Name: Hochdurchsatz-parallele Sequenzierung Maßnahme Fitness Leptospira Interrogans Transposon Insertion Mutanten während Golden syrischen Hamster Infektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Erfahren Sie eine Hochdurchsatz-Transposon-Sequenzierungsmethode zur Identifizierung von Fitness-Defekten in Leptospira interrogans Mutanten während der Infektion im Hamstermodell.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch eine Veterans Affairs Merit Award (für D.A.H.) und eine National Institute of Health gewähren R01 AI 034431 (D.A.H.).

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Zwar ergibt sich aus unseren Pilotversuch für Hamster mit 42 L. Interrogans Mutanten intraperitoneal herausgefordert17präsentiert werden, erwarten wir, dass größere Pools von Mutanten durch Tn-FF abgeschirmt werden können Da die Frequenz der Transconjugants niedrig ist (100-200 Transconjugants/Paarungen), mehrere Paarungen sind notwendig, um eine ausreichende Anzahl von Mutanten für große Tn-Seq-Experimente zu erzeugen. Eine große Anzahl von Mutanten in flüssigen Kulturen pflegen präsenti...

Identifizierung von Genen Virulenz für manche Bakterien, wie z. B. Leptospira spp., ist schwierig, wegen der begrenzten Zahl der genetischen Werkzeuge zur Verfügung. Eine häufig verwendete Methode ist die Erstellung einer Sammlung von Mutanten durch zufällige Transposon Mutagenese, gefolgt von der Identifikation der Insertionsstelle in jeder Mutant und Virulenz von einzelnen Transposon Mutanten in einem Tiermodell testen. Dieser Ansatz ist zeitaufwendig, teuer und erfordert eine große Anzahl von Tieren.
Als zufällige Mutagenese zunächst für den Erreger Leptospira Interrogansentwickelt wurde, wurden an Virulenz beteiligten Gene identifiziert, durch die Prüfung einzelner Mutanten in einem Tiermodell1. Mutanten wurden basierend auf Kriterien wie ihre mögliche Rolle bei der Signalisierung oder Motilität oder ihrer vorhergesagten Außenmembran oder Oberfläche Speicherort ausgewählt. Da die Mehrzahl der Leptospiral Gene kodieren hypothetischen Proteine der unbekannten Funktion2, Auswahl durch Mutation entstehende Variationen anhand dieser Kriterien Grenzen die Möglichkeit, neuartige Leptospiral Virulenz Gene zu entdecken.
Pools von L. Interrogans Transposon Mutanten wurden in jüngerer Zeit, für die Infektiosität in der Hamster und Maus Modelle3gezeigt. Jedes Tier wurde mit einem Pool von bis zu 10 Mutanten in Frage gestellt. Infektiosität einer Mutante erzielte er als positiv, wenn sie durch PCR Kulturen gewonnenen Blut und Niere festgestellt worden. PCR-Tests war mühsam, weil es eine individuelle PCR-Reaktion für jede Mutante im Pool erforderlich. Da die Frequenz jeder Mutant in den Kulturen nicht quantifiziert wurde, war der Ansatz zur Identifizierung von stark abgeschwächte Mutanten voreingenommen.
Wir beschreiben ein Transposon Sequenzierung (Tn-Seq) Technik, als eine Strategie, um effizienter Bildschirm für Virulenz Gene. TN-Seq besteht aus der Erstellung einer Bibliothek von Mutanten durch Transposon Mutagenese gefolgt von massiven parallelen Sequenzierung4,5,6. Transposon Mutanten sind kurz, gebündelt, in die Tiere geimpft und später erholte sich von verschiedenen Organen (Ausgabe Pools). Die DNA von den Ausgabe-Pools wird extrahiert und mit Restriktionsenzymen verdaut oder durch Ultraschallbehandlung geschert. Zwei Runden von PCR gezielt die Kreuzungen der Transposon Einfügung Seiten erfolgen. Dieser Schritt ermöglicht die Zugabe von den Adaptern für die Sequenzierung erforderlich. Die daraus resultierende PCR-Produkte werden von Hochdurchsatz-Sequenzierung Transposon Insertionsstelle jede Mutante des Pools zusammen mit ihrer relativen Fülle, zu identifizieren, die im Vergleich zu der ursprünglichen Zusammensetzung der Pool der Mutant analysiert.
Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist die Fähigkeit, gleichzeitig eine große Anzahl von Mutanten mit einer kleinen Anzahl von Tieren auf den Bildschirm. TN-Seq erfordert keine Vorkenntnisse der Transposon Einfügung Websites die erhöht die Chancen der Entdeckung neuer Leptospiren-spezifischen Genen in Virulenz mit weniger Zeit und mehr Effizienz. Weil Leptospiral Belastung im Gewebe relativ hoch in Nagetier-Modelle anfällig für tödliche Infektion (in der Regel 104 108 Bakterien/g Gewebe)7,8,9 ebenso wie Reservoirwirten 10,11, Gewebe direkt analysiert werden können, ohne die Notwendigkeit, Kultur, Verringerung der Verzerrungen durch in-vitro- Wachstum.
In Tn-Seq-Studien mit den meisten bakteriellen Erregern, die bisher beschrieben erlaubt die hohe Frequenz der insertional Mutagenese Infektion mit großen Pools mit Mutanten, die gemeinsam mit mehreren eng beieinander liegender Transposon Einfügungen innerhalb jedes Gen4 ,12,13,14. TN-Seq wurde auch für ein Bakterium entwickelt für die Mutagenese-Frequenz viel niedriger6 ist. Mit Leptospirakann eine Bibliothek von Transposon Mutanten erzeugt werden, durch die Einführung des Transposons auf ein konduktiven Plasmid durch Konjugation wie von Slamti Et Al15beschrieben. Die Häufigkeit der Transposon Mutagenese von L. Interrogans ist jedoch gering. Wenn das Transposon Himar1 auf ein konjugative Plasmid eingeführt wurde, wurde die Transconjugant Häufigkeit berichtet, nur 8,5 x 10-8 pro Empfänger mit der Lai-Belastung von L. Interrogans16 Zelle und wird voraussichtlich ähnlich schlecht mit den meisten anderen Sorten von L. Interrogans. Das hier beschriebene Protokoll ist im Teil auf der Grundlage, die für Borrelia Burgdorferi, entwickelt in denen die Häufigkeit von Transposon insertional Mutagenese ist auch niedrig6.
Für unsere Pilotversuch mit der Protokoll-17führten wir Transposon Mutagenese mit L. Interrogans Serovar Manilae Stamm L495 aufgrund des Erfolges der anderen Gruppen isolieren Transposon Einfügung Mutanten in den Stamm zusammen mit seinem tief LD50 (letale Dosis) für Virulenz1. Wir 42 Mutanten durch Tn-Seq abgeschirmt und identifiziert mehrere mutierte Kandidaten in Virulenz, darunter zwei mit Einfügungen in einem Kandidaten-Adenylat-Cyclase-gen defekt. Einzelprüfung der beiden Mutanten in Hamster bestätigt, dass sie einen Mangel an Virulenz17waren.

