Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der In Vivo Performance von Krebs Nanomedizin

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das in vivo-Verhalten von Krebs-Nanomedikamenten auf systemischer, Gewebe-, Einzelzell- und subzellulärer Ebene bei tumortragenden, immunkompetenten Mäusen zu bewerten. Diese Methode kann helfen, die Schlüsselfrage im Bereich der Krebsnanomedizin zu beantworten. Wie reichern sich Nanomedikamente im Laufe der Zeit quantitativ in verschiedenen Geweben lebender Tiere an?

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass dieser duale Markierungsansatz eine In-vivo-Charakterisierung der Nanomedizin von der makroskopischen bis zur mikroskopischen Ebene ermöglicht. Wir wählen Liposomen als Beispiel, um unser Verfahren zu demonstrieren, da Liposomen derzeit im klinischen Einsatz sind und sie auch eine gängige Plattform für experimentelle Nanomedikamente sind. Um das Verfahren zu beginnen, lösen Sie 20 Milligramm einer Lipidmischung, die 0,1% Mol eines lipophilen kationischen Fluoreszenzfarbstoffs und zwei Milliliter Chloroform enthalten.

Anschließend trocknen Sie die Lipide mit einem Rotationsverdampfer. Fügen Sie den getrockneten Lipiden 20 Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung hinzu. Beschallen Sie die Mischung auf Eis mit einem 3,8-Millimeter-Sonden-Ultraschallgerät bei 30 Watt für 30 Minuten und halten Sie die Mischung durchgehend zwischen vier und 20 Grad Celsius.

Die resultierende liposomale Nanopartikelsuspension wird 10 Minuten lang bei 4.000 g zentrifugiert. Entsorgen Sie das Pellet und waschen Sie die Liposomen mit PBS unter Verwendung einer 100 Kilodalton MWCO-Zentrifugalfiltereinheit bei 4000 G. Übertragen Sie die konzentrierten Liposomen aus der oberen Kammer in ein neues Zentrifugenröhrchen. Die Liposomen können in PBS bis zu einer Woche im Kühlschrank aufbewahrt werden.

Führen Sie eine dynamische Lichtstreuung an einer Mischung aus 50 Mikrolitern der gereinigten Liposomensuspension und 950 Mikrolitern PBS durch. Messen Sie die Partikelgrößen und bestimmen Sie die Größenverteilung. Um mit der Radiomarkierung zu beginnen, geben Sie das benötigte Volumen an gereinigten Liposomen und PBS in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, um zwei Milligramm Lipide zu erhalten.

Hinzu kommt ein Millicurie Zurkonium-89-Oxalat für ein Endvolumen von 100 Mikrolitern und einen pH-Wert von 6,9 bis 7,1. Rühre die Mischung bei 37 Grad Celsius zwei Stunden lang um. Entfernen Sie dann freies Zirkonium-89 durch Zentrifugalfiltration mit einer 100-Kilodalton-Filtereinheit bei 4.000 G.Waschen Sie das Retentat dreimal mit sterilem PBS bei 4.000 G.Verdünnen Sie dann das Retentat zur Injektion auf etwa drei Mikrocurie pro Mikroliter.

Verwenden Sie eine Größenausschluss-HPLC in Kombination mit einem Strahlungsdetektor, um die radiochemische Reinheit der radioaktiv markierten Liposomen zu bestimmen. Wenn die radiochemische Reinheit unter 95 % liegt, formulieren Sie die Dosis neu. Verwenden Sie dynamische Lichtstreuung, um zu bestätigen, dass die Partikelgröße und die Verteilungswerte denen der nicht radioaktiv markierten Liposomen ähneln.

Um mit der Bildgebung zu beginnen, injizieren Sie etwa 300 Mikrocurie radioaktiv markierter Liposomen in die Schwanzvene einer fixierten Melanommaus. Verwenden Sie zwei Minuten nach der Injektion eine 28-Gauge-Insulinspritze, um 10 bis 20 Mikroliter Blut aus der Schwanzvene der Maus zu sammeln. Übertragen Sie die Blutprobe in ein vorgewogenes Zählröhrchen.

