In Echtzeit In Vivo Aufnahme von Arabidopsis Kalziumsignale während der Fütterung mit einer fluoreszierenden Biosensor Insekt

Das übergeordnete Ziel dieses Mikroskopieprotokolls ist es, die Kalziumdynamik von Pflanzen in vivo zu messen, wenn Insekten sich von einem Blatt ernähren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zu den Interaktionen zwischen Pflanzenblattläusen und Pflanzen zu beantworten, z. B. wie Pflanzen Blattlausschädlinge erkennen und darauf reagieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, pflanzliche Kalziumsignale in vivo zu erkennen, während ein lebendes Insekt sich von den Blättern ernährt.

Obwohl diese Methode einen Einblick in die Rolle des Kalzium-Signalwegs während der Nahrungsaufnahme von Blattläusen geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. neue Insekten oder Pflanzen oder sogar um Signale als Reaktion auf abiotischen Stress zu erkennen, wie z. B. Salz. Beginnen Sie mit dem Anbau von 35S:GCaMP3 Arabidopsis-Pflanzen und ziehen Sie am 11. Tag Blattläuse auf, wie im Textprotokoll beschrieben. Nehmen Sie am 19. Tag des Experiments die Sämlinge aus dem Raum mit kontrollierter Umgebung.

Lösen Sie das größte Blatt von jeder Pflanze mit einer scharfen Schere. Verwenden Sie als Nächstes eine Pinzette, um jedes Blatt mit der abaxialen Oberfläche nach oben in separate Vertiefungen einer 96-Well-Platte zu legen, die 300 Mikroliter destilliertes Wasser pro Well enthält. Um die Ablösungsspannung in den Blättern zu verringern, decken Sie die Platte mit durchsichtiger Plastikfolie und Alufolie ab und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur stehen.

Sammeln Sie an Tag 20 die alten Blattläuse aus der am 11. Tag gegründeten Kolonie, indem Sie die befallene Pflanze aus dem Boden in eine durchsichtige Box mit Deckel bringen. Achten Sie darauf, dass sich die Insekten während des Experiments in der Box befinden. Entfernen Sie die Aluminiumfolie von der 96-Well-Platte und übertragen Sie sie in ein fluoreszierendes Stereomikroskop

Passen Sie die Belichtung an, bis die GCaMP3-Fluoreszenz in den Adern der Blätter sichtbar ist. Passen Sie die Vergrößerung im Zoom an, um vier Wells in einem Bild zu betrachten. Übertragen Sie mit einem feuchten Pinsel eine Blattlaus auf ein abgelöstes Blatt unter dem Mikroskop.

Berühren Sie leicht das angrenzende Blatt mit dem leeren Pinsel als Steuerung. Lege die Plastikfolie wieder auf die Platte, um zu verhindern, dass die Blattlaus entweicht. Erfassen Sie die Fluoreszenz der Blätter in Paaren aus einer behandelten und einer unbehandelten Blattlaus.

Klicken Sie zunächst in der integrierten Mikroskopsoftware auf Experiment starten. Nachdem Sie die Messungen 50 Minuten lang aufgezeichnet haben, klicken Sie auf "Experiment beenden". Entferne die Blattlaus vom Blatt.

Wiederholen Sie die Messungen mit weiteren Blattpaaren. Um mit der Datenerfassung zu beginnen, öffnen Sie die Image-Software. Importieren Sie die Bilddateien in Fiji oder ImageJ.

Konvertieren Sie die aufgenommenen Bilder in 32-Bit, indem Sie auf Bild, Typ und dann auf 32-Bit klicken. Klicken Sie zunächst auf die Registerkarte Bild und wählen Sie Eigenschaften. Stellen Sie die Messskala auf Pixel und den Zeitrahmen auf das gleiche Zeitintervall ein, das während der Mikroskopie verwendet wird.

Verfolgen Sie die Bewegung des Insekts unter dem Mikroskop und entsorgen Sie die Proben, in denen sich die Blattläuse nicht länger als fünf Minuten an einer Stelle ansiedeln. Verwenden Sie den Cursor, um einen Bereich of Interest (ROI) um den Bereich des Gewebes zu platzieren, der auf das GFP-Signal analysiert werden soll. Erstellen Sie den ROI, indem Sie mit dem Oval-Werkzeug ein Oval zeichnen und die Größe mit Bearbeiten, Auswahl und dann Angeben bearbeiten.