<table><tbody><tr><td>Kanamycinsulfat aus Streptomyces kanamyceticus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4000</td><td></td></tr><tr><td>2,6-Diaminopimelsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1377</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin-Dihydrochlorid-Pentahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>Axio Lab A1 Mikroskop mit Dunkelfeldkondensor</td><td>Zeiss</td><td>490950-001-000</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blut- und Gewebe-Kit</td><td>Qiagen</td><td>69504/69506</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR-Aufreinigung</td><td>Qiagen</td><td>28004/28006</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28104/28106</td><td></td></tr><tr><td>Modell 505 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-505</td><td></td></tr><tr><td>2,5" Cup-Horn</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-4625</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor 24</td><td>Omni International</td><td>19-010</td><td>Schritt 3.1.2.4</td></tr><tr><td>Endständige Desoxynukleotidyltransferase</td><td>Promega</td><td>M828C</td><td></td></tr><tr><td>Mastermix Phusion</td><td>Thermo Scientific</td><td>F531</td><td>Vorbereitung von Genombibliotheken, Schritt 3.4.</td></tr><tr><td>DreamTaq Master Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>K9011/K9012</td><td>Identifizierung der Transposon-Insertionsstelle, Schritt 1.2.</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>ddCTP</td><td>Affymetrix/ USBProdukte</td><td>77112</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermocycler</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>Schritt 3.6.</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851/Q32854</td><td>Schritt 3.6.</td></tr><tr><td>Qubit Prüfgefäße</td><td>life technologies</td><td>Q32856</td><td>Schritt 3.6.</td></tr><tr><td>PBS pH 7.2 (1X)</td><td>Gibco</td><td>20012-027 20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Einwegskalpell Nr. 10</td><td>Feder</td><td>2975#10</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff K2 EDTA 2 ml Röhrchen</td><td>BD Vacutainer</td><td>367841</td><td></td></tr><tr><td>Spritze U-100 mit 26G x &frac12; &rdquo; Nadel</td><td>BD Vacutainer</td><td>329652</td><td>IP Challenge, Schritt 2.2.1.</td></tr><tr><td>3 mL Luer-Lok Spitzenspritze</td><td>BD Vacutainer 309657</td><td></td><td>Herzpunktion, Schritt 2.4.2.</td></tr><tr><td>25G x 5/8" Nadel</td><td>BD Vacutainer</td><td>305901</td><td>Herzpunktion, Schritt 2.4.2.</td></tr><tr><td>25 mm Frittenglasboden mit Stopfen</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002502</td><td>Filtrationseinheitssystem, Stufe 1.1.7.</td></tr><tr><td>25 mm Aluminium-Federklappe</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002503</td><td>Filtrationseinheitssystem, Stufe 1.1.7.</td></tr><tr><td>15 ml Borosilkat-Glastrichter</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002514</td><td>Filtrationseinheit, Schritt 1.1.7.</td></tr><tr><td>125 ml Seitenarm-Erlenmeyerkolben</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002505</td><td>Filtrationseinheitssystem, Stufe 1.1.7.</td></tr><tr><td>Acetat-Zellulose-Filter VVPP (Porengröße 0,1 mm; Durchmesser 25 mm)</td><td>EMD Millipore</td><td>VVLP02500</td><td></td></tr></tbody></table>

