Name: Histologische Analysen der akuten alkoholischen Leberverletzung in Zebrafisch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Lernen Sie die histologische Analyse akuter alkoholischer Leberverletzungen bei Zebrafischlarven mit Ethanolbehandlung kennen. Diese Methode ermöglicht robuste Reaktionen und verbesserte Gewebestruktur für die Erforschung alkoholbedingter Lebererkrankungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren möchten Dr. Katy Murray im Zebrafish International Resource Center anerkennen; Dr. Stacey Huppert und Kari Huppert bei CCHMC, für ihre hilfreiche Beratung zum Protokoll; Und CCHMC Veterinärdienst, für die Fischpflege. Diese Arbeit wurde von NIH Grant R00AA020514 und einem Forschungsstipendium vom Zentrum für pädiatrische Genomik bei CCHMC (nach CY) unterstützt. Es wurde auch teilweise unterstützt von NIH grant P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) der Verdauungsstudie Research Core Center in Cincinnati.

<ol><li>Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYoon%2C+YH+%22Surveillance+report+%23100%3A+Liver+cirrhosis+mortality+in+the+United+States%3A+National%2C+State%2C+and+regional+trends%22">Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends</a>. , National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism. Bethesda, MD. 2000-2011 (2014).</li>
<li>Singal, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+frequency+and+outcomes+of+liver+transplantation+based+on+etiology+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease.</a> Transplantation. 95 (5), 755-760 (2013).</li>
<li>Louvet, A., Mathurin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcoholic+liver+disease%3A+mechanisms+of+injury+and+targeted+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 231-242 (2015).</li>
<li>Ki, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-22+treatment+ameliorates+alcoholic+liver+injury+in+a+murine+model+of+chronic-binge+ethanol+feeding%3A+role+of+signal+transducer+and+activator+of+transcription+3%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3.</a> Hepatology. 52 (4), 1291-1300 (2010).</li>
<li>Tsuchiya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstrain+differences+in+liver+injury+and+one-carbon+metabolism+in+alcohol-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice.</a> Hepatology. 56 (1), 130-139 (2012).</li>
<li>Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+ethanol+exposure+potentiates+lipopolysaccharide+liver+injury+despite+inhibiting+Jun+N-terminal+kinase+and+caspase+3+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation.</a> J Biol Chem. 277 (15), 13037-13044 (2002).</li>
<li>Leo, M. A., Lieber, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+fibrosis+after+long-term+administration+of+ethanol+and+moderate+vitamin+A+supplementation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat.</a> Hepatology. 3 (1), 1-11 (1983).</li>
<li>Tsukamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+and+progressive+steatosis+and+focal+necrosis+in+rat+liver+induced+by+continuous+intragastric+infusion+of+ethanol+and+low+fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet.</a> Hepatology. 5 (2), 224-232 (1985).</li>
<li>Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intragastric+ethanol+infusion+model+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Intragastric ethanol infusion model in rodents.</a> Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).</li>
<li>Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drinks+like+a+fish%3A+using+zebrafish+to+understand+alcoholic+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease.</a> Alcohol Clin Exp Res. 35 (5), 826-829 (2011).</li>
<li>Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+hepatic+dysfunction+parameters+in+two+models+of+fatty+liver+disease+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae.</a> Zebrafish. 10 (2), 199-210 (2013).</li>
<li>Lin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Animal+Model+for+Alcoholic+Liver+Disease+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish.</a> Zebrafish. , (2015).</li>
<li>Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+steatosis+in+response+to+acute+alcohol+exposure+in+zebrafish+requires+sterol+regulatory+element+binding+protein+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation.</a> Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).</li>
<li>Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+metabolism+and+oxidative+stress+are+required+for+unfolded+protein+response+activation+and+steatosis+in+zebrafish+with+alcoholic+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease.</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1213-1226 (2013).</li>
<li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3407311/">The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. , (2012).</li>
<li>Lassen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+baculovirus+expression%2C+and+tissue+distribution+of+the+zebrafish+aldehyde+dehydrogenase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2.</a> Drug Metab Dispos. 33 (5), 649-656 (2005).</li>
<li>Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+zebrafish+alcohol+dehydrogenases+share+common+ancestry+with+mammalian+class+I%2C+II%2C+IV%2C+and+V+alcohol+dehydrogenase+genes+but+have+distinct+functional+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics.</a> J Biol Chem. 279 (37), 38303-38312 (2004).</li>
<li>Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+signaling+facilitates+liver+repair+from+acute+ethanol-induced+injury+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish.</a> Dis Model Mech. , (2016).</li>
<li>Vonghia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+alcohol+intoxication%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Acute alcohol intoxication.</a> Eur J Intern Med. 19 (8), 561-567 (2008).</li>
<li>Wittekind, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+staining+for+routine+diagnostic+pathology+including+the+role+of+tannic+acid.+1.+Value+and+limitations+of+the+hematoxylin-eosin+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain.</a> Biotech Histochem. 78 (5), 261-270 (2003).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio)</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>Theise, N. D. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cld.172/full">Histopathology of alcoholic liver disease.</a> Clinical Liver Disease. 2 (2), (2013).</li>
<li>Lorent, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Jagged-mediated+Notch+signaling+disrupts+zebrafish+biliary+development+and+generates+multi-organ+defects+compatible+with+an+Alagille+syndrome+phenocopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy.</a> Development. 131 (22), 5753-5766 (2004).</li>
<li>Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Ethanol-induced+Fibrotic+Liver+Model+in+Zebrafish+to+Study+Progenitor+Cell-mediated+Hepatocyte+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li>
<li>Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daily+rhythms+of+lipid+metabolic+gene+expression+in+zebra+fish+liver%3A+Response+to+light%2Fdark+and+feeding+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Chronobiol+Int%22%5BJournal%5D)">Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles.</a> Chronobiol Int. 32 (10), 1438-1448 (2015).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> Biotechniques. 43 (5), 610-614 (2007).</li>
<li>van der Velden, Y. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serine-threonine+kinase+LKB1+is+essential+for+survival+under+energetic+stress+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (11), 4358-4363 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Das aktuelle Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur akuten Ethanolbehandlung in Zebrafischlarven und die nachfolgenden histopathologischen Analysen mit H &amp; E-Färbung. Eine akute Ethanolbehandlung sollte nicht früher als 96 h nach der Befruchtung durchgeführt werden, da dies die Stufe ist, in der die Zebrafisch-Leber beginnt, alkohol-metabolisierende Enzyme auszudrücken 13 . 2% Ethanol ist die maximale Dosis, die Larven 13 , 14...