Wählen Sie ROIs für die nicht behandelten Steuerelemente in Bereichen des Blatts aus, die mit denen auf dem behandelten Blatt vergleichbar sind. Um die Rohfluoreszenzwerte oder F in der ROI im Zeitverlauf zu analysieren, verwenden Sie das Time Series Analyzer-Plug-in, indem Sie auf Plug-ins und Time Series Analyzer bei der gewünschten ROI klicken, indem Sie die Schaltfläche Hinzufügen auswählen. Nachdem Sie den ROI ausgewählt haben, wählen Sie Durchschnitt abrufen aus, um eine Tabelle mit F-Werten für jeden Frame in diesem ROI anzuzeigen und diese Daten in eine Tabelle zu kopieren.

Wählen Sie als Nächstes den Bereich des GFP-Signals an der Einspeisestelle mit dem Freihandauswahlwerkzeug aus. Skizzieren Sie das maximale Signal an der Fütterungsstelle, und berechnen Sie dann die Fläche dieser Form, indem Sie auf Analysieren und dann auf Messen klicken. Um die Geschwindigkeit der Fütterungsstelle zu berechnen, verwenden Sie das MTrackJ-Plugin, indem Sie auf Plugins, Tracking und dann auf MTrackJ klicken.

Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Hinzufügen und dann auf den Cursor in der Mitte des Signals, wenn es zum ersten Mal sichtbar ist. Klicken Sie erneut auf die Kante des Signals an der Stelle, an der sie am weitesten gestreut ist. Um schließlich die Geschwindigkeit des Signals zu berechnen, klicken Sie auf Messen.

Um die 32-Bit-Bilddateien in Heatmaps zu konvertieren, verwenden Sie das Plug-in NucMed_Image LUTs. Wählen Sie NucMed aus dem Menü Plugins aus und klicken Sie dann auf Nachschlagetabellen. Wählen Sie Blau, Grün, Rot, um die Bilder in Heatmaps umzuwandeln.

Wenn es schwierig ist, die mit Blattläusen verbundenen GFP-Signale zu visualisieren, verbessern Sie den Kontrast der Heatmap, indem Sie auf Prozess, Kontrast verbessern klicken und dann den Prozentsatz der gesättigten Pixel anpassen. Verwenden Sie abschließend den Zeitstempel, um Zeitinformationen hinzuzufügen, indem Sie Plugins und dann Zeitstempel auswählen. Stellen Sie die Startzeit auf Null und das Intervall basierend auf dem für die Mikroskopie verwendeten Zeitintervall ein.

Innerhalb weniger Minuten nach der Absetzung der Blattläuse kam es zu einem stark lokalisierten Anstieg der GFP-Fluoreszenz um die Fressstelle, was die Erhöhung des zytosolischen Kalziums im behandelten Blatt zeigt. Im Kontrollblatt hingegen bleibt die Kalziumdynamik relativ stabil. Einige behandelte Blätter zeigen einen sekundären Anstieg der GFP-Fluoreszenz nach dem anfänglichen Peak.

Das Zeitverlaufsvideo des mit Blattläusen behandelten Blattes zeigt die Dynamik der GCaMP3-Fluoreszenz über die Zeit. In der systemischen Mittelrippe und in den systemischen lateralen Geweberegionen, also in Bereichen, die sich nicht um die Blattlausfutterstelle befinden, wird weder in den behandelten noch in den Kontrollproben eine Kalziumerhöhung festgestellt. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Blätter oder die Insekten nicht unnötig zu berühren oder zu stören, da dies zu berührungsinduzierten Kalziumsignalen führen oder die Ansiedlung der Blattläuse verhindern kann.

Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, sicherzustellen, dass sich die Blattläuse auf dem Blatt ansiedeln, um sich zu ernähren, aber dies kann minimiert werden, indem die Insekten so wenig wie möglich behandelt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Kalziumdynamik von Pflanzen in vivo mit einem fluoreszierenden Biosensor messen können, wenn Insekten von einem Blatt fressen. Ausgehend von diesem Verfahren können Blätter mutierter Pflanzen verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die genetischen Mechanismen beim Nachweis der Blattlaus und bei der Erfassung des Kalziumsignals.