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High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In diesem Manuskript beschreiben wir ein Transposon Sequenzierung (Tn-Seq) Technik zu identifizieren und quantifizieren Leptospira Interrogans Mutanten in Fitness während der Infektion von syrischen Goldhamster verändert. TN-Seq kombiniert mit der Kraft der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie zufällige Transposon Mutagenese. Tiere sind gefordert, mit einem Pool von Transposon Mutanten (Eingang Schwimmbad), gefolgt von der Gewinnung von Blut und Gewebe ein paar Tage später zu identifizieren und zu quantifizieren, die Anzahl der Mutanten in jedes Organ (Ausgabe Pools). Die Ausgabe-Pools sind gegenüber den Eingang Pool, der in Vivo -Fitness jeden Mutante zu bewerten. Dieser Ansatz ermöglicht Screening von einem großen Pool von Mutanten in einer begrenzten Anzahl von Tieren. Mit geringfügigen Änderungen kann dieses Protokoll mit jeder Tiermodell der Leptospirose, Reservoir Host wie Ratten und akute Infektionsmodelle wie Hamster, sowie in-vitro- Studien durchgeführt werden. TN-Seq ist ein leistungsstarkes Tool zum Bildschirm für Mutanten mit in Vivo und in Vitro Fitness Mängel.

Aufbau einer Bibliothek von Transposon Mutanten in L. Interrogans durch Konjugation erfordert eine Filteranlage, wie in Abbildung 1dargestellt. Von jeder Paarung erholt wir 100-200 Transconjugants.
Transposon Insertionsstelle in jeder Mutant durch Sequenzierung das PCR-Produkt erzeugt durch semi-random PCR, die zum Jahresende das Transposon Ziel identifiziert und angrenzenden Host-Sequenzen...

Wir beschreiben hier eine Technik, die verbindet Transposon Mutagenese mit Hochdurchsatz-Sequenzierung zu identifizieren und quantifizieren Transposon Leptospiral Mutanten im Gewebe nach einem Zweikampf von Hamstern. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Bildschirm Mutanten für überleben und Verbreitung bei Tieren und kann auch auf in-vitro- Studien angewendet werden.