Alkoholische Lebererkrankung (ALD), die durch Alkoholüberkonsum verursacht wird, ist eine Hauptursache für alkoholbedingte Morbidität und Mortalität. In den Vereinigten Staaten, fast die Hälfte der Leberkrankheit Todesfälle beinhalten Alkohol 1 , und ALD ist verantwortlich für fast 1 in 3 Lebertransplantationen 2 . ALD hat ein breites Spektrum. Die Steatose, die durch eine überschüssige Lipidakkumulation in Hepatozyten charakterisiert ist, tritt im frühen Stadium des schweren Trinkens auf und ist bei Beendigung des Alkoholkonsums reversibel. Unter dem Einfluss von genetischen und umweltbedingten Faktoren und der anhaltenden Alkoholkonsum kann die hepatische Steatose zur alkoholischen Hepatitis und schließlich zur Zirrhose führen. Studien mit dem Nagetier ALD-Modelle haben erhebliche Einblicke in die Krankheit, aber sie haben Einschränkungen (siehe Referenz 3 ). Mündliche Fütterung einer Alkohol-Diät verursacht nur Steatose bei Nagetieren 4 , &lt;/ Sup&gt; 5 Entwicklung von Entzündungen und Fibrose erfordert entweder eine zweite Beleidigung 6 , 7 oder chronische intragastrischen Infusion, die invasiv und technisch anspruchsvoll ist 8 , 9 . Der Zeolith des Zeoliths erzeugt auch eine Leberverletzung als Reaktion auf die chronische und akute Alkoholbehandlung 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . Insbesondere stellt der Larven-Zebrafisch einen attraktiven komplementären Modellorganismus dar, in dem akute alkoholische Leberverletzungen 10 , 11 , 13 , 15 untersucht werden können . Die Zebrafisch-Leber ist funktionell und produziert Schlüsselenzyme für den Ethanol-Stoffwechsel um 4 TageNach der Befruchtung (dpf) 13 , 16 , 17.Ethanol kann direkt dem Wasser zugesetzt werden, und die Exposition gegenüber 2% Ethanol für 24 h ist ausreichend, um hepatische Steatose und fibrogene Reaktionen in Zebrafischlarven 13 , 15 zu induzieren. Es wurde berichtet, dass die Behandlung mit 2% Ethanol für 24 h eine Gewebe-Ethanol-Konzentration von 80 mM in Zebrafisch-Larven 13 ergab. Andere haben gezeigt, dass Larven diese Konzentration tolerieren und die Leberphänotypen, die in den behandelten Tieren gesehen werden, spezifisch für die Ethanol-Exposition sind 11 , 13 , 15 , 18 . Da jedoch 80 mM bei Menschen 19 nahezu tödlich ist, ist es wichtig, die Leberhistologie des mit Ethanol behandelten Zebrafischs zu bewerten und zu detektierenRmine die physiologische Relevanz für den Menschen. Die schnelle externe Entwicklung und Transluzenz von Zebrafischlarven ermöglicht es, die Wirkung von Alkohol in der Leber in Echtzeit und in festen Proben zu charakterisieren. Die Verfügbarkeit von zelltypspezifischen fluoreszierenden transgenen Linien und die jüngsten Fortschritte in der konfokalen Mikroskopie erleichtern die Untersuchung, wie verschiedene Leberzelltypen ihre Morphologie und ihr Verhalten in Reaktion auf die akute Ethanolbehandlung 11 , 15 verändern. Allerdings kann die konfokale Bildgebung des fluoreszierenden transgenen Zebrafischs bei der Untersuchung der Leberhistologie nicht vollständig gegen Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) färben. Die Markierung aller Leberzelltypen zur gleichen Zeit mit transgenem Zebrafisch erfordert die Erzeugung von einzelnen transgenen Linien, die jeweils einen Leberzelltyp mit einem einzigartigen Fluorophor markieren. Die Einführung verschiedener transgener Hintergründe in denselben Fisch erfordert BreedinG Mehrfachgenerationen, die zeitaufwändig und teuer ist. Zusätzliche Immunfluoreszenzfärbung ist erforderlich, um extrazelluläre Matrixkomponenten zu detektieren. H &amp; E-Färbung dagegen markiert gleichzeitig alle Leberzelltypen und extrazelluläre Matrixkomponenten und gibt so einen Überblick über die Leber 20 . Darüber hinaus zeigt es leicht einige histopathologische Merkmale von Lebererkrankungen, wie Hepatocyten Tod, Steatose und Fibrose. Obwohl H &amp; E ein routinemäßiger Fleck in der Säugetier-Histologie ist, wird er nicht häufig in der Zebrafisch-Leberforschung verwendet, und das Protokoll ist weniger gut etabliert. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für die akute Ethanolbehandlung in Zebrafischlarven und für die nachfolgenden histologischen Analysen mit H &amp; E-Färbung. Das H &amp; E-Färbeprotokoll kann in allen Studien der Leberentwicklung und -funktion verwendet werden. Darüber hinaus können die Paraffinschnitte für die Immunhistochemie sowie für andere spezielle sta verwendet werdenIns in der Leberpathologie, einschließlich der Trichromfleck, Reticulinfleck usw.