Hochdurchsatz-parallele Sequenzierung Maßnahme Fitness Leptospira Interrogans Transposon Insertion Mutanten während Golden syrischen Hamster Infektion

Das übergeordnete Ziel dieser Hochdurchsatz-Transposon-Sequenzierungstechnik ist es, Transposon-Mutanten mit in vivo und in vitro Fitnessdefekten zu identifizieren und zu quantifizieren und dadurch Leptospira-Gene zu identifizieren, die an der Virulenz beteiligt sind. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Leptospiren zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung von Genen, die an der Besiedlung, Verbreitung und dem Überleben der Bakterien im Wirt beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine große Anzahl von Mutanten mit einer begrenzten Anzahl von Tieren gescreent werden kann.

Obwohl diese Methode entwickelt wurde, um die Fitness von Leptospira interrogans-Mutanten im Hamstermodell mit akuter Leptospirose zu untersuchen, kann sie auch durch chronische Infektionsmodelle, in vitro Studien und andere Stämme von Leptospira angewendet werden. Das Verfahren wird von Kritel Lourdault und Karen Evangelista, beides Postdoktorandinnen aus meinem Labor, demonstriert. Montieren Sie zunächst eine Filtereinheit.

Legen Sie den Boden auf einen 125-Milliliter-Erlenmeyerkolben mit Seitenarm. Positionieren Sie einen Acetat-Zellulose-Filter an der Basis und klemmen Sie einen Trichter auf die Basis. Schließen Sie die Filtereinheit an ein Vakuumsystem an.

Geben Sie als Nächstes fünf Milliliter Leptospira-Kultur und 0,5 Milliliter E.coli-Kultur in den Trichter. Schalten Sie das Vakuum ein, um die Lösung zu filtern. Legen Sie dann den Filter mit der Bakterienseite nach oben auf eine EMJH-Platte, die mit DAP ergänzt wird.

Inkubieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius über Nacht. Füllen Sie den Filter am nächsten Tag in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter EMJH und wirbeln Sie das Röhrchen 10 Sekunden lang durch, um die Bakterien in der Suspension freizusetzen. Verteilen Sie dann die Suspension auf fünf EMJH-Platten, ergänzt mit Kanamycin unter Verwendung von Glasperlen oder einem Streuer.

Wickeln Sie die Platten in Parafilm ein und inkubieren Sie sie kopfüber bei 30 Grad Celsius, bis die Kolonien sichtbar sind. Wenn Kolonien sichtbar sind, sammeln Sie sie und überführen Sie sie einzeln in drei Milliliter EMJH, das Kanamycin enthält. Dann inkubieren Sie die Röhrchen bei 30 Grad Celsius und 150 U/min sieben bis 10 Tage lang oder bis zu einer Dichte von 100 Millionen Zellen pro Milliliter.

Um die Transposon-Insertionsstelle zu identifizieren, führen Sie verschachtelte PCRs durch. Bereiten Sie zunächst die Mischung für die erste PCR vor. Fügen Sie dann die Proben aus der Kultur zu den PCR-Mixen hinzu.

Bereiten Sie nach dem Ausführen der ersten Reaktion die Mischung für die zweite PCR vor. Fügen Sie zwei Mikroliter PCR-Produkt aus der ersten PCR hinzu, um die Reaktionsmischungen zu vervollständigen. Untersuchen Sie nach der PCR die Produkte auf einem Agarose-Gel.

Fahren Sie mit der Sequenzierung der Produkte fort, um die Transposon-Insertionsstelle zu bestimmen. Um den Tierversuch zu beginnen, züchten Sie zunächst einzelne Mutanten in EMJH, die mit Kanamycin ergänzt werden. Anschließend bestimmen Sie die Kulturdichten mit einem Dunkelfeldmikroskop.

Verdünnen Sie jeden kultivierten Mutantenstamm in EMJH auf die gleiche Dichte. Poolen Sie dann ein gleiches Volumen aller Mutanten, um den Eingabepool zu bilden. Fordere nun die Tiere heraus, wie im Textprotokoll beschrieben.

Die Anzahl der benötigten Tiere hängt von der Größe des Eingangspools ab. Konsultieren Sie unbedingt einen Biostatistiker, um die Anzahl der zu impfenden Tiere zu bestimmen. Lassen Sie die Infektion vier Tage lang wachsen und entnehmen Sie dann Blut und Gewebe, wie im Textprotokoll beschrieben.

Um die DNA aus der Blutprobe zu extrahieren, verwenden Sie ein kommerzielles Extraktionskit. Für Gewebe würfeln Sie 50 bis 80 Milligramm Gewebe in ein Millimeter große Würfel. Übertragen Sie dann die gewürfelten Taschentücher in ein Schraubröhrchen und wiegen Sie sie auf einer Präzisionswaage

Geben Sie anschließend 500 Mikroliter steriles PBS in das Röhrchen. Homogenisieren Sie es eine Minute lang mit einem Disruptor. Verwenden Sie dann ein Volumen, das 25 Milligramm Gewebe entspricht, um die DNA zu extrahieren.

