Isolierung und Anreicherung von Progenitor-Subsets Leber identifiziert durch eine neuartige Oberflächenmarkerkombination

Das übergeordnete Ziel dieses Leberverdauungsprotokolls besteht darin, die verschiedenen Untergruppen der Lebervorläufer mittels Durchflusszytometrie zu beurteilen und diese Zellen unter Verwendung eines neuartigen Oberflächenmarker-Cocktails für die weitere nachgelagerte Analyse in hoher Reinheit zu isolieren. Diese Methode kann helfen, verschiedene Fragen zur Biologie von Lebervorläuferzellen zu beantworten, z.B. was sind ihre spezifischen Merkmale und was sind ihre entfernten Ursachen bei Leberschädigungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Isolierung von Vorläuferzellen für eine hohe Reinheit und Lebensfähigkeit ermöglicht, was für die In-vitro-Analyse wichtig ist.

Obwohl diese Verdauungstechnik Einblicke in die Biologie der Vorläuferzellen bietet, kann sie tatsächlich für die Isolierung von hämatopoetischen und endothelialen Zellpopulationen eingesetzt werden. Um ein Einzelzellpräparat aus einer Mausleber herzustellen, geben Sie die Lappen auf eine getrocknete Petrischale und schneiden Sie das Gewebe mit einem Skalpell in etwa zwei Millimeter große, homogene Würfel. Füllen Sie die Stücke in zwei konische 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen pro Leber um, die jeweils 2,5 Milliliter Aufschlusspuffer enthalten.

Und legen Sie die Proben in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad unter leichtem Schütteln nach fünf und 10 Minuten. Verwenden Sie nach 15 Minuten Verdauung eine 1.000-Mikroliter-Pipette mit einer abgeschnittenen Spitze, um die Leberstücke sanft zu titrieren. Stellen Sie dann die Schläuche wieder in das Bad und lassen Sie die Stücke zwei Minuten lang absetzen.

Als nächstes filtrieren zwei etwa 700 Mikroliter große Aliquots des Überstands durch ein 100 Mikron-Sieb, das mit 800 Mikrolitern Auffangpuffer vorbefeuchtet wird. Und ersetzen Sie den entfernten Überstand durch frischen Aufschlusspuffer. Wenn das Lebergewebe nicht mehr sichtbar ist, leiten Sie den gesamten Überstand aus den Verdauungsröhrchen durch den Filter.

Und sammeln Sie alle Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter Ammoniumchlorid-Kalium-Lysepuffer bei Raumtemperatur und stoppen Sie die Lyse mit fünf Millilitern frischem Auffangpuffer nach einer Minute. Sammeln Sie die Zellen mit einer weiteren Zentrifugation.

Saugen Sie dann den Überstand vorsichtig an, ohne das lose Pellet zu stören. Und resuspendieren Sie die Zellen in vier Millilitern frischem Sammelpuffer auf Eis. Um die Zellzahlen der Leberproben mittels Durchflusszytometrie zu bestimmen, mischen Sie zunächst 20 Mikroliter der Leberzellsuspension mit 174 Mikrolitern PBS in einem 1,5-Milliliter-Polystyrolröhrchen und sechs Mikrolitern Propidiumjod.

Fügen Sie Zählperlen hinzu, die eine Zellquantifizierung ermöglichen, und laden Sie die Kügelchen und das Zellgemisch auf das Durchflusszytometer. Das Tor an der Seite wird durch Vorwärtsstreuungsparameter gestreut, um Schmutz zu vermeiden. Ausschluss der Dubletten über ein Forward Scatter Height versus Forward Scatter Area Gate und die Propidium-Jod-positiven toten Zellen.

Laden Sie dann eine 30-Mikroliter-Probe auf das Durchflusszytometer und zeichnen Sie die Ereignisse auf. Um die Leberzellen für die durchflusszytometrische Analyse der Vorläufer-Untergruppen zu färben, werden 2x10^5 Aliquots der Zellen in 1,5 Milliliter Reaktionsröhrchen überführt. Und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation.

Suspendieren Sie die Pellets im Fc-Block für eine fünfminütige Inkubation auf Eis. Geben Sie dann 50 Mikroliter des Antikörper-Cocktails zur Zelloberflächenfärbung in die entsprechenden Röhrchen für eine 20-minütige Inkubation auf lichtgeschütztem Eis. Waschen Sie die Proben am Ende der Inkubation in 400 Mikrolitern Färbepuffer pro Probe.