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>E & K Scientific</td><td>280150</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konische Röhrchen</td><td>VWR International</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konische Röhrchen</td><td>VWR International</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>95% Ethanol (EtOH)</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2801</td><td>Entzündliche</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Neuling Versorgung</td><td>10010A</td><td>Reizende</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Forschungsprodukte International</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium Gefäß Gestell Halter</td><td>Neuling Versorgung</td><td>5300JRK</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriologische Petrischalen mit Deckel</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Biopsie-Pads</td><td>Simport</td><td>M476.1</td><td></td></tr><tr><td>Geladene Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-16</td><td></td></tr><tr><td>Durchsichtige Eindeckmedien</td><td>Fisher Scientific</td><td>8310-16</td><td>Kann durch andere durchsichtige Eindeckmedien ersetzt werden</td></tr><tr><td>Kommerzielle Meersalze</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Mikrotomklingen</td><td>Fisher Scientific</td><td>4280L</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica Mz 95</td><td></td></tr><tr><td>Geschlossener Tissueprozessor</td><td>Leica Biosystems</td><td>ASP300 S</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Phloxin-Färbeset</td><td>Newcomer Supply</td><td>1082A</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Entzündbare</td></tr><tr><td>Formaldehydlösung, ACS-Reagenz, 37 WT. % in H20, enthält 10 - 15 % Methanol als Stabilisator (zur Verhinderung von Polymerisation)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>Verdacht auf Karzinogen; reizend</td></tr><tr><td>Formalin, gepuffert, 10</td>%<td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td>Verdacht auf Karzinogen; reizend</td></tr><tr><td>Messmedium Flasche</td><td>VWR International</td><td>16159-520</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hämatoxylin</td><td>Poly Scientific R& D Corp.</td><td>s212</td><td>Reizstoffe</td></tr><tr><td>Histologie-Formen</td><td>Sakura Finetek USA Inc</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte/Rührer</td><td>VWR International</td><td>47751-148</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144</td><td></td></tr><tr><td>Reizstoff-Inkubator</td><td>VWR International</td><td>97058-220</td><td></td></tr><tr><td>Insulinspritzen</td><td>BD Medical</td><td>BD-309301</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Verbundmikroskop</td><td>Carl Zeiss Mikroskopie</td><td>491912-9850-000</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Newcomer Supply</td><td>12094E</td><td>Entflammbares</td></tr><tr><td>Methylenblau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Reizstoffmikrotom</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica Jung BioCut 2035&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nutatormischer</td><td>VWR International</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td>Ein Verdacht auf Karzinogen; reizend</td></tr><tr><td>Pasteurpipette</td><td>VWR International</td><td>53283-916</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenpumpe (10 mL)</td><td>VWR International</td><td>53502-233</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat, einbasig (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>Grainger</td><td>4A807</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger-Färbeset</td><td>Neuling Versorgung</td><td>5300KIT</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>S318-500</td><td>Sehr gefährliches</td></tr><tr><td>Natriumphosphat, zweibasisch (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahlsieb (5 Zoll Durchmesser)</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>L0906045in</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekassetten</td><td>Simport</td><td>M505.12</td><td></td></tr><tr><td>Gewebeeinbettungszentrum</td><td>Sakura Finetek USA Inc</td><td>#5100</td><td></td></tr><tr><td>Gewebewischer, 1-lagig</td><td>Fisher Scientific</td><td>06666A</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>137117M</td><td></td></tr><tr><td>Tricainpulver/Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonatsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Reizende</td></tr><tr><td>Tris-Basis, Primärstandard und Puffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Waschflasche, niedrige Dichte Polyethylen, Weithals</td><td>Nalge Nunc International</td><td>2402-0750</td><td></td></tr><tr><td>Xylole</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>Reizend</td></tr></tbody></table>

