Isolierung und Anreicherung von Progenitor-Subsets Leber identifiziert durch eine neuartige Oberflächenmarkerkombination

Die allgemeinen Ziele dieses Leberverdauungsprotokolls bestehen darin, die verschiedenen Teilpopulationen von Leberprogenitorzellen mittels Durchflusszytometrie zu bewerten und diese Zellen mit hoher Reinheit unter Verwendung eines neuartigen Cocktails von Oberflächenmarkern für weitere nachgeschaltete Analysen zu isolieren. Diese Methode kann helfen, verschiedene Fragen zur Biologie von Leberprogenitorzellen zu beantworten, beispielsweise, welche spezifischen Merkmale die einzelnen Teilpopulationen aufweisen und welche Rolle sie bei Leberschädigungen spielen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Isolierung von Progenitorzellen mit hoher Reinheit und Vitalität ermöglicht, was für die in-vitro-Analyse von Bedeutung ist.

Obwohl diese Verdauungstechnik Einblicke in die Biologie von Vorläuferzellen bietet, kann sie tatsächlich zur Isolierung hämatopoetischer und endothelialer Zellpopulationen verwendet werden. Um eine Einzelzellpräparation aus einer Mausleber herzustellen, überführen Sie die Leberlappen auf eine trockene Petrischale und schneiden Sie das Gewebe mit einem Skalpell in etwa zwei Millimeter große, homogene Würfel. Überführen Sie die Stücke in jeweils zwei 15-Milliliter-Konischzentrifugenröhrchen pro Leber, die jeweils 2,5 Milliliter Verdauungspuffer enthalten.

Und legen Sie die Proben in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius mit sanftem Schütteln nach fünf und zehn Minuten. Nach 15 Minuten der Verdauung verwenden Sie eine 1.000-Mikroliter-Pipette mit abgeschnittenem Spitzenende, um die Leberstücke vorsichtig aufzutitrieren. Danach bringen Sie die Röhrchen erneut ins Wasserbad zurück und lassen die Stücke zwei Minuten lang absinken.

Als Nächstes filtrieren Sie zwei Aliquots von jeweils etwa 700 Mikroliter des Überstandes durch einen 100-Mikron-Filter, der zuvor mit 800 Mikrolitern Sammel-Puffer benetzt wurde. Ersetzen Sie den entfernten Überstand durch frischen Verdauungspuffer. Wenn das Lebergewebe nicht mehr sichtbar ist, leiten Sie den gesamten Überstand aus den Verdauungsgefäßen durch den Filter.

Und sammeln Sie alle Zellen durch Zentrifugation ein. Resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter Ammoniumchlorid-Kalium-Lysispuffer bei Raumtemperatur und stoppen Sie die Lyse nach einer Minute mit fünf Millilitern frischem Sammel-Puffer. Sammeln Sie die Zellen durch eine weitere Zentrifugation ein.

Danach vorsichtig den Überstand abziehen, ohne das lockere Pellet zu stören. Die Zellen anschließend in vier Milliliter frischem Sammel-Puffer auf Eis resuspendieren. Um die Zellzahl der Leberprobe mittels Durchflusszytometrie zu bestimmen, zunächst 20 Mikroliter der Leberzell-Suspension mit 174 Mikrolitern PBS und sechs Mikrolitern Propidiumjodid in einem 1,5-Milliliter-Polystyrolröhrchen mischen.

Gegeben Sie Zähltropfen hinzu, die eine Zellquantifizierung ermöglichen, und geben Sie die Mischung aus Tropfen und Zellen in den Durchflusszytometer. Gehen Sie auf die Seitstreuung mittels Vorwärtsstreu-Parametern, um Verunreinigungen auszuschließen. Schließen Sie Doppelzellen über eine Vorwärtsstreu-Höhe-gegen-Vorwärtsstreu-Fläche-Torung sowie propidiumiodid-positive tote Zellen aus.

Dann eine 30-Mikroliter-Probe auf den Durchflusszytometer auftragen und die Ereignisse aufzeichnen. Um Leberzellen für die durchflusszytometrische Analyse der Vorläufer-Subpopulationen zu färben, 2x10^5 Aliquote der Zellen in 1,5-Milliliter-Reaktionsgefäße überführen. Und die Zellen durch Zentrifugation pelletieren.

Suspendieren Sie die Pellets in Fc-Block und inkubieren Sie fünf Minuten lang auf Eis. Geben Sie anschließend 50 µL der gewünschten Antikörperkocktail für die Zelloberflächenfärbung zu den entsprechenden Röhrchen und inkubieren Sie 20 Minuten lang auf Eis, geschützt vor Licht. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Proben mit 400 µL Färbepuffer pro Probe.

