Einzelzell-RNA-Seq von definierten Subsets von Retinal-Ganglion-Zellen

Hier präsentieren wir einen kombinatorischen Ansatz zur Klassifizierung von neuronalen Zelltypen vor der Isolierung und für die anschließende Charakterisierung von einzelligen Transkriptomen. Dieses Protokoll optimiert die Probenvorbereitung für eine erfolgreiche RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und beschreibt eine Methodik, die speziell für das verbesserte Verständnis der zellulären Vielfalt entwickelt wurde.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, fluoreszenzmarkierte Einzelzellen aus lebenden Netzhäuten ganzer Mounts zu isolieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Neurowissenschaften zu beantworten. Zum Beispiel, wie viele Subtypen einer bestimmten neuronalen Klasse existieren und was sind die genetischen Marker für jeden Subtyp?

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir auf die Notwendigkeit einer Dissoziation des Netzhautgewebes verzichten, so dass die Zellen vor der Isolierung in einer gesünderen Umgebung überleben können. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf jede fluoreszenzmarkierte Zellpopulation und können daher auf andere Systeme angewendet werden, um die zelluläre Vielfalt und Funktion bei Gesundheit und Krankheit zu verstehen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da diese Technik auf der Fähigkeit des Forschers beruht, eine Zelle zu patchen, ohne die Lebensfähigkeit der Zelle zu beeinträchtigen.

Die zukünftige Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der RNA-Isolierung möglicherweise schwer zu erlernen sind, da die kleine Menge RNA leicht abgebaut werden kann, wenn sie nicht richtig und schnell gehandhabt wird. Um diesen Vorgang zu beginnen, stechen Sie mit einer Nadel in die Hornhaut und schneiden Sie sie an der Grenze von Hornhaut und Sklera weg. Entfernen Sie dann die Linse mit einer Pinzette.

Machen Sie vorsichtig einen Riss in die Sklera und durchtrennen Sie den Sehnerv an der Stelle, an der sich Netzhaut und Sklera treffen. Entfernen Sie die Sklera vorsichtig von der Netzhaut. Entfernen Sie anschließend den transparenten Glaskörper.

Schneiden Sie die Netzhäute in zwei Hälften und lagern Sie sie bis zur Verwendung in der sauerstoffhaltigen extrazellulären Lösung bei Raumtemperatur. Wenn Sie bereit sind, das Gewebe in die Aufnahmekammer zu montieren, übertragen Sie ein Stück Netzhaut in die Enzymlösung, verdünnt in 500 Mikrolitern sauerstoffreicher extrazellulärer Lösung in einer Petrischale, und inkubieren Sie es zwei Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Shaker. Waschen Sie anschließend die Netzhaut in der sauerstoffhaltigen extrazellulären Lösung und übertragen Sie sie mit einer Kunststoff-Transferpipette in eine Aufzeichnungskammer mit Glasboden.

Danach glätten Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Pinzette, wobei die Photorezeptorschicht nach unten zeigt. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einer Pipette und verankern Sie das Gewebe mit einem Platinring mit Nylonnetz. Füllen Sie dann die Kammer mit der sauerstoffhaltigen extrazellulären Lösung und montieren Sie sie auf einen Mikroskoptisch.

Perfundieren Sie das Gewebe mit der sauerstoffhaltigen extrazellulären Lösung mit zwei bis vier Millilitern pro Minute. Zur Vorbereitung dieses Verfahrens pulsieren Sie einige Mikropipetten aus Glas für elektrophysiologische Aufzeichnungen mit einem Mikropipettenzieher. Betrachten Sie die Ganglienzellschicht mit einer IR-DIC-Optik.

Identifizieren Sie dann die GFP plus Ganglienzellen mittels Epifluoreszenz bei etwa 480 Nanometern. Suchen Sie als Nächstes die mit intrazellulärer Lösung gefüllte Pipette in DIC. Üben Sie einen leichten Überdruck aus und stellen Sie alle Spannungsversätze am Verstärker auf Null.

Senken Sie anschließend die Glasmikropipette auf eine GFP-positive Zelle ab und wenden Sie die Befehlsschritte für die Prüfspannung an, um den Dichtungswiderstand zu überwachen. Der Unterdruck soll eine Gigaohm-Dichtung zwischen der Pipette und der Zellmembran bilden. Nachdem Sie eine stabile Versiegelung gebildet haben, brechen Sie die Membran auf, indem Sie kurze Unterdruckimpulse anwenden, um Zugang zur gesamten Zelle zu erhalten.

Warten Sie ein bis zwei Minuten, bis sich die Dendriten der Zelle mit fluoreszierendem Tracer gefüllt haben. In diesem Schritt extrahieren Sie vorsichtig den zytoplasmatischen Inhalt der Zelle in die Pipette, indem Sie mit einer Zehn-Milliliter-Spritze Unterdruck ausüben. Überwachen Sie in der Zwischenzeit die Extraktion in DIC, indem Sie sich vorstellen, wie sich der Zellkörper verkleinert.

Heben Sie nach der Extraktion des zytoplasmatischen Inhalts die Pipette vorsichtig vom Gewebe ab und nehmen Sie die Pipette schnell aus der Lösung. Nehmen Sie anschließend die Pipette schnell aus der Kopftischhalterung und spülen Sie die Pipettenspitze kurz mit DEPC-behandeltem H2O aus. Verbinden Sie dann die Pipette über den dicht schließenden Schlauch mit einer Ein-Milliliter-Spritze.

Exjizieren Sie die Zellen sofort in zehn Mikroliter Lysepuffer, einen in die 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen in einer Tisch-Minizentrifuge kurz bei 2000 mal g für zehn Sekunden. Danach werden die Proben sofort fünf Minuten lang auf Trockeneis schockgefroren.