histologische analysen der akuten alkoholischen leberverletzung in zebrafisch

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Alkoholische Lebererkrankung (ALD) bezieht sich auf Schädigung der Leber durch akuten oder chronischen Alkoholmissbrauch. Es gehört zu den führenden Ursachen für alkoholbedingte Morbidität und Mortalität und betrifft mehr als 2 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten. Ein besseres Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen, die der Alkohol-induzierten Leberverletzung zugrunde liegen, ist entscheidend für die Entwicklung einer effektiven Behandlung für ALD. Zebrafisch-Larven zeigen hepatische Steatose und Fibrogenese nach nur 24 h Exposition gegenüber 2% Ethanol, so dass sie nützlich für die Untersuchung der akuten alkoholischen Leberverletzung. Diese Arbeit beschreibt das Verfahren für die akute Ethanolbehandlung in Zebrafischlarven und zeigt, dass es eine Steatose und Schwellung der Leberblutgefäße verursacht. Ein detailliertes Protokoll für Hämatoxylin- und Eosin- (H &amp; E) -Färbung, das für die histologische Analyse der Zebrafisch-Larvenleber optimiert ist, wird ebenfalls beschrieben. H &amp; E-Färbung hat mehrere einzigartige Vorteile gegenüber der Immunfluoreszenz, da sie alle liv markiertEr-Zellen und extrazellulären Komponenten gleichzeitig und kann leicht erkennen Leber-Verletzungen, wie Steatose und Fibrose. Angesichts der zunehmenden Verwendung von Zebrafisch bei der Modellierung von Toxin und Virus-induzierter Leberverletzung sowie vererbter Lebererkrankungen dient dieses Protokoll als Referenz für die histologischen Analysen, die in all diesen Studien durchgeführt wurden.