Und resuspendieren Sie die Pellets in 100 Mikrolitern des entsprechenden Sekundärantikörper-Cocktails für 20 Minuten auf lichtgeschütztem Eis. Waschen Sie dann die Zellen mit weiteren 400 Mikrolitern Färbepuffer. Und resuspendieren Sie die Pellets in 300 Mikrolitern Färbepuffer, der Propidiumiodid enthält.

Messen Sie die Probe mit einem Durchflusszytometer. Um die Vorläuferzellpopulation durch magnetische Mikrokügelchen-basierte Trennung anzureichern, werden 1,5-2x10^6 Zellen in die entsprechende Anzahl von konischen 15-Milliliter-Röhrchen überführt und die Zellen durch Zentrifugation gesammelt. Resuspendieren Sie die Pellets in 400 Mikrolitern HBSS, die mit BSA ergänzt sind.

Und fügen Sie 40 Mikroliter Anti-CD31-Mikrokügelchen und 30 Mikroliter Anti-CD45-Mikrokügelchen für eine 15-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius hinzu. Als nächstes waschen Sie die Zellen in fünf Millilitern HBSS plus BSA. Und resuspendieren Sie die Pellets in 100 Mikrolitern Kügelchen zur Entfernung abgestorbener Zellen für eine 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur.

Während die Zellen inkubieren, äquilibrieren Sie eine positive Selektionssäule geeigneter Größe pro Leber mit drei Millilitern HBSS plus BSA. Geben Sie dann 900 Mikroliter HBSS plus BSA zu den Zellen und filtern Sie die Zellen durch ein 100 Mikron Polyamid-Filternetz. Laden Sie die gefilterten, mit Kügelchen inkubierten Zellen auf die Säulen, die das Eluat im Zentrifugenröhrchen sammeln.

Wenn alle Zellen durch die Säule geflossen sind, waschen Sie die Säulen dreimal mit drei Millilitern HBSS plus BSA. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikrolitern Spülpuffer und Fc-Block. Ziehen Sie die Zellpellets aus vier bis sechs Lebern oder bis zu weniger als 1x10^6 negativ selektierten Zellen.

Nach fünf Minuten markieren Sie die Zellen 10 Minuten lang auf Eis mit anti-GP38-biotinylierten Antikörpern. Am Ende der Inkubation werden die Zellen durch Zentrifugation zur Resuspension in 400 Mikrolitern Spülpuffer und fünf Mikrolitern Anti-Biotin-Mikrokügelchen gesammelt. Nach 15 Minuten bei vier Grad Celsius waschen Sie die Zellen sofort in fünf Millilitern Spülpuffer.

Und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter frischem Spülpuffer. Legen Sie die resuspendierten Zellen auf ein gekühltes 15-Gestell und starten Sie die automatische magnetische Trennung. Zentrifugieren Sie dann den Durchfluss und resuspendieren Sie die Pellets in der entsprechenden Lösung für die geplante nachgelagerte experimentelle Analyse.

Gating auf den Zellen, die negativ für CD45, CD31 und Asialoglycoprotein sind, selektiert ein Rezeptor für die Vorläuferzellen der Leber, die dann nach ihrer Glykoprotein-38- und CD133-Expression gruppiert werden können. Die gp38-positiven CD133-positiven und die gp38-negativen CD133-positiven Zellen stellen die am häufigsten vorkommenden Zellpopulationen unter den CD45-negativen CD31-negativen ASGPR1-negativen Zellen in der gesunden adulten Mausleber dar, mit offensichtlichen Unterschieden in ihrer Expression verschiedener Oberflächenmarker, die zuvor mit Vorläuferzellen assoziiert waren. Die magnetisch-mikrokügelchenbasierte Isolierung dieser Vorläuferzellen, wie gerade gezeigt, führt zu einer Reinheit von über 90 % der Leberzellen mit einem hohen Grad an Lebensfähigkeit.

Bei dem Versuch, diese ungewöhnlichen Zellen zu isolieren, ist es wichtig, die Enzyme zu berücksichtigen, die während der Leberverdauungsschritte verwendet werden, da verschiedene Enzyme bevorzugt spezifische Vorläufer-Subpopulationen ergeben und die CD133-Expressionsniveaus stark reduzieren können. Es ist wichtig zu bedenken, dass die Zellreinheit und Ausbeute von der schonenden Aufbereitung der Lebereinzelzellsuspensionen abhängen. Und dass sich die hohe Menge an Zelltrümmern und die Kontamination absterbender Zellen negativ auf den Erfolg dieses Protokolls auswirken kann.