Name: Hochdurchsatz-parallele Sequenzierung Maßnahme Fitness Leptospira Interrogans Transposon Insertion Mutanten während Golden syrischen Hamster Infektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Erfahren Sie eine Hochdurchsatz-Transposon-Sequenzierungsmethode zur Identifizierung von Fitness-Defekten in Leptospira interrogans Mutanten während der Infektion im Hamstermodell.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch eine Veterans Affairs Merit Award (für D.A.H.) und eine National Institute of Health gewähren R01 AI 034431 (D.A.H.).

<ol><li>Murray, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+transposon+mutagenesis+in+pathogenic+Leptospira+species%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species.</a> Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).</li>
<li>Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+leptospirosis%3A+the+influence+of+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics.</a> Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).</li>
<li>Marcsisin, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+high-throughput+screen+to+identify+Leptospira+mutants+unable+to+colonize+the+carrier+host+or+cause+disease+in+the+acute+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection.</a> J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).</li>
<li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).</li>
<li>van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+fitness+and+genetic+interactions+determined+by+Tn-seq%2C+a+high-throughput+massively+parallel+sequencing+method+for+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms.</a> Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).</li>
<li>Troy, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+barriers+to+Borrelia+burgdorferi+dissemination+during+infection+using+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing.</a> Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).</li>
<li>Wunder, E. A. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+reveals+rapid+dissemination+of+Leptospira+interrogans+after+intraperitoneal+and+conjunctival+inoculation+of+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters.</a> Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).</li>
<li>Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantitative+real-time+PCR+for+studying+the+dissemination+of+Leptospira+interrogans+in+the+guinea+pig+infection+model+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis.</a> J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).</li>
<li>Coutinho, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+Leptospira+interrogans+infection+in+hamsters+after+intradermal+and+subcutaneous+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307(2014).</li>
<li>Athanazio, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rattus+norvegicus+as+a+model+for+persistent+renal+colonization+by+pathogenic+Leptospira+interrogans%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Trop%22%5BJournal%5D)">Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans.</a> Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).</li>
<li>Ratet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+bioluminescent+Leptospira+interrogans+in+mice+reveals+renal+colonization+as+a+stealth+escape+from+the+blood+defenses+and+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359(2014).</li>
<li>Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+virulence+factors+required+for+respiratory+melioidosis+using+Tn-seq+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis.</a> Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).</li>
<li>Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+insertion+mutants+within+libraries+by+deep+sequencing+and+a+genome-wide+screen+for+Haemophilus+genes+required+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).</li>
<li>Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+identification+of+resistance+functions+in+Pseudomonas+aeruginosa+using+Tn-seq%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq.</a> MBio. 2 (1), (2011).</li>
<li>Slamti, L., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+library+of+random+mutants+in+the+spirochete+Leptospira+biflexa+using+a+mariner+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon.</a> Methods Mol Biol. 859, (2012).</li>
<li>Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+transfer+between+Escherichia+coli+and+Leptospira+spp.+as+a+new+genetic+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool.</a> Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).</li>
<li>Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+parallel+sequencing+to+measure+fitness+of+Leptospira+interrogans+transposon+insertion+mutants+during+acute+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection.</a> PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117(2016).</li>
<li>Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrition+of+Leptospirapomona+and+growth+of+13+other+serotypes%3A+Fractionation+of+oleic+albumin+complex+and+a+medium+of+bovine+albumin+and+polysorbate+80%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80.</a> Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).</li>
<li>Johnson, R. C., Harris, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pathogenic+and+saprophytic+letospires.+I.+Growth+at+low+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures.</a> J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).</li>
<li>Demarre, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+family+of+mobilizable+suicide+plasmids+based+on+broad+host+range+R388+plasmid+%28IncW%29+and+RP4+plasmid+%28IncPa%29+conjugative+machineries+and+their+cognate+Escherichia+coli+host+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains.</a> Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).</li>