10% gepuffertes Formalin und 4% Paraformaldehyd (PFA) sind zwei der häufigsten Fixiermittel, die für histologische Praktiken verwendet werden. Allerdings geben sie keine optimalen Fixationsergebnisse für Zebrafisch-Lebergewebe (Abbildung 1 und Tabelle 1 ). Die Fixierung mit 10% Formalin oder 4% PFA führt oft zu Schrumpfungen, wodurch große Lücken zwischen der Leber und den umgebenden Geweben entstehen (Abbildung 1A</stro...

Dieses Protokoll beschreibt histologische Analysen der Leber aus Zebrafisch-Larven, die mit 2% Ethanol für 24 Stunden behandelt wurden. Eine solche akute Ethanolbehandlung führt zu einer hepatischen Steatose und einer Schwellung des Lebergefäßsystems.

Histologische Analysen der akuten alkoholischen Leberverletzung in Zebrafisch

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die pathohistologischen Veränderungen in der Leber von Zebrafischlarven nach akuten Ethanolschädigungen zu bewerten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der alkoholischen Lebererkrankung zu klären, beispielsweise die histologischen Merkmale einer akuten alkoholbedingten Leberschädigung sowie das Ausmaß, in dem die Reaktionen der Zebrafischleber auf eine akute Alkoholschädigung denen beim Menschen ähneln. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass unsere Ethanolverabreichung stärkere Reaktionen hervorruft als andere publizierte Methoden.Außerdem verbessert unser Histologieprotokoll die Gewebestrukturintegrität in den Schnitten. Wählen Sie zunächst bis zu 40 Larven 96 Stunden nach der Befruchtung mit aufgeblähten Schwimmblasen mithilfe einer Pasteurpipette aus und verteilen Sie sie gleichmäßig auf zwei neue Petrischalen.Entfernen Sie so viel restliches Ei-Wasser wie möglich und geben Sie anschließend Ei-Wasser mit 2 % Ethanol in eine Schale mit einer Dichte von einer Larve pro Milliliter. Geben Sie die gleiche Menge Ei-Wasser ohne Ethanol in die andere Schale, um als Kontrolle zu dienen. Bewahren Sie die Kontroll- und mit Ethanol behandelten Larven 24 Stunden lang im Fischraum auf.Nach Ablauf der 24-stündigen Periode sammeln Sie die Larven in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, wobei nicht mehr als 20 Larven pro Röhrchen verwendet werden sollten. Während der Arbeit im chemischen Abzug entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich von den Larven und geben anschließend mindestens ein Milliliter Dietrichs Fixierungslösung hinzu. Lassen Sie die Fische mindestens 24 Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Nutorator fixieren.Stellen Sie die Gewebekassetten und zwei blaue Biopsiekissen pro Kassette bereit. Legen Sie ein Biopsiekissen auf den Boden jeder Kassette. Beschriften Sie jede Kassette mit Bleistift, wobei die Probe eindeutig gekennzeichnet werden muss.Entfernen Sie im Abzug die Fixierlösung aus den Röhrchen und waschen Sie die Larven dreimal für jeweils fünf Minuten mit einem Milliliter PBS. Stellen Sie die Röhrchen während des Waschens bei Raumtemperatur auf einen Nutor. Erwärmen Sie während der Waschungen 3 % Agarose in Wasser in einer Mikrowelle, um den Feststoff zu schmelzen.Erhitzen Sie jeweils 30 Sekunden lang und beobachten Sie sorgfältig, um Sieden zu minimieren. Sobald die Agarose gelöst ist, stellen Sie die flüssige Agarose auf eine Heizplatte, die auf 90 Grad Celsius eingestellt ist, und rühren vorsichtig um. Überführen Sie mithilfe einer Transferpipette bis zu acht Larven in eine Kunststoff-Histologieform und entfernen Sie so viel PBS wie möglich.Unter Verwendung einer Übertragungspipette mit abgeschnittenem Spitzenende die Form vollständig mit 3 % Agarose füllen, dann mit einer Insulinspritze die Larven in der