Name: Isolierung und Anreicherung von Progenitor-Subsets Leber identifiziert durch eine neuartige Oberflächenmarkerkombination (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von Leberprogenitorzellen mit hoher Reinheit durch Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Analyse heterogener Zellpopulationen bei Leberverletzungen.

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Diese Arbeit wurde von der Alexander von Humboldt-Stiftung Sofja Kovalevskaja-Preis an VLK unterstützt.

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</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Leberentzündung und Verletzung verschiedener Herkunft auslösen regenerative Prozesse in der Leber , die durch zwei Vorläuferzellexpansion und Aktivierung begleitet werden, 3. Diese Lebervorläuferzellen besitzen Zelleigenschaften stammen und wahrscheinlich eine bedeutende Rolle in der Pathomechanismus verschiedener Lebererkrankungen spielen. Die Heterogenität der Leber Vorläuferzellen ist seit langem vorgeschlagen worden. Die Neubewer...

Leberregeneration wird meist mit der Selbsterneuerungskapazität von Hepatozyten verbunden. Dennoch treten chronische Leberverletzungen mit Progenitorzellen Aktivierung und Expansion, die mit ihrer Fähigkeit in Verbindung gebracht wurden in Hepatozyten und Cholangiozyten 1, 2, 3, 4 zu unterscheiden. Dies ist besonders relevant, da während der chronischen Verletzungen, Hepatozytenproliferation nicht wirksam ist. Trotz mehrerer Studien genetische Tracing Vorläuferzellen Targeting, ihre Rolle bei der Leberregeneration bleibt umstritten 5, 6, 7, 8. Darüber hinaus hat die Aktivierung von Vorläuferzellen wurden zu einer erhöhten fibrotische Reaktion in der Leber verbunden sind , die während Verletzungen Fragen über ihre genaue Rolle 9 wirft, 10. Die heterogene Natur des Vorläuferzellkammer ist seit langem von Genexpressionsstudien vorgeschlagen worden , die Vorläuferzellen isoliert eine einzelne Oberflächenmarker exprimieren Mikrodissektion oder Zellsortierung-basierten Methoden 1, 11. Tatsächlich, die vor kurzem eine neuartige Oberflächenmarker Kombination mit gp38 (podoplanin) eindeutig vorherige einzelne Marker der Vorläuferzellen zu verschiedenen Untergruppen 12 verbunden. Wichtig ist , dass nur diese Teilmengen nicht in ihrer Oberflächenmarker Ausdruck unterschieden , sondern auch funktionelle Veränderungen bei Verletzungen 12 ausgestellt. Mehrere Tiermodelle wurden verwendet, um Vorläuferzellaktivierung und die Leberregeneration untersuchen. Es scheint , dass die verschiedenen Arten von Verletzungen , die Aktivierung verschiedener Untergruppen von Vorläuferzellen 12 zu fördern. Dies könnte die ph erklärenenotypic Divergenz der ductularen Reaktion beim Menschen beobachteten 4. Somit sind die komplexen phänotypische und funktionelle Analysen von Vorläuferzellen Schwenk ihre Rolle bei Verletzungen und die wahre Bedeutung der ductularen Reaktion in Lebererkrankungen zu verstehen. Neben Oberflächenmarker Kombinationen, erschweren die entscheidenden Unterschiede in der Zellisolierung Protokolle weiter die Basis Schlussfolgerungen zu früheren Studien 2. Eine wesentliche Menge von Studien angesprochen , die Rolle von Vorläuferzellen , die in ihrem Isolierungsprotokoll (zB Leber Dissoziation (Enzymkombination und der Dauer des Prozesses), Dichte Medium und Zentrifugation Geschwindigkeit) stark unterscheiden 2. Eine optimierte Isolationstechnik, eine bessere Rentabilität für seltene Zellpopulationen und reflektierende Teilmenge Zusammensetzung, wurde vor kurzem 12 entwickelt und veröffentlicht. Das Ziel dieses Artikels ist es, eine det zu schaffenailed Protokoll dieser Leberzellisolierungsverfahren und der Teilmenge Analyse für die korrekte Wiedergabe der Technik zu ermöglichen. Zusätzlich weist das Protokoll einen Vergleich mit dem vorherigen Isolierungsverfahren, die Unterschiede zu zeigen, im Vergleich zu dem neuen Protokoll.