<li>Vallenet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroScope%3A+a+platform+for+microbial+genome+annotation+and+comparative+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Database+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics.</a> Database (Oxford). , bap021(2009).</li>
<li>Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+microbial+fitness+determinants+by+insertion+sequencing+using+genome-wide+transposon+mutant+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries.</a> Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).</li>
<li>Miller, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+J+%22Spirochetes+in+body+fluids+and+tissues+manual+of+investigative+methods%22">Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods</a>. , 22-23 (1971).</li>
<li>Ristow, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OmpA-like+protein+Loa22+is+essential+for+leptospiral+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence.</a> PLoS Pathog. 3 (7), (2007).</li>
<li>Croda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+pathogenic+Leptospira+species%3A+disruption+of+the+LigB+gene+does+not+affect+virulence+in+animal+models+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis.</a> Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).</li>
<li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hamster+model+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hamster model of leptospirosis.</a> Curr Protoc Microbiol. 12, 2(2006).</li>
<li>Giardine, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy%3A+a+platform+for+interactive+large-scale+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis.</a> Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).</li>
<li>Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy%3A+a+comprehensive+approach+for+supporting+accessible%2C+reproducible%2C+and+transparent+computational+research+in+the+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences.</a> Genome Biol. 11 (8), R86(2010).</li>
<li>Blankenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy%3A+a+web-based+genome+analysis+tool+for+experimentalists%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists.</a> Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).</li>
<li>McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGenTA%3B+a+Galaxy+implemented+tool+for+complete+Tn-Seq+analysis+and+data+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization.</a> Bioinformatics. , 1367(2017).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+fitness+landscapes+of+Vibrio+cholerae+at+important+stages+of+its+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle.</a> PLoS Pathog. 9 (12), e1003800(2013).</li>
<li>Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+markers+for+genetic+manipulations+of+Leptospira+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp.</a> Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).</li>
<li>van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+insertion+sequencing%3A+a+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).</li>
<li>Pappas, C. J., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+gene+expression+in+Leptospira+spp.+by+Transcription+activator-like+effectors+demonstrates+a+potential+role+for+LigA+and+LigB+in+Leptospira+interrogans+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence.</a> Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).</li>
<li>Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection-driven+gene+loss+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Selection-driven gene loss in bacteria.</a> PLoS Genet. 8 (6), e1002787(2012).</li>
<li>Troy, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Tn-seq+analysis+of+carbohydrate+utilization+and+vertebrate+infectivity+of+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi.</a> Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).</li>
<li>Ramsey, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+genetic+screen+identifies+previously+uncharacterized+Borrelia+burgdorferi+genes+important+for+resistance+against+reactive+oxygen+and+nitrogen+species%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species.</a> PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225(2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Zwar ergibt sich aus unseren Pilotversuch für Hamster mit 42 L. Interrogans Mutanten intraperitoneal herausgefordert17präsentiert werden, erwarten wir, dass größere Pools von Mutanten durch Tn-FF abgeschirmt werden können Da die Frequenz der Transconjugants niedrig ist (100-200 Transconjugants/Paarungen), mehrere Paarungen sind notwendig, um eine ausreichende Anzahl von Mutanten für große Tn-Seq-Experimente zu erzeugen. Eine große Anzahl von Mutanten in flüssigen Kulturen pflegen präsenti...

Identifizierung von Genen Virulenz für manche Bakterien, wie z. B. Leptospira spp., ist schwierig, wegen der begrenzten Zahl der genetischen Werkzeuge zur Verfügung. Eine häufig verwendete Methode ist die Erstellung einer Sammlung von Mutanten durch zufällige Transposon Mutagenese, gefolgt von der Identifikation der Insertionsstelle in jeder Mutant und Virulenz von einzelnen Transposon Mutanten in einem Tiermodell testen. Dieser Ansatz ist zeitaufwendig, teuer und erfordert eine große Anzahl von Tieren.
Als zufällige Mutagenese zunächst für den Erreger Leptospira Interrogansentwickelt wurde, wurden an Virulenz beteiligten Gene identifiziert, durch die Prüfung einzelner Mutanten in einem Tiermodell1. Mutanten wurden basierend auf Kriterien wie ihre mögliche Rolle bei der Signalisierung oder Motilität oder ihrer vorhergesagten Außenmembran oder Oberfläche Speicherort ausgewählt. Da die Mehrzahl der Leptospiral Gene kodieren hypothetischen Proteine der unbekannten Funktion2, Auswahl durch Mutation entstehende Variationen anhand dieser Kriterien Grenzen die Möglichkeit, neuartige Leptospiral Virulenz Gene zu entdecken.