Mitte der Form sammeln und nach unten drücken. Für sagittale Schnitte die Larven in einer Linie anordnen, wobei die Köpfe nach oben zur Formkante zeigen. Um eine einheitliche Orientierung der Lebern sicherzustellen, die Larven drehen, sodass die linke Körperseite nach unten zeigt und flach am Boden der Form anliegt.Nachdem man dem Agarose-Gel erlaubt hat, sich vier bis fünf Minuten lang zu setzen, entferne den Agarose-Block aus der Form und schneide mit einer Rasierklinge die Agarose rund um die Larven zurecht. Stelle den Block aufrecht hin und halbiere seine Dicke, sodass der endgültige Block etwa zwei bis drei Millimeter dick ist. Überführe den kleinen Agarose-Block in die vorbereitete Gewebekassette und lege das zweite Biopsiekissen auf den Block. Schließen Sie die Kassette und legen Sie die vollständig montierte Kassette in einen verschließbaren Behälter mit frisch hergestelltem 70 % Ethanol in doppelt destilliertem Wasser. Nach der Paraffineinbettung des Gewebes verwenden Sie ein Mikrotom, um überschüssiges Paraffin, das das Gewebe bedeckt, durch Schneiden von jeweils fünf Mikrometern zu entfernen, bis das Gewebe an der Oberfläche des Paraffinblocks freigelegt ist; brechen Sie dann ab und entsorgen Sie alle geschnittenen Schnitte. Lassen Sie die Blöcke mit der Schnittfläche nach unten in PBS ein, und lagern Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius.Am nächsten Tag jeweils einen Block aus dem PBS entnehmen und mit einem Mikrotom fünf Mikrometer dünne Schnitte anfertigen. Lösen Sie das Schnittband vorsichtig vom Messer, indem Sie mit einer Pinzette oder einem Pinsel das letzte Schnittstück sanft vom Messer wegzogen. Heben Sie das Band mit der Pinzette am letzten Schnittstück auf und übertragen Sie es in ein Wasserbad bei 42 Grad Celsius.Lassen Sie die Streifen mindestens fünf Minuten lang auf der Wasseroberfläche schwimmen. Zerlegen Sie die Abschnitte mit der Pinzette in kleinere Gruppen, um sie auf die Objektträger aufzubringen. Führen Sie einen geladenen Objektträger im 45-Grad-Winkel ins Wasser ein und positionieren Sie ihn vorsichtig unter der Gruppe von Abschnitten, die aufgefangen werden sollen.Heben Sie die Objektträger vorsichtig aus dem Wasser und lassen Sie die Schnitte am Objektträger haften. Tupfen Sie überschüssiges Wasser von den Schnitten mit fusselfreiem Tissue ab. Stellen Sie den Objektträger in einen Objektträgerhalter oder eine Box.Fahren Sie mit dem Schneiden des Blocks fort, bis das gewünschte Gewebe gesammelt wurde. Backen Sie die Objektträger anschließend drei bis 16 Stunden lang in einem Inkubator oder Ofen bei 55 Grad Celsius, um das Paraffin zu schmelzen. Überprüfen Sie nach Ablauf der Zeit, ob das Paraffin geschmolzen ist, und lassen Sie die Objektträger vor der Färbung abkühlen.Entparaffinieren Sie die Objektträger, indem Sie sie zweimal für jeweils 15 Minuten in 100 % Xylol eintauchen, anschließend rehydrieren Sie die Objektträger über eine Ethanol-Abstufung. Tauchen Sie die Objektträger für jede Lösung acht bis zehn Mal für jeweils zwei Sekunden ein, bis die Flüssigkeit sauber von den Objektträgern abläuft. Legen Sie die Objektträger für vier Minuten in 100 % gefiltertes Harris-Hämalum.Nach vier Minuten übertragen Sie sie schnell zurück in den Behälter mit entionisiertem Wasser. Leiten Sie entionisiertes Wasser in die hintere Ecke des Behälters, die den Präparaten am weitesten entfernt ist. Leeren Sie den Behälter regelmäßig, bis das Wasser nicht mehr lila ist.