Hochdurchsatz-parallele Sequenzierung Maßnahme Fitness Leptospira Interrogans Transposon Insertion Mutanten während Golden syrischen Hamster Infektion

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Das übergeordnete Ziel dieser Hochdurchsatz-Transposon-Sequenzierungstechnik ist es, Transposon-Mutanten mit in vivo und in vitro Fitnessdefekten zu identifizieren und zu quantifizieren und dadurch Leptospira-Gene zu identifizieren, die an der Virulenz beteiligt sind. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Leptospiren zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung von Genen, die an der Besiedlung, Verbreitung und dem Überleben der Bakterien im Wirt beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine große Anzahl von Mutanten mit einer begrenzten Anzahl von Tieren gescreent werden kann.Obwohl diese Methode entwickelt wurde, um die Fitness von Leptospira interrogans-Mutanten im Hamstermodell mit akuter Leptospirose zu untersuchen, kann sie auch durch chronische Infektionsmodelle, in vitro Studien und andere Stämme von Leptospira angewendet werden. Das Verfahren wird von Kritel Lourdault und Karen Evangelista, beides Postdoktorandinnen aus meinem Labor, demonstriert. Montieren Sie zunächst eine Filtereinheit.Legen Sie den Boden auf einen 125-Milliliter-Erlenmeyerkolben mit Seitenarm. Positionieren Sie einen Acetat-Zellulose-Filter an der Basi

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Enterobacter sp. Ysu wächst in Glucose-Minimalsalzmedium. Auxotrophe werden durch Transformation mit einem transposome die zufällig fügt sich in das Wirtsgenom erzeugt. Mutanten werden durch Replika-Plattierung aus komplexen Medium, um Minimalmedium gefunden. Unterbrochen Gene durch Gen Rettungs- und Sequenzierung identifiziert.

Erzeugung Enterobacter Sp. Ysu Auxotrophe Mit Transposon-Mutagenese

Coxiella burnetii ist ein obligat intrazelluläre Gram-negative Bakterium für die Zoonose Q-Fieber verantwortlich. Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung von Coxiella Fluoreszenz Transposon-Mutanten als auch die automatisierte Identifizierung und Analyse der resultierenden Internalisierung, Replikation und zytotoxische Phänotypen.

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Präsentiert hier ist eine einfache Methode zum Erstellen einer High-Density Transposon Einfügung Bibliothek in Escherichia coli oder Shigella Flexneri mit bakteriellen Konjugation. Dieses Protokoll ermöglicht die Erstellung einer Sammlung von Hunderten von Tausenden von einzigartigen Mutanten in Bakterien durch die zufällige genomische Einfügung ein Transposon.

Schaffung einer dichten Transposon Insertion Bibliothek verwenden bakterielle Konjugation in Enterobacterial Stämme wie Escherichia Coli oder Shigella flexneri

Man (PN) Injektion von den gruppierten dazwischen regelmäßig kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) und CRISPR-assoziierten Protein-9 Nuklease (CRISPR/Cas9) System ist ein hocheffizientes Verfahren zur Herstellung gentechnisch veränderter syrischen Goldhamster. Hier beschreiben wir die detaillierte PN Injektion Protokoll zur Herstellung von gen-Knockout-Hamster mit dem CRISPR/Cas9-System.

Produktion von gentechnisch syrischen Goldhamster durch man Injektion des Komplexes CRISPR/Cas9

Dieser molekulare Ansatz zur Bestimmung der bakteriellen Fitness ermöglicht die präzise und genaue Detektion von Mikroorganismen mithilfe einzigartiger genomischer DNA-Barcodes, die über digitale PCR quantifiziert werden. Das Protokoll beschreibt die  Berechnung des Wettbewerbsindex für Salmonellenstämme; Die Technologie ist jedoch leicht an Protokolle anpassbar, die eine absolute Quantifizierung jedes genetisch verformbaren Organismus erfordern.