Pools von L. Interrogans Transposon Mutanten wurden in jüngerer Zeit, für die Infektiosität in der Hamster und Maus Modelle3gezeigt. Jedes Tier wurde mit einem Pool von bis zu 10 Mutanten in Frage gestellt. Infektiosität einer Mutante erzielte er als positiv, wenn sie durch PCR Kulturen gewonnenen Blut und Niere festgestellt worden. PCR-Tests war mühsam, weil es eine individuelle PCR-Reaktion für jede Mutante im Pool erforderlich. Da die Frequenz jeder Mutant in den Kulturen nicht quantifiziert wurde, war der Ansatz zur Identifizierung von stark abgeschwächte Mutanten voreingenommen.
Wir beschreiben ein Transposon Sequenzierung (Tn-Seq) Technik, als eine Strategie, um effizienter Bildschirm für Virulenz Gene. TN-Seq besteht aus der Erstellung einer Bibliothek von Mutanten durch Transposon Mutagenese gefolgt von massiven parallelen Sequenzierung4,5,6. Transposon Mutanten sind kurz, gebündelt, in die Tiere geimpft und später erholte sich von verschiedenen Organen (Ausgabe Pools). Die DNA von den Ausgabe-Pools wird extrahiert und mit Restriktionsenzymen verdaut oder durch Ultraschallbehandlung geschert. Zwei Runden von PCR gezielt die Kreuzungen der Transposon Einfügung Seiten erfolgen. Dieser Schritt ermöglicht die Zugabe von den Adaptern für die Sequenzierung erforderlich. Die daraus resultierende PCR-Produkte werden von Hochdurchsatz-Sequenzierung Transposon Insertionsstelle jede Mutante des Pools zusammen mit ihrer relativen Fülle, zu identifizieren, die im Vergleich zu der ursprünglichen Zusammensetzung der Pool der Mutant analysiert.
Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist die Fähigkeit, gleichzeitig eine große Anzahl von Mutanten mit einer kleinen Anzahl von Tieren auf den Bildschirm. TN-Seq erfordert keine Vorkenntnisse der Transposon Einfügung Websites die erhöht die Chancen der Entdeckung neuer Leptospiren-spezifischen Genen in Virulenz mit weniger Zeit und mehr Effizienz. Weil Leptospiral Belastung im Gewebe relativ hoch in Nagetier-Modelle anfällig für tödliche Infektion (in der Regel 104 108 Bakterien/g Gewebe)7,8,9 ebenso wie Reservoirwirten 10,11, Gewebe direkt analysiert werden können, ohne die Notwendigkeit, Kultur, Verringerung der Verzerrungen durch in-vitro- Wachstum.
In Tn-Seq-Studien mit den meisten bakteriellen Erregern, die bisher beschrieben erlaubt die hohe Frequenz der insertional Mutagenese Infektion mit großen Pools mit Mutanten, die gemeinsam mit mehreren eng beieinander liegender Transposon Einfügungen innerhalb jedes Gen4 ,12,13,14. TN-Seq wurde auch für ein Bakterium entwickelt für die Mutagenese-Frequenz viel niedriger6 ist. Mit Leptospirakann eine Bibliothek von Transposon Mutanten erzeugt werden, durch die Einführung des Transposons auf ein konduktiven Plasmid durch Konjugation wie von Slamti Et Al15beschrieben. Die Häufigkeit der Transposon Mutagenese von L. Interrogans ist jedoch gering. Wenn das Transposon Himar1 auf ein konjugative Plasmid eingeführt wurde, wurde die Transconjugant Häufigkeit berichtet, nur 8,5 x 10-8 pro Empfänger mit der Lai-Belastung von L. Interrogans16 Zelle und wird voraussichtlich ähnlich schlecht mit den meisten anderen Sorten von L. Interrogans. Das hier beschriebene Protokoll ist im Teil auf der Grundlage, die für Borrelia Burgdorferi, entwickelt in denen die Häufigkeit von Transposon insertional Mutagenese ist auch niedrig6.