Überprüfen Sie schnell die Hämatoxylin-Intensität unter einem Stereomikroskop mit Schwanenhalsleuchten. Falls eine stärkere Färbung erforderlich ist, kehren Sie die Objektträger für eine Minute in 100 % Hämatoxylin zurück. Sobald die gewünschte Hämatoxylin-Färbung erreicht ist, tauchen Sie die Objektträger zweimal in 0,05 % Salzsäure ein und überführen Sie sie anschließend unmittelbar zurück in den Behälter mit sauberem entionisiertem Wasser.Leeren und füllen Sie den Behälter zweimal mit Wasser. Überführen Sie die Objektträger nacheinander in zwei Behälter mit 95 % Ethanol und belassen Sie sie jeweils 30 Sekunden darin. Legen Sie die Objektträger anschließend zwei Minuten lang in die Eosin Y-Phloxin B-Lösung.Nach den zwei Minuten die Objektträger zurück in den vorherigen Behälter mit 95 % Ethanol überführen und anschließend die Färbungsintensität am Stereomikroskop überprüfen. Falls die Färbung nicht ausreichend ist, erneut 30 Sekunden in die Eosin-Lösung geben. Bei Bedarf wiederholen.Wenn die gewünschte Färbungsintensität erreicht ist, überführen Sie die Objektträger für 15 Sekunden in 100 % Isopropanol. Ersetzen Sie das Isopropanol durch frisches 100 % Isopropanol und legen Sie die Objektträger erneut für 15 Sekunden hinein. Wiederholen Sie diesen Vorgang insgesamt sechsmal, um sechs Isopropanol-Waschschritte durchzuführen.Nachdem der Objektträger drei Minuten lang in 100 % Xylol getaucht wurde, einen Objektträger entnehmen. So viel Montagemedium hinzufügen, dass die Schnitte vollständig bedeckt sind, und den Objektträger anschließend in 100 % Xylol eintauchen. Ein Deckglas auf den Objektträger auflegen und überschüssiges Montagemedium mit einem Papiertuch abtupfen, bis nur noch ein dünner Strich sichtbar ist. Danach ein Taschentuch in das Xylol tauchen und die Rückseite des Objektträgers abwischen, um verbliebene Rückstände des Mediums zu entfernen.Legen Sie den Objektträger flach auf eine stabile, aber bewegliche Unterlage, wie zum Beispiel ein Stück Pappe, und lassen Sie das Xylol 10 Minuten lang im Abzug verdunsten. Belassen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur, damit das Einbettungsmedium aushärten kann, bevor die Bildaufnahme erfolgt. Diese Leber von Zebrafischlarven 120 Stunden nach der Befruchtung wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur in Dietrichs Fixierungsmittel eingetaucht.Die Fixierung mit Dietrichs Fixiermittel liefert die optimale Fixierung dieses Gewebes. Bei Fixierung mit 10 % Formalin verlieren die Hepatozyten häufig ihr Zytoplasma. Das Gewebe färbt sich nicht korrekt mit Eosin und erscheint violett.Nach der Fixierung mit 4 % PFA sind Lücken zwischen den Hepatozyten sichtbar. 4 % PFA verursacht eine Schrumpfung des Lebergewebes, sodass eine große Lücke zwischen der Leber und dem umgebenden Gewebe sichtbar wird. Die gestrichelte Linie markiert die Grenze des umgebenden Gewebes.Dieses Bild mit höherer Vergr&ouml;&szlig;erung zeigt die H&E-F&auml;rbung der Leber in einer unbehandelten Kontrolllarve vom Wildtyp, die Teil einer Ethanol-Behandlungsstudie war. Auch dieses Tier wurde mit Dietrichs Fixans mit 120 Stunden nach der Befruchtung fixiert. Dieses Bild zeigt die Wirkung einer Behandlung mit 2 % Ethanol von 96 bis 120 Stunden nach der Befruchtung auf die Leber.Diese akute Ethanolbehandlung verursacht hepatische Steatose und Schwellung der Blutgefäße. Die Pfeile zeigen auf Hepatozyten mit übermäßiger Ablagerung runder Tröpfchen, und die Sternchen markieren die geschwollenen hepatischen Blutgefäße. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Ethanolbehandlung in einer Fischanlage mit Hell-Dunkel-Wechsel zu durchführen.Verwenden Sie für die H&E-Färbung Dietrichs Fixans für eine optimale Gewebepräservierung. Denken Sie auch daran, die Farbintensität häufig zu überprüfen, um eine Überfärbung oder Unterfärbung zu vermeiden.