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>phenolrotfrei DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase</td><td>P Sigma-Aldrich</td><td>11249002001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse-I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>17105041</tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025-050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>1%ige Stammlösung</td></tr><tr><td>herstellen 10% BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Spüllösung</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>0,5 % (v/v) BSA zugeben und auf Eis lagern</td></tr><tr><td>Phenolrotfreies DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1145</td><td></td></tr><tr><td>Zählung der Kügelchen Count Bright</td><td>Life Technologies</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>PI</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td></td></tr><tr><td>FcR Blockierungsreagenz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31 Mikrobeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-418</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>Kit zur Entfernung toter Zellen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Biotin MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>CD64 Gereinigtes</td><td>BioLegend</td><td>139302</td><td>Verdünnung: 1:100</td></tr><tr><td>CD16/32 Aufgereinigtes</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>Verdünnung: 1:100</td></tr><tr><td>CD45 APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td></td><td>103116 Verdünnung: 1:200, markiert hämatopoetische Zellen</td></tr><tr><td>CD31 Biotin</td><td>BioLegend 102504</td><td></td><td>Verdünnung: 1:200, markiert Endothelzellen</td></tr><tr><td>ASGPR1 Aufgereinigtes</td><td>Bio-Techne</td><td>AF2755-SP</td><td>Verdünnung: 1:100, markiert Hepatozyten</td></tr><tr><td>Podoplanin APC</td><td>BioLegend</td><td>127410</td><td>Verdünnung: 1:1.400, markiert Vorläuferzellen</td></tr><tr><td>Podoplanin Biotin</td><td>BioLegend</td><td>127404</td><td>Verdünnung: 1:1.400</td></tr><tr><td>CD133 PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-210</td><td>verwenden 3 & Mikro; L, markiert Vorläuferzellen</td></tr><tr><td>CD133 Biotin</td><td>BioLegend 141206</td><td></td><td>Verdünnung: 1:100</td></tr><tr><td>CD34 Biotin</td><td>eBioScience</td><td>13-0341-81</td><td>Verdünnung: 1:100</td></tr><tr><td>CD90.2 Pacific Blue</td><td>BioLegend 140306</td><td></td><td>Verdünnung: 1:800</td></tr><tr><td>CD157</td><td>PE BioLegend 140203</td><td></td><td>Verdünnung: 1:600</td></tr><tr><td>EpCAM Brilliant Violet 421</td><td>BioLegend</td><td>118225</td><td>Verdünnung: 1:100</td></tr><tr><td>Sca-1 Biotin</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-101-885</td><td>verwenden 10 & Mikro; L</td></tr><tr><td>Maus IgG2b, &kappa; PE</td><td>BioLegend</td><td>400311</td><td></td></tr><tr><td>Ratte IgG1 PE</td><td>BioLegend</td><td>400407</td><td></td></tr><tr><td>Ratte IgG2b, &kappa; APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>400624</td><td></td></tr><tr><td>Ratte IgG2a, &kappa; Biotin</td><td>BioLegend</td><td>400504</td><td></td></tr><tr><td>Ratte IgG2a, &kappa; Brilliant Violet 421</td><td>BioLegend</td><td>400535</td><td></td></tr><tr><td>Syrischer Hamster IgG APC</td><td>BioLegend</td><td>402012</td><td></td></tr><tr><td>Syrischer Hamster IgG Biotin</td><td>BioLegend</td><td>402004</td><td></td></tr><tr><td>Normal Ziege IgG Kontrolle Gereinigt</td><td>Bio-Techne</td><td>AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Ziegen IgG Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11055</td><td>Verdünnung: 1:800</td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 405</td><td>Life Technologies</td><td>S32351</td><td>Verdünnung: 1:400</td></tr><tr><td>100 &Mikro; m Filtergewebe</td><td>A. Hartenstein</td><td>PAS3</td><td></td></tr><tr><td>LS Säule</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Pro Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>FACS AriaTMIII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva sofware</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen Rundbodenröhrchen</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy plus Mini-Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>RLT Lysepuffer ist im Lieferumfang enthalten</td></tr></tbody></table>

isolierung und anreicherung von progenitor-subsets leber identifiziert durch eine neuartige oberflächenmarkerkombination

Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination

Bei chronischen Leberschädigungen, erweitern Vorläuferzellen in einem Prozess ductularen Reaktion genannt, die auch das Auftreten von entzündlichen Zellinfiltrat und epithelialen Zellaktivierung zur Folge hat. Die Vorläuferzellpopulation während eines solchen Entzündungsreaktionen hat meist worden Markern einzigen Oberfläche untersucht, entweder durch die histologische Analyse oder mittels Durchflusszytometrie-basierte Techniken. Allerdings neuartige Oberflächenmarker verschiedene funktionell unterschiedliche Teilmengen innerhalb der Leber Vorläufer identifiziert / Stammzellfach. Die hier vorgestellten Verfahren beschreibt die Isolierung und detaillierte Durchflusscytometrieanalyse von Vorläuferuntergruppen neuartige Oberflächenmarker-Kombinationen. Darüber hinaus zeigt es, wie die verschiedene Vorläuferzelluntergruppen mit hoher Reinheit mit automatisierten magnetischen und FACS-Sortierung-basierten Methoden isoliert werden. Wichtig ermöglicht, neuartige und vereinfachte enzymatische Dissoziation der Leber für die Isolierung dieser seltenen Zellpopulationen mit hoher Rentabilitätdass überlegen ist im Vergleich zu anderen bestehenden Methoden. Dies ist besonders relevant für die weitere Vorläuferzellen in vitro zu studieren oder hochwertige RNA zur Isolierung des Genexpressionsprofil zu analysieren.

Das Verfahren hier für die Verdauung der Leber präsentiert ein neuartiges Gemisch aus Enzymen führt zu einer Einzelzellsuspension mit parenchymalen und nicht-parenchymalen Leberzellen (1 und 2a) verwendet wird . Nach dem ACK-Lyse von roten Blutzellen ist die direkte Durchflusszytometrie - Analyse der Einzelzellsuspension möglich (1 und 2). Die Gating - Strategie beinhaltet den Ausschluss von Dubletten und toten Zellen <s...

Leberschädigungen durch Vorläuferzellexpansion begleitet, die eine heterogene Zellpopulation darstellt. Neuartige Klassifizierung dieses Zellkompartiment ermöglicht die Unterscheidung von mehreren Untergruppen. Das hier beschriebene Verfahren zeigt die Durchflusszytometrie-Analyse und hoher Reinheit Isolierung verschiedener Untermengen, die für die weiteren Tests verwendet werden kann.

Isolierung und Anreicherung von Progenitor-Subsets Leber identifiziert durch eine neuartige Oberflächenmarkerkombination

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular ...

Die allgemeinen Ziele dieses Leberverdauungsprotokolls bestehen darin, die verschiedenen Teilpopulationen von Leberprogenitorzellen mittels Durchflusszytometrie zu bewerten und diese Zellen mit hoher Reinheit unter Verwendung eines neuartigen Cocktails von Oberflächenmarkern für weitere nachgeschaltete Analysen zu isolieren. Diese Methode kann helfen, verschiedene Fragen zur Biologie von Leberprogenitorzellen zu beantworten, beispielsweise, welche spezifischen Merkmale die einzelnen Teilpopulationen aufweisen und welche Rolle sie bei Leberschädigungen spielen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Isolierung von Progenitorzellen mit hoher Reinheit und Vitalität ermöglicht, was für die in-vitro-Analyse von Bedeutung ist.Obwohl diese Verdauungstechnik Einblicke in die Biologie von Vorläuferzellen bietet, kann sie tatsächlich zur Isolierung hämatopoetischer und endothelialer Zellpopulationen verwendet werden. Um eine Einzelzellpräparation aus einer Mausleber herzustellen, überführen Sie die Leberlappen auf eine trockene Petrischale und schneiden Sie das Gewebe mit einem Skalpell in etwa zwei Millimeter große, homogene Würfel. Überführen Sie die Stücke in jeweils zw

isolation-enrichment-liver-progenitor-subsets-identified-novel

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Hier beschreiben wir die Isolierung von CD133 exprimierenden Leber-Stammzellen und Krebsstammzellen aus ganz murinen Leber, ein Prozess, der Gewebe Verdauung, Anreicherung von Zellen und Durchflusszytometrie Isolierung erfordert. Wir gehören Methoden für fortgeschrittene Einzelzellisolierung und klonalen Expansion.