Lagern Sie sie nach dem Einfrieren bis zu zwei Wochen lang bei minus 80 Grad Celsius, um beste Ergebnisse zu erzielen. Um sich auf dieses Verfahren vorzubereiten, richten Sie eine Magnetabscheidervorrichtung ein, indem Sie den oberen Teil eines umgedrehten P20- oder P200-Spitzenhalters an den 96-Well-Magnetständer kleben. Bereiten Sie dann frisches 70%iges Ethanol mit etwa einem Milliliter pro Probe vor.

Nehmen Sie die RNA-Magnetkügelchen aus der Lagerung bei 4 Grad Celsius und tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf. Sobald die RNA-Kügelchen Raumtemperatur erreicht haben, wirbeln Sie sie 30 Sekunden lang, um sicherzustellen, dass die Lösung gut vermischt ist. Danach tauen Sie die Zellen eine Minute lang bei Raumtemperatur auf.

Geben Sie dann fünf Mikroliter Rnase-freies H2O in jede Probe und pipettieren Sie auf und ab. Geben Sie anschließend 22 Mikroliter RNA-Kügelchen in jedes Röhrchen und mischen Sie es gründlich. Inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, damit die RNA mit den magnetischen Kügelchen interagieren und sich mit ihnen binden kann.

Legen Sie anschließend die Röhrchen für acht Minuten auf einen Magnetabscheider. Bevor Sie fortfahren, stellen Sie sicher, dass der Überstand klar ist. Beobachten Sie die Kügelchen aus einer Palette und achten Sie darauf, dass Sie sie beim Pipettieren nicht von der Seite des Röhrchens lösen.

Entfernen Sie den Überstand aus den Proben und fügen Sie 150 Mikroliter 70%iges Ethanol hinzu. Entfernen Sie dann das Ethanol und wiederholen Sie die Wäsche noch zwei weitere Male. Lassen Sie die Proben sechs Minuten lang an der Luft trocknen.

Prüfen Sie von Zeit zu Zeit, ob sich am Boden der Tube mehr Ethanol angesammelt hat, und entfernen Sie es entsprechend. Denken Sie daran, dass es wichtig ist, die Perlen richtig zu trocknen. Wenn die Kügelchen nicht trocken genug sind, kann Ethanol mit dem Eluenten transportiert werden und die Gesamtausbeute verringern, während zu getrocknete Kügelchen zum Verlust von RNA führen können.

Während die Proben trocknen, bereiten Sie 10x Reaktionspuffer vor, indem Sie 19 Mikroliter Lysepuffer zwei und einen Mikroliter Rnase-Inhibitor kombinieren. Schleudern Sie es kurz herunter und lassen Sie es auf Eis. Sobald die Proben trocken sind und die Perlpellets nicht mehr glänzend erscheinen, entfernen Sie die Röhrchen aus dem Magnetabscheider und fügen Sie 9,5 Mikroliter Rnase-freies H2O hinzu, um die Proben zu rehydrieren.

Legen Sie dann die Proben auf Eis und fügen Sie jeder Probe einen Mikroliter 10x Reaktionspuffer hinzu. Dieses Bild zeigt die Ganglienzellschicht der Netzhaut, die mit IR-DIC in der gesamten Präparation der Halterung der Netzhaut sichtbar gemacht wurde. Das gleiche Präparat wurde in Epifluoreszenz bei etwa 480 Nanometern sichtbar gemacht, um die GFP-positiven Ganglienzellen zu identifizieren.

Dieses Bild zeigt eine GFP-positive Zelle, die für die Patch-Clamp-Aufzeichnung anvisiert und mit einem fluoreszierenden Tracer gefüllt wurde. Konfokale Bilder von ipRGC-Dendriten, die in der On- und Off-Sublamina der inneren plexiformen Schicht abgebildet sind, ermöglichen die Klassifizierung dieser Zelltypen. Diese Ausgabe des Bioanalysators zeigt Beispiele von Bibliotheken, die einer reversen Transkription, Amplifikation und Reinigung unterzogen wurden. Die Spuren eins bis drei zeigen ideale DNA-Abstriche, während Spur vier eine schlecht verarbeitete Probe darstellt.

Die Kontrollspur sollte zwei saubere Peaks bei den Markergrößen 35 bp und 10380 bp enthalten. Hier ist ein detaillierter Trace einer erfolgreich vorbereiteten Bibliothek mit hoher Intensität von etwa 2 kb. Diese Spur zeigt ebenfalls eine erfolgreiche Präparation, allerdings mit einem Abstrich um 500 bp.

Dieses Bild zeigt die Ausgabe des Bioanalysators nach der Tagmentierung, Amplifikation und Aufreinigung der Proben. Hier ist die detaillierte Spur einer erfolgreich markierten Probe zu sehen, die der Probe auf Bahn eins entspricht. Eine unvollständige Tagmentierung führt zu einer Spur wie der hier gezeigten, die eine erneute Tagmentierung mit einer frischen Verdünnung rechtfertigt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie RNA aus den fluoreszenzmarkierten Zelltypen in der intakten Netzhaut isoliert werden kann. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass RNA sehr empfindlich auf Abbau reagiert und dass gesunde Netzhautzellen der Schlüssel sind. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie qPCR, NC2-Hybridisierung oder Immunhistochemie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob die identifizierten Gene spezifisch für einen bestimmten zellulären Subtyp sind. Diese Technik hat den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurowissenschaften geebnet, die versuchen, die Heterogenität von Neuronen in verschiedenen Gehirnregionen zu verstehen. Das Verständnis dieser Heterogenität wird zukünftige Studien der zellulären Funktion und Konnektivität in molekular identifizierten Populationen ermöglichen.