Verwenden Sie ein handelsübliches Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verdünnen Sie die DNA in 100 Mikrolitern Elutionspuffer. Übertragen Sie als Nächstes 50 Mikroliter extrahierter DNA in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Scheren Sie dann die DNA. Legen Sie das Röhrchen in ein mit vier Grad Celsius heißem Wasser gefülltes Horn. Lassen Sie das Ultraschallgerät drei Minuten lang laufen, während Sie einen Gehörschutz tragen.

Laden Sie als Nächstes 2,5 Mikroliter der gescherten DNA in ein 2%-Agarose-Gel, um zu bestätigen, dass die meisten DNA-Fragmente unter 600 Basenpaaren liegen. Bereiten Sie als Nächstes den Reaktionsmix vor, um den DNA-Fragmenten Cytosinschwänze hinzuzufügen. Inkubieren Sie die Reaktion eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Inaktivieren Sie dann das Enzym, indem Sie die Temperatur 20 Minuten lang auf 75 Grad Celsius erhöhen. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, reinigen Sie sie mit einem PCR-Aufreinigungskit und eluieren Sie die DNA mit 12 Mikrolitern Elutionspuffer. Führen Sie zwei PCRs aus, um die Genombibliotheken zu erstellen.

Bereiten Sie für die erste PCR Mischungen mit TnkN3- und olj376-Primern vor. Der Primer TnkN3 ist spezifisch für das Transposon und der Primer olj376 ist spezifisch für das C-Leitwerk. Kombinieren Sie für jede Probe 22 Mikroliter der Mischung mit drei Mikrolitern gereinigter C-seitiger DNA.

Führen Sie dann die PCR aus, wie im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie für die zweite PCR einen Mikroliter des ersten PCR-Produkts als Vorlage. Verwenden Sie für Primer pMargent2, um das Transposon anzuvisieren, und verwenden Sie die IP-Primer.

Die IP-Primer verfügen jeweils über einen Barcode mit sechs Basenpaaren und spezifische Sequenzen, die von der Next-Generation-Sequencing-Plattform erkannt werden. Als nächstes geben Sie drei Mikroliter des zweiten PCR-Produkts auf ein 2%Agarose-Gel. Die Bibliothek sollte einen Abstrich mit dem Großteil des Signals zwischen 200 und 600 Basenpaaren aufweisen, und es sollte keine Verstärkung in der Kontrollreaktion beobachtbar sein.

Reinigen Sie anschließend die Genombibliotheken mit einem PCR-Aufreinigungskit und eluieren Sie die DNA mit 30 Mikrolitern Elutionspuffer. Messen Sie dann die DNA-Konzentration mit einem Fluorometer. Berechnen Sie nun das Volumen jeder Bibliothek, das für 15 bis 20 Nanogramm DNA benötigt wird.

Mischen Sie die Bibliotheken und bestimmen Sie die molare DNA-Konzentration im Pool mit einem öffentlich zugänglichen Rechner. Senden Sie nun die gepoolten Genombibliotheken zur Hochdurchsatz-Sequenzierung. Verarbeiten Sie später die FASTQ-Dateien, die Sie bei der Sequenzierung mit Open-Source-Software erhalten haben, und analysieren Sie die Ergebnisse.

Acht Hamster wurden mit einem Milliliter gepoolter Transposon-Mutanten konfrontiert und die Infektion konnte sich vier Tage lang entwickeln. Nach der Extraktion der DNA aus der Leber dieser Hamster wurde sie geschoren und auf einem Agarosegel charakterisiert. Die meisten Fragmente waren zwischen 200 und 600 Basenpaare.

Nach dem Hinzufügen von C-Schwanz zur gescherten DNA wurden PCRs zur Erstellung von Genombibliotheken verwendet. Eine Elektrophorese wurde durchgeführt, um die Größe der PCR-Produkte zu bestätigen. Die Größe der meisten PCR-Produkte lag zwischen 200 und 600 Basenpaaren.

Nach der Verarbeitung der Sequenzier-Reads wurden die Ausgangs-/Eingangsverhältnisse mit dem Transposon-Sequenzierungsansatz bestimmt. Wie erwartet zeigen Mutanten, die als virulent bekannt sind, wie flaA1 und IlgB, keine Veränderung der Fitness. Im Gegensatz dazu zeigen Mutanten, von denen bekannt ist, dass sie abgeschwächt sind, wie z.B. loa22, eine Abnahme der Fitness.

Es wurden Mutanten mit einem reduzierten in vivo Fitnesslevel identifiziert, wie z.B. lic12327. Nachfolgende Experimente zeigten, dass die Virulenz dieser Mutanten bei Hamstern abgeschwächt ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie genomische DNA-Bibliotheken generiert werden, um Mutanten mit veränderter In-vivo-Fitness zu quantifizieren und zu identifizieren.

Nachdem Mutanten mit in vivo Fitnessdefekten identifiziert wurden, können diese einzeln an Hamstern getestet werden, um festzustellen, ob ihre Virulenz abgeschwächt ist. Vergessen Sie nicht, dass Leptospira interrogans tödlich sein können und mit BSL2-Containment behandelt werden müssen. Beim Umgang mit den Bakterien muss persönliche Schutzausrüstung wie Handschuhe und ein Laborkittel getragen werden.