Und resuspendieren Sie die Pellets in 100 Mikrolitern der geeigneten sekundären Antikörper-Lösung für 20 Minuten auf Eis, geschützt vor Licht. Anschließend waschen Sie die Zellen mit weiteren 400 Mikrolitern Färbe-Puffer. Und resuspendieren Sie die Pellets in 300 Mikrolitern Färbe-Puffer, der Propidiumiodid enthält.

Messen Sie die Probe mit einem Durchflusszytometer. Um die Population der Vorläuferzellen durch magnetische Mikroperlen-basierte Trennung anzureichern, überführen Sie 1,5–2 × 10⁶ Zellen in die entsprechende Anzahl an 15-Milliliter-Kegelrohren und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie die Pellets in 400 µL HBSS, ergänzt mit BSA.

Und geben Sie 40 µL Anti-CD31-Mikroperlen und 30 µL Anti-CD45-Mikroperlen hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Waschen Sie anschließend die Zellen mit fünf Millilitern HBSS plus BSA. Und resuspendieren Sie die Pellets in 100 µL Totzellentfernungsmikroperlen für eine 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur.

Während die Zellen inkubiert werden, werden je Leber eine passend dimensionierte Säule für die positive Selektion mit drei Milliliter HBSS plus BSA vorgewaschen. Anschließend werden den Zellen 900 Mikroliter HBSS plus BSA zugesetzt und die Zellen durch eine 100-Mikrometer-Polyamid-Filtermembran filtriert. Die gefilterten, mit Perlen inkubierten Zellen werden dann auf die Säulen aufgetragen, wobei das Eluat im Zentrifugenröhrchen gesammelt wird.

Wenn alle Zellen durch die Säule geflossen sind, spülen Sie die Säulen dreimal mit je drei Milliliter HBSS plus BSA. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikroliter Spülpuffer und Fc-Block. Sammeln Sie die Zellpellets aus vier bis sechs Lebern oder bis zu weniger als 1×10⁶ negativ selektierten Zellen.

Nach fünf Minuten die Zellen mit biotinyliertem anti-GP38-Antikörper für 10 Minuten auf Eis inkubieren. Am Ende der Inkubation die Zellen durch Zentrifugation sammeln und in 400 Mikrolitern Spülpuffer sowie fünf Mikrolitern Anti-Biotin-Mikroperlen resuspendieren. Nach 15 Minuten bei vier Grad Celsius die Zellen unverzüglich mit fünf Millilitern Spülpuffer waschen.

Und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter frischem Spülpuffer. Stellen Sie die resuspendierten Zellen auf einen gekühlten 15er-Rack und beginnen Sie die automatische magnetische Trennung. Zentrifugieren Sie anschließend den Durchfluss und resuspendieren Sie die Pellets in der geeigneten Lösung für die geplante nachgeschaltete experimentelle Analyse.

Die Zellen, die negativ für CD45, CD31 und Asialoglykoprotein-Ein-Rezeptor sind, werden selektiert, um Leberprogenitorzellen anzureichern, die anschließend anhand ihres Glykoprotein-38- und CD133-Expressionsprofils gruppiert werden können. Die gp38-positiven CD133-positiven sowie die gp38-negativen CD133-positiven Zellen stellen die häufigsten Zellpopulationen unter den CD45-negativen, CD31-negativen und ASGPR1-negativen Zellen in der gesunden Leber erwachsener Mäuse dar und weisen offensichtliche Unterschiede in der Expression verschiedener Oberflächenmarker auf, die zuvor mit Progenitorzellen assoziiert wurden. Die magnetische Isolierung dieser Progenitorzellen mittels Mikroperlen führt, wie gerade gezeigt, zu einer Reinheit von über 90 % der Leberzellen bei hoher Vitalität.

Bei dem Versuch, diese seltenen Zellen zu isolieren, ist es wichtig, die während der Leberverdauungsschritte verwendeten Enzyme zu berücksichtigen, da verschiedene Enzyme gezielt bestimmte Vorläufersubpopulationen hervorbringen können und die Expression von CD133 stark reduzieren können. Es ist entscheidend, daran zu denken, dass die Zellreinheit und -ausbeute von der schonenden Herstellung der Einzelzell-Suspensionen der Leber abhängen. Eine hohe Menge an zellulärem Trümmermaterial und Kontamination durch absterbende Zellen kann den Erfolg dieses Protokolls negativ beeinflussen.