Für unsere Pilotversuch mit der Protokoll-17führten wir Transposon Mutagenese mit L. Interrogans Serovar Manilae Stamm L495 aufgrund des Erfolges der anderen Gruppen isolieren Transposon Einfügung Mutanten in den Stamm zusammen mit seinem tief LD50 (letale Dosis) für Virulenz1. Wir 42 Mutanten durch Tn-Seq abgeschirmt und identifiziert mehrere mutierte Kandidaten in Virulenz, darunter zwei mit Einfügungen in einem Kandidaten-Adenylat-Cyclase-gen defekt. Einzelprüfung der beiden Mutanten in Hamster bestätigt, dass sie einen Mangel an Virulenz17waren.

<table><tbody><tr><td>Kanamycinsulfat aus Streptomyces kanamyceticus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4000</td><td></td></tr><tr><td>2,6-Diaminopimelsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1377</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin-Dihydrochlorid-Pentahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>Axio Lab A1 Mikroskop mit Dunkelfeldkondensor</td><td>Zeiss</td><td>490950-001-000</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blut- und Gewebe-Kit</td><td>Qiagen</td><td>69504/69506</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR-Aufreinigung</td><td>Qiagen</td><td>28004/28006</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28104/28106</td><td></td></tr><tr><td>Modell 505 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-505</td><td></td></tr><tr><td>2,5" Cup-Horn</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-4625</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor 24</td><td>Omni International</td><td>19-010</td><td>Schritt 3.1.2.4</td></tr><tr><td>Endständige Desoxynukleotidyltransferase</td><td>Promega</td><td>M828C</td><td></td></tr><tr><td>Mastermix Phusion</td><td>Thermo Scientific</td><td>F531</td><td>Vorbereitung von Genombibliotheken, Schritt 3.4.</td></tr><tr><td>DreamTaq Master Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>K9011/K9012</td><td>Identifizierung der Transposon-Insertionsstelle, Schritt 1.2.</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>ddCTP</td><td>Affymetrix/ USBProdukte</td><td>77112</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermocycler</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>Schritt 3.6.</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851/Q32854</td><td>Schritt 3.6.</td></tr><tr><td>Qubit Prüfgefäße</td><td>life technologies</td><td>Q32856</td><td>Schritt 3.6.</td></tr><tr><td>PBS pH 7.2 (1X)</td><td>Gibco</td><td>20012-027 20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Einwegskalpell Nr. 10</td><td>Feder</td><td>2975#10</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff K2 EDTA 2 ml Röhrchen</td><td>BD Vacutainer</td><td>367841</td><td></td></tr><tr><td>Spritze U-100 mit 26G x &frac12; &rdquo; Nadel</td><td>BD Vacutainer</td><td>329652</td><td>IP Challenge, Schritt 2.2.1.</td></tr><tr><td>3 mL Luer-Lok Spitzenspritze</td><td>BD Vacutainer 309657</td><td></td><td>Herzpunktion, Schritt 2.4.2.</td></tr><tr><td>25G x 5/8" Nadel</td><td>BD Vacutainer</td><td>305901</td><td>Herzpunktion, Schritt 2.4.2.</td></tr><tr><td>25 mm Frittenglasboden mit Stopfen</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002502</td><td>Filtrationseinheitssystem, Stufe 1.1.7.</td></tr><tr><td>25 mm Aluminium-Federklappe</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002503</td><td>Filtrationseinheitssystem, Stufe 1.1.7.</td></tr><tr><td>15 ml Borosilkat-Glastrichter</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002514</td><td>Filtrationseinheit, Schritt 1.1.7.</td></tr><tr><td>125 ml Seitenarm-Erlenmeyerkolben</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002505</td><td>Filtrationseinheitssystem, Stufe 1.1.7.</td></tr><tr><td>Acetat-Zellulose-Filter VVPP (Porengröße 0,1 mm; Durchmesser 25 mm)</td><td>EMD Millipore</td><td>VVLP02500</td><td></td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz-parallele sequenzierung maßnahme fitness leptospira interrogans transposon insertion mutanten während golden syrischen hamster infektion

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In diesem Manuskript beschreiben wir ein Transposon Sequenzierung (Tn-Seq) Technik zu identifizieren und quantifizieren Leptospira Interrogans Mutanten in Fitness während der Infektion von syrischen Goldhamster verändert. TN-Seq kombiniert mit der Kraft der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie zufällige Transposon Mutagenese. Tiere sind gefordert, mit einem Pool von Transposon Mutanten (Eingang Schwimmbad), gefolgt von der Gewinnung von Blut und Gewebe ein paar Tage später zu identifizieren und zu quantifizieren, die Anzahl der Mutanten in jedes Organ (Ausgabe Pools). Die Ausgabe-Pools sind gegenüber den Eingang Pool, der in Vivo -Fitness jeden Mutante zu bewerten. Dieser Ansatz ermöglicht Screening von einem großen Pool von Mutanten in einer begrenzten Anzahl von Tieren. Mit geringfügigen Änderungen kann dieses Protokoll mit jeder Tiermodell der Leptospirose, Reservoir Host wie Ratten und akute Infektionsmodelle wie Hamster, sowie in-vitro- Studien durchgeführt werden. TN-Seq ist ein leistungsstarkes Tool zum Bildschirm für Mutanten mit in Vivo und in Vitro Fitness Mängel.