histological-analyses-of-acute-alcoholic-liver-injury-in-zebrafish

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Um die molekularen Mechanismen des Ethanol-induzierte Entwicklungsstörungen verstehen, haben wir einen Zebrafisch-Modell von Ethanol Exposition entwickelt und erforschen die physikalischen, zellulären und genetischen Veränderungen, die nach der Exposition auftreten...

Die Beurteilung Teratogene Änderungen in einem Zebrafisch-Modell der Fetal Alcohol Exposure

Um die molekularen Mechanismen zu bewerten, die der Gallenleberregeneration von Zebrafischen zugrunde liegen, haben wir ein Leberverletzungsmodell etabliert, in dem die Nitroreduktase-exprimierenden Hepatozyten nach einer Behandlung mit Metronidazol genetisch abgetragen werden.  In diesem Protokoll beschreiben wir, wie die Hepatozytenablation und die gallengetriebene Leberregeneration geschickt manipuliert, überwacht und analysiert werden können.

Hepatozyten-spezifische Ablation in Zebrafische, um Gallengetriebenen Leberregeneration Studieren

Anhaltende Fibrose mit Ablagerung von übermäßigen extrazellulären Matrixproteinen führt zu Zirrhose. Alkoholmissbrauch ist eine der Hauptursachen für schwere Lebererkrankungen. Wir haben ein Ethanol-induziertes Zebrafisch-Modell für fibrotische Lebern etabliert, um die Mechanismen und Strategien zur Förderung der Hepatozytenregeneration nach alkoholinduzierten Verletzungen zu untersuchen.

Entwicklung einer fibrotischen Leber Modell in Zebrabärbling Ethanol-induzierte zur Untersuchung Progenitor-vermittelte Zell Hepatozyten-Regeneration

Hier zeigen wir eine Methode zur Quantifizierung der Lebergröße in Larvenzebrafischen, die eine Möglichkeit bietet, die Auswirkungen genetischer und pharmakologischer Manipulationen auf das Leberwachstum und die Leberentwicklung zu bewerten.

Quantifizierung der Lebergröße in Larval Zebrafischen mit Brightfield-Mikroskopie

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Quantifizierung des Ethanolgehalts in einem Zebrafisch-Embryo mithilfe der Kopfraumgaschromatographie von geeigneten Expositionsmethoden für die Embryoverarbeitung und Ethanolanalyse.

Quantifizierung des Ethanolgehalts in Zebrafisch-Embryonen mittels Head Space Gas Chromatographie

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Entfernung des Bauchlappens der Leber bei erwachsenen Zebrafischen, um die Untersuchung der Leberregeneration zu ermöglichen.

Partielle Hepatektomie bei erwachsenen Zebrafischen

Hier stellen wir vor, wie ein nicht-alkoholisches Fettlebererkrankung (NAFLD)-assoziiertes Hepatozelluläres Karzinom (HCC) Zebrafischmodell generiert werden kann, um die Auswirkungen von Cholesterinüberschuss auf die Lebermikroumgebung und die Immunzelllandschaft zu untersuchen.

Analyse der Lebermikroumgebung während des frühen Fortschreitens des nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung-assoziierten hepatozellulären Karzinoms im Zebrafisch

Das Ziel des aktuellen Protokolls ist es, die notwendigen Schritte zur Etablierung und Verwendung eines Assays für soziale Präferenzen für adulte Zebrafische zu skizzieren und zu zeigen, dass er zur Charakterisierung von Ethanol-induzierten sozialen Defekten verwendet werden kann.

Modellierung fetaler Alkoholspektrumstörungen beim Zebrafisch, um den Einfluss einer ungünstigen embryonalen Umgebung auf das Sozialverhalten von Erwachsenen zu charakterisieren

Hier stellen wir eine zuverlässige Methode vor, um die Nierenregeneration bei Erwachsenen zu untersuchen, indem eine akute Nierenschädigung durch Gentamicin-Injektion induziert wird. Wir zeigen, dass die Schädigung von der Gentamicin-Dosierung und der Umgebungstemperatur abhängt, indem wir in situ Hybridisierung verwenden, um lhx1a+ zu markieren und neue Nephrone zu entwickeln.

Nieren-Regeneration im erwachsenen Zebrafisch durch Gentamicin induzierte Schädigung

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung einer mechanischen Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen. Dieses Verletzungsmodell bietet eine Plattform für die Untersuchung von Blutstillung, verletzungsbedingten Entzündungen und Wundheilung in einem Organismus, der sich ideal für die Echtzeitmikroskopie eignet.

Mechanische Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen

Lernen Sie die histologische Analyse akuter alkoholischer Leberverletzungen bei Zebrafischlarven mit Ethanolbehandlung kennen. Diese Methode ermöglicht robuste Reaktionen und verbesserte Gewebestruktur für die Erforschung alkoholbedingter Lebererkrankungen.

Histologische Analysen der akuten alkoholischen Leberverletzung in Zebrafisch

Weitere Videos entdecken