spitze des Meckel-Knorpels und dem Oberkiefer.

Der obere Kieferpunkt entspricht der Spitze der Siebbeinplatte. Die Immunfärbung von Muskeln und Knorpel oder die Bildgebung transgener Reporter ermöglicht die Visualisierung der 3D-Struktur des Kiefers und der zugehörigen Muskulatur. Durch die Bildgebung mit hoher Auflösung war es möglich, ein Modell zu erstellen, das die 3-dimensionale Form des Kiefers erfasst.

Das Modell berücksichtigt Lasten, deren Position und Größe aus den konfokalen Bildern von Muskeln und Knorpel abgeleitet wurden. Anhand dieses Modells wurden eine Reihe unterschiedlicher Materialeigenschaften getestet. Unter Verwendung der In-vivo-Verschiebung, die durch Hochgeschwindigkeits-Videoaufnahmen beobachtet wird, wurde ein Modell ausgewählt, das diesen Bewegungsbereich am besten repliziert.

Unter Verwendung der genauesten Materialeigenschaften, Lasten und Netzformdaten wurde das FE-Modell verwendet, um die beste Schätzung der mechanischen Umgebung in diesem Zeitraum zu untersuchen. Zum Beispiel wurden die Größenordnungen der Spannung gemessen. Das Modell kann vergrößert werden, um die feinen Details des Musters zu sehen, und dann in digitalen Schnitten betrachtet werden, um die Details in allen Dimensionen zu betrachten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, haben Sie ein gutes Verständnis dafür, wie Sie mit konfokaler Bildgebung ein physiologisch genaues 3D-Modell einer biologischen Struktur erstellen können, die unter mechanischer Belastung steht. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass es sich um ein lineares, elastisches Modell handelt und sich Knorpel nicht vollständig wie ein lineares Material verhält. Andere Materialeigenschaften, wie z. B. die Durchlässigkeit, können eingearbeitet werden, erfordern jedoch möglicherweise weitere Modifikationen am Gewebe.