Wiegen Sie die Blutprobe und messen Sie die Aktivität mit einem Gamma-Zähler. Berechnen Sie die Radioaktivitätskonzentration als Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm. Eine Viertelstunde nach der Injektion entnehmen und messen Sie auf die gleiche Weise eine weitere Blutprobe.

Betäuben Sie dann die Maus durch Verabreichung von 2% Isofluran und Sauerstoff über einen Nasenkonus. Entnehmen und messen Sie eine dritte Blutprobe eine Stunde nach der Injektion. Lassen Sie die Maus dann in einem Erholungskäfig erholen, bis sie wieder normal mobil ist.

Entnehmen Sie vier, acht, 24 und 48 Stunden nach der Injektion weitere Proben. Lassen Sie die Maus sich zwischen den Injektionen vollständig erholen. Halten Sie die Maus in einem Raum unter, der für Tiere bestimmt ist, denen radioaktives Material verabreicht wurde.

24 oder 48 Stunden nach der Liposomeninjektion betäuben Sie die Maus mit 2% Isofluran und Sauerstoff. Platzieren Sie die Maus auf dem Bauch auf einem Mikro-PET-CT-Scannerbett für Kleintiere. Verabreichen Sie weiterhin 2%Isofluran und Sauerstoff über einen Nasenkonus.

Tragen Sie Tierarztsalbe auf die Augen der Maus auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Schieben Sie dann das Scannerbett in das Gerät. Führen Sie einen 15-minütigen statischen Ganzkörper-PET-Scan mit mindestens 50 Millionen zusammenfallenden Ereignissen mit einer Energie von 250 bis 700 Kiloelektronenvolt und einem Koinzidenz-Zeitfenster von sechs Nanosekunden durch.

Führen Sie als Nächstes einen fünfminütigen CT-Scan mit 120 Rotationsschritten über 220 Grad durch, mit ca. 145 Millisekunden pro Frame. Nach Abschluss des Scans töten Sie die Maus sofort durch Kohlendioxid-Erstickung. Bestätigen Sie den Tod, indem Sie die Pfote des Tieres kneifen und dann eine Gebärmutterhalsluxation durchführen.

Perfundieren Sie das Gewebe mit PBS, um Blut zu entnehmen, und entnehmen Sie die entsprechenden Gewebeproben. Wiegen Sie das gesammelte Gewebe und messen Sie dessen Aktivität. Berechnen Sie die radioaktiv markierte Liposomenakkumulation im Gewebe als Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm.

Lagern Sie das Tumorgewebe in kaltem PBS. Führen Sie ex vivo Durchflusszytometrie und Immunflureszenz-Bildgebung am entnommenen Tumorgewebe durch, um die Akkumulation in Bezug auf Zellpopulationen zu messen. Die PET/CT-Bildgebung von tumortragenden Mäusen, denen Nanopartikel injiziert wurden, die mit Zirkonium-89 markiert waren, zeigte 24 Stunden nach der Injektion eine signifikante Akkumulation von Nanapartikeln im Tumorgewebe.

Die Bluthalbwertszeit der Nanopartikel wurde auf etwa 10 Stunden bestimmt. Die Ex-vivo-Bioverteilungsmessungen 24 Stunden nach der Injektion stimmten mit den in vivo PET/CT-Messungen überein. Die Akkumulation von Nanopartikeln wurde dann auf Einzelzellebene mit Immunfärbetechniken untersucht.

Die Durchflusszytometrie zeigte, dass sich Nanopartikel bevorzugt in tumorassistierten Makrophagen anreichern. Die Immunflureszenz-Bildgebung von Tumorproben deutete ebenfalls auf ein spezifisches Targeting von Endothelzellen durch die Nanopartikel hin. Diese Technik kann Forschern helfen, vielversprechende Nanomedikamente für die klinische Umsetzung zu identifizieren.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei der radioaktiven Markierung von Nanomedikamenten ist es wichtig, hohe Standards bei der Qualitätskontrolle anzuwenden. Nach diesem Verfahren können andere Nanomedikamente wie Nanoemulsionen, polymere Nanopartikel, Mizellen, Antikörper und Antikörperfragmente markiert werden, um ihre in vivo-Leistung bei tumortragenden Mäusen zu messen.