Digitaler PCR-basierter Wettbewerbsindex für High-Throughput-Analyse der Fitness bei Salmonellen

Die reziproke Hemizygosität durch Sequenzierung (RH-seq) ist eine leistungsstarke neue Methode, um die genetische Grundlage eines Merkmalsunterschieds zwischen den Arten abzubilden. Pools von Hemizygoten werden durch Transposon-Mutagenese erzeugt und ihre Fitness wird durch Wettbewerbswachstum mit einer durchgehenden Sequenzierung verfolgt. Die Analyse der resultierenden Daten zeigt Gene, die dem Merkmal zugrunde liegen.

Genetische Kartierung von Thermotoleranzunterschieden zwischen Spezies von Saccharomyces Hefe über Genom-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Wir beschreiben eine Methode zur Generierung von sättigungsverstärkenden Mutationsbibliotheken in gramnegativen Bakterien und der anschließenden Herstellung von DNA-Amplikonbibliotheken für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Als Beispiel konzentrieren wir uns auf den ESKAPE-Erreger Acinetobacter baumannii, aber dieses Protokoll ist für eine Vielzahl von Gram-negativen Organismen zugänglich.

Generieren von Transposon-Einfügungsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz

Hier wird die Anwendung der CRISPR-Interferenz (CRISPRi) für spezifisches Gen-Silencing bei Leptospira-Spezies beschrieben. Leptospira-Zellen werden durch Konjugation mit Plasmiden transformiert, die dCas9 (katalytisch "totes" Cas9) und eine Single-Guide-RNA (sgRNA) exprimieren, die für die Basenpaarung zum gewünschten genomischen Ziel verantwortlich ist. Methoden zur Validierung des Gen-Silencing werden vorgestellt.

Anwendung der CRISPR-Interferenz (CRISPRi) zur Gen-Silencing bei pathogenen Leptospira-Spezies

Dies ist eine angepasste Methode zur Identifizierung von Kandidaten für Insektenbesiedlungsfaktoren in einem Burkholderia-nützlichen Symbionten. Der Käferwirt ist mit einer zufälligen mutanten Bibliothek infiziert, die durch Transposonmutagenese erzeugt wird, und die Bibliothekskomplexität nach der Kolonisation wird mit einer in vitro gezüchtetenKontrolle verglichen.

Transposon-Insertionssequenzierung als Werkzeug zur Aufklärung bakterieller Besiedlungsfaktoren in einem Burkholderia gladioli Symbionten von Lagria villosa Käfern

In dieser Arbeit präsentieren wir eine longitudinale Auswertung von Goldhamstern, die intraperitoneal (IP) oder intragingival (IG) mit L. infantum-Luc infiziert wurden, mittels biolumineszierender Bildgebung und mittels PCR. Hamster wurden 1 Tag nach der Infektion (1 dpi), 1 Woche nach der Infektion (8 dpi) und 3 Wochen nach der Infektion (22 dpi) untersucht und bei der 50. dpi und 8 Monate nach der Infektion euthanasiert.

Im lebenden Organismus Bildgebung von mit Leishmania infantum infizierten Hamstern durch gingivale Inokulation von axenischen Amastigoten, die Luciferase exprimieren

Dieses Protokoll liefert einen modularen BSL-2-Workflow, der Kristall-Violett-Biomasse-Assays, Zeitraffer-Phasenkontrastkinetik, konfokale 3D/Matrix-Kartierung, SEM-Ultrastruktur und ein Modul zur Hamsterinfektion in vivo kombiniert, um die funktionelle Rolle des Leptospira-Biofilms zu kultivieren, quantifizieren, charakterisieren und untersuchen und so eine standardisierte Bewertung von Mutanten und Anti-Biofilm-Interventionen in Laboren ermöglicht.

Ein modularer Arbeitsablauf für quantitative, strukturelle und funktionale Analyse von Leptospira-Biofilmen

Erfahren Sie eine Hochdurchsatz-Transposon-Sequenzierungsmethode zur Identifizierung von Fitness-Defekten in Leptospira interrogans Mutanten während der Infektion im Hamstermodell.

Hochdurchsatz-parallele Sequenzierung Maßnahme Fitness Leptospira Interrogans Transposon Insertion Mutanten während Golden syrischen Hamster Infektion (Video) | JoVE Journal

Hochdurchsatz-parallele Sequenzierung Maßnahme Fitness Leptospira Interrogans Transposon Insertion Mutanten während Golden syrischen Hamster Infektion

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