Aufbau einer Bibliothek von Transposon Mutanten in L. Interrogans durch Konjugation erfordert eine Filteranlage, wie in Abbildung 1dargestellt. Von jeder Paarung erholt wir 100-200 Transconjugants.
Transposon Insertionsstelle in jeder Mutant durch Sequenzierung das PCR-Produkt erzeugt durch semi-random PCR, die zum Jahresende das Transposon Ziel identifiziert und angrenzenden Host-Sequenzen...

Wir beschreiben hier eine Technik, die verbindet Transposon Mutagenese mit Hochdurchsatz-Sequenzierung zu identifizieren und quantifizieren Transposon Leptospiral Mutanten im Gewebe nach einem Zweikampf von Hamstern. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Bildschirm Mutanten für überleben und Verbreitung bei Tieren und kann auch auf in-vitro- Studien angewendet werden.

Hochdurchsatz-parallele Sequenzierung Maßnahme Fitness Leptospira Interrogans Transposon Insertion Mutanten während Golden syrischen Hamster Infektion

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Das übergeordnete Ziel dieser Hochdurchsatz-Transposon-Sequenzierungstechnik ist es, Transposon-Mutanten mit in vivo und in vitro Fitnessdefekten zu identifizieren und zu quantifizieren und dadurch Leptospira-Gene zu identifizieren, die an der Virulenz beteiligt sind. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Leptospiren zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung von Genen, die an der Besiedlung, Verbreitung und dem Überleben der Bakterien im Wirt beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine große Anzahl von Mutanten mit einer begrenzten Anzahl von Tieren gescreent werden kann.Obwohl diese Methode entwickelt wurde, um die Fitness von Leptospira interrogans-Mutanten im Hamstermodell mit akuter Leptospirose zu untersuchen, kann sie auch durch chronische Infektionsmodelle, in vitro Studien und andere Stämme von Leptospira angewendet werden. Das Verfahren wird von Kritel Lourdault und Karen Evangelista, beides Postdoktorandinnen aus meinem Labor, demonstriert. Montieren Sie zunächst eine Filtereinheit.Legen Sie den Boden auf einen 125-Milliliter-Erlenmeyerkolben mit Seitenarm. Positionieren Sie einen Acetat-Zellulose-Filter an der Basis und klemmen Sie einen Trichter auf die Basis. Schließen Sie die Filtereinheit an ein Vakuumsystem an.Geben Sie als Nächstes fünf Milliliter Leptospira-Kultur und 0,5 Milliliter E.coli-Kultur in den Trichter. Schalten Sie das Vakuum ein, um die Lösung zu filtern. Legen Sie dann den Filter mit der Bakterienseite nach oben auf eine EMJH-Platte, die mit DAP ergänzt wird.Inkubieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius über Nacht. Füllen Sie den Filter am nächsten Tag in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter EMJH und wirbeln Sie das Röhrchen 10 Sekunden lang durch, um die Bakterien in der Suspension freizusetzen. Verteilen Sie dann die Suspension auf fünf EMJH-Platten, ergänzt mit Kanamycin unter Verwendung von Glasperlen oder einem Streuer.Wickeln Sie die Platten in Parafilm ein und inkubieren Sie sie kopfüber bei 30 Grad Celsius, bis die Kolonien sichtbar sind. Wenn Kolonien sichtbar sind, sammeln Sie sie und überführen Sie sie einzeln in drei Milliliter EMJH, das Kanamycin enthält. Dann inkubieren Sie die Röhrchen bei 30 Grad Celsius und 150 U/min sieben bis 10 Tage lang oder bis zu einer Dichte von 100 Millionen Zellen pro Milliliter.Um die Transposon-Insertionsstelle zu identifizieren, führen Sie