Isolierung von CD133 + Leber-Stammzellen für die klonale Expansion

Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Eine Technik zur Isolierung menschlicher Hepatozyten und nicht-parenchymaler Leberzellen vom selben Spender wird beschrieben. Die unterschiedlichen Leberzelltypen bilden die Grundlage für funktionelle Lebermodelle und Tissue Engineering. Diese neue Methode zielt darauf ab, Leberzellen in einer hohen Ausbeute und Lebensfähigkeit zu isolieren.

Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

Wir zeigen, wie zu identifizieren und zu isolieren 6 Teilmengen der myeloischen Vorläuferzellen aus murinen Knochenmark mit einer Kombination von magnetischen und Fluoreszenz (MACS und FACS) sortieren. Dieses Protokoll kann für in-vitro- Kultur-Assays (Methylcellulose oder Flüssigkeit Kulturen), in Vivo Adoptiv Transfer Experimente und RNS/Protein-Analysen verwendet werden.

Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

Dieses Protokoll beschreibt eine monolayer, serumfreie Methode zur effizienten Erzeugung von Hepatozyten-ähnlichen Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) in 18 Tagen. Dies beinhaltet sechs Schritte, da hPSCs sequenziell in zwischengeschaltete Zelltypen wie den Primitivstreifen, das definitive Endoderm, das hintere Vorgut und die Leberknospenvorläufer differenzieren, bevor hepatozytenähnliche Zellen gebildet werden.

Effiziente Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in Leberzellen

Das Ziel dieses Artikels ist es, einen standardisierten Ansatz zur Induktion der Differenzierung des menschlichen Lebervorläufers von pluripotenten Stammzellen bereitzustellen. Die Entwicklung dieses Verfahrens mit gebrauchsfertigen Medienformulierungen bietet dem Anwender ein einfaches System zur Erzeugung menschlicher Leberzellen für die biomedizinische Forschung und Translation.

Hepatischer Vorläufer aus pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines definierten Differenzierungssystems

Dieser Artikel bietet eine detaillierte Methodik für Gewebedissoziation und zelluläre Fraktionierungsansätze, die die Anreicherung lebensfähiger Epithelzellen aus proximalen und distalen Regionen der menschlichen Lunge ermöglichen. Hierin werden diese Ansätze für die funktionelle Analyse von Lungenepithel-Vorläuferzellen durch den Einsatz von 3D-Organoid-Kulturmodellen angewendet.

Isolierung und Anreicherung menschlicher Lungenepithel-Vorläuferzellen für Organoidkulturen

Hier skizzieren und demonstrieren wir ein Protokoll für die Isolierung primärer Lebersinuszellen (LSEC) in der Mausleber. Das Protokoll basiert auf der Perfusion der Leberkollagenase, der nichtparenchymalen Zellreinigung durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und der Auswahl magnetischer CD146-Perlen. Wir phänotypisieren und charakterisieren diese isolierten LSECs auch mittels Durchflusszytometrie und Rasterelektronenmikroskopie.

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Lipidbeladene Hepatozyten sind der Leberregeneration inhärent, gehen aber normalerweise bei der Zentrifugation mit Dichtegradienten verloren. Hier stellen wir ein optimiertes Zellisolationsprotokoll vor, das steatotische Hepatozyten beibehält, was repräsentative Populationen von regenerierenden Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen ergibt.

Isolierung regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen

Hier stellen wir eine nicht-genetische Methode zur Erzeugung humaner autologer Lebersphäroide unter Verwendung mononukleärer Zellen vor, die aus peripherem Blut im stationären Zustand isoliert wurden.

Humane Lebersphäroide aus peripherem Blut für Studien zu Lebererkrankungen

Hepatozyten, die aus pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, können durch Zellsortierung aufgereinigt werden, wobei eine Kombination aus mitochondrialer und aktivierter Leukozytenzelladhäsionsmolekülfärbung (ALCAM, auch bekannt als CD166) verwendet wird.

Anwendung der Färbung lebender Mitochondrien bei der Zellsortierung zur Aufreinigung von Hepatozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden

Erfahren Sie die Isolierung von Leberprogenitorzellen mit hoher Reinheit durch Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Analyse heterogener Zellpopulationen bei Leberverletzungen.

Isolierung und Anreicherung von Progenitor-Subsets Leber identifiziert durch eine neuartige Oberflächenmarkerkombination

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