Bewertung der Synapse Dichte im Hippokampus Nagetier Gehirnscheiben

Ein Protokoll für die präzise Identifizierung und Analyse von Synapsen im Hippokampus Scheiben mit Immunfluoreszenz ist in diesem Artikel beschrieben.

Das übergeordnete Ziel dieses Immunfärbeprotokolls ist es, die synaptische Dichte in ex vivo Hirnschnitten zu bewerten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten und ist nützlich bei der Untersuchung von Veränderungen der Synapsendichte, wie sie bei neurodegenerativen Erkrankungen beobachtet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine semiquantitative Schätzung der Synapsendichte ermöglicht, die zwischen gleichzeitig vorbereiteten experimentellen Bedingungen verglichen werden kann.

Beginnen Sie damit, das Mäusegehirn auf eine Petrischale zu legen. Entfernen Sie dann das Kleinhirn und einen kleinen Teil des frontalen Kortex mit einem Skalpell, bevor Sie die Mittellinie des Gehirns hemisezieren. Drehen Sie eine Halbkugel auf die Seite, die gerade geschnitten wurde, und kleben Sie sie auf die Bühne eines Vibratoms.

Gießen Sie eiskaltes ACSF in die Mikrotomkammer und reichern Sie die Lösung mit Sauerstoff auf. Schneiden Sie 200 bis 300 Mikrometer dicke Abschnitte des gesamten interessierenden Bereichs. Für den Hippocampus sollten etwa drei bis vier Scheiben pro Hemisphäre gewonnen werden.

Verwenden Sie eine Pasteurpipette aus Kunststoff, um die Scheiben in eine temperaturkontrollierte Kammer zu überführen, die in sauerstoffhaltiges ACSF getaucht ist. 30 Minuten lang bei 34 Grad Celsius halten. Nach Ablauf von 30 Minuten die Scheiben in eine 24-Well-Platte mit 4 % Paraformaldehyd und 4 % Saccharose geben und 20 Minuten bis eine Stunde lang bei Raumtemperatur fixieren.

Nach der Fixierung die Scheiben dreimal in 1x PBS für jeweils 10 Minuten waschen. Um mit der Immunfluoreszenzfärbung zu beginnen, ersetzen Sie das PBS in den Slice-Wells durch blockierenden und permeabilisierenden Puffer und inkubieren Sie es vier bis sechs Stunden lang bei Raumtemperatur auf dem Shaker. Gegen Ende des Blockierungsschritts verdünnen Sie den Antikörper mit vGlut1 um eins bis 2.000 in blockierendem und permeabilisierendem Puffer.

Bitte beachten Sie, dass diese Verdünnung je nach Unternehmen und Charge des verwendeten Antikörpers unterschiedlich sein kann. Inkubieren Sie die Scheiben über Nacht in der primären Antikörperlösung bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie eine Schüttelplattform mit kräftigen Bewegungen.

gleichmäßige Verteilung der Primär- und Sekundärantikörper ist wichtig für eine optimale Färbung. Unserer Erfahrung nach ermöglicht kräftiges Schütteln die beste Antikörperpenetration. Nach der Inkubation im Primärantikörper waschen Sie die Scheiben wie zuvor dreimal jeweils 10 Minuten lang in PBS.

Während der letzten Wäsche verdünnen Sie die entsprechenden Sekundärantikörper um eins bis 500 in Blockpuffer. Inkubieren Sie die Scheiben dann zwei bis drei Stunden lang bei Raumtemperatur in dieser Lösung. Stellen Sie sicher, dass die Scheiben vor Licht geschützt sind, da Sekundärantikörper lichtempfindlich sind.

Nach dem Waschen der Scheiben wie zuvor die Scheiben vorsichtig mit einer Bürste von der 24-Well-Platte entfernen und gleichmäßig auf vorbeschriftete Objektträger legen. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf jede Scheibe. Legen Sie dann vorsichtig ein Deckglas auf die Scheiben und achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen bilden.

Vor Licht schützen und die Objektträger mindestens drei bis vier Tage bei Raumtemperatur trocknen lassen. Lagern Sie die Objektträger kurzfristig bei vier Grad Celsius. Für die Langzeitlagerung sollten Sie sie jedoch bei minus 20 Grad Celsius aufbewahren.

Beginnen Sie mit der Verwendung eines 10x- oder 20x-Objektivs, um die Region des Hippocampus zu identifizieren, die abgebildet werden soll, in diesem Fall die Synapsen zwischen den CA1-Pyramidenneuronen und den Schaffer-Kollateralaxonen. Wechseln Sie zu einem 40- oder 63-fachen Ölimmersionsobjektiv und stellen Sie sicher, dass die Anatomie der Scheibe intakt ist, indem Sie kontinuierliche Neuriten und eine organisierte Struktur identifizieren. Verwenden Sie einen neuronalen Marker, z. B. MAP2, als Referenz.

Passen Sie die Einstellungen für jeden Kanal an, um ein optimales Signal und einen optimalen Kontrast mit einer Auflösung von 1.024 x 1.024 Pixeln zu erhalten. Stellen Sie die Intensität jedes Lasers ein, um die Sättigung von Pixeln zu vermeiden. Bewerten Sie die Tiefe, in der die Färbung gleichmäßig ist, und stellen Sie dann die Software so ein, dass Bildstapel von mindestens acht äquidistanten 250-Nanometer-Ebenen erfasst werden.

Nehmen Sie dann drei benachbarte repräsentative Bildstapel aus demselben Interessenbereich pro Slice auf. Wiederholen Sie die Einnahme in mindestens drei Scheiben pro Zustand und von sechs bis acht Tieren pro Behandlungsgruppe. Exzitatorische Synapsen können durch Kolokalisation zwischen vGlut1 und PSD95 identifiziert werden, wie durch die weißen Pfeile im Bild mit höherer Vergrößerung angedeutet.

Die Blockade des Wnt-Signalwegs im adulten Hippocampus durch Induktion des Wnt-Antagonisten Dkk1 löst einen exzitatorischen Synapsenverlust aus, insbesondere im CA1-Stratum radiatum. Der Prozentsatz der exzitatorischen Synapsen zwischen Kontroll- und iDkk1-Mäusen wurde quantifiziert und erwies sich bei iDkk1-transgenen Tieren als signifikant niedriger. Inhibitorische Synapsen können durch die Kolokalisation zwischen vGat und Gephyrin identifiziert werden.

Der Prozentsatz der inhibitorischen Synapsen zwischen Kontroll- und iDkk1-Mäusen wurde quantifiziert, und es wurde kein signifikanter Unterschied festgestellt. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, so vorsichtig wie möglich mit den Scheiben umzugehen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die synaptische Dichte in ex vivo Hirnschnitten bewertet werden kann.