verschachtelte PCRs durch. Bereiten Sie zunächst die Mischung für die erste PCR vor. Fügen Sie dann die Proben aus der Kultur zu den PCR-Mixen hinzu.Bereiten Sie nach dem Ausführen der ersten Reaktion die Mischung für die zweite PCR vor. Fügen Sie zwei Mikroliter PCR-Produkt aus der ersten PCR hinzu, um die Reaktionsmischungen zu vervollständigen. Untersuchen Sie nach der PCR die Produkte auf einem Agarose-Gel.Fahren Sie mit der Sequenzierung der Produkte fort, um die Transposon-Insertionsstelle zu bestimmen. Um den Tierversuch zu beginnen, züchten Sie zunächst einzelne Mutanten in EMJH, die mit Kanamycin ergänzt werden. Anschließend bestimmen Sie die Kulturdichten mit einem Dunkelfeldmikroskop.Verdünnen Sie jeden kultivierten Mutantenstamm in EMJH auf die gleiche Dichte. Poolen Sie dann ein gleiches Volumen aller Mutanten, um den Eingabepool zu bilden. Fordere nun die Tiere heraus, wie im Textprotokoll beschrieben.Die Anzahl der benötigten Tiere hängt von der Größe des Eingangspools ab. Konsultieren Sie unbedingt einen Biostatistiker, um die Anzahl der zu impfenden Tiere zu bestimmen. Lassen Sie die Infektion vier Tage lang wachsen und entnehmen Sie dann Blut und Gewebe, wie im Textprotokoll beschrieben.Um die DNA aus der Blutprobe zu extrahieren, verwenden Sie ein kommerzielles Extraktionskit. Für Gewebe würfeln Sie 50 bis 80 Milligramm Gewebe in ein Millimeter große Würfel. Übertragen Sie dann die gewürfelten Taschentücher in ein Schraubröhrchen und wiegen Sie sie auf einer Präzisionswaage.Geben Sie anschließend 500 Mikroliter steriles PBS in das Röhrchen. Homogenisieren Sie es eine Minute lang mit einem Disruptor. Verwenden Sie dann ein Volumen, das 25 Milligramm Gewebe entspricht, um die DNA zu extrahieren.Verwenden Sie ein handelsübliches Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verdünnen Sie die DNA in 100 Mikrolitern Elutionspuffer. Übertragen Sie als Nächstes 50 Mikroliter extrahierter DNA in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Scheren Sie dann die DNA. Legen Sie das Röhrchen in ein mit vier Grad Celsius heißem Wasser gefülltes Horn. Lassen Sie das Ultraschallgerät drei Minuten lang laufen, während Sie einen Gehörschutz tragen.Laden Sie als Nächstes 2,5 Mikroliter der gescherten DNA in ein 2%-Agarose-Gel, um zu bestätigen, dass die meisten DNA-Fragmente unter 600 Basenpaaren liegen. Bereiten Sie als Nächstes den Reaktionsmix vor, um den DNA-Fragmenten Cytosinschwänze hinzuzufügen. Inkubieren Sie die Reaktion eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.Inaktivieren Sie dann das Enzym, indem Sie die Temperatur 20 Minuten lang auf 75 Grad Celsius erhöhen. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, reinigen Sie sie mit einem PCR-Aufreinigungskit und eluieren Sie die DNA mit 12 Mikrolitern Elutionspuffer. Führen Sie zwei PCRs aus, um die Genombibliotheken zu erstellen.Bereiten Sie für die erste PCR Mischungen mit TnkN3- und olj376-Primern vor. Der Primer TnkN3 ist spezifisch für das Transposon und der Primer olj376 ist spezifisch für das C-Leitwerk. Kombinieren Sie für jede Probe 22 Mikroliter der Mischung mit drei Mikrolitern gereinigter C-seitiger DNA.Führen Sie dann die PCR aus, wie im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie für die zweite PCR einen Mikroliter des ersten PCR-Produkts als Vorlage. Verwenden Sie für Primer pMargent2, um das Transposon anzuvisieren, und verwenden Sie die IP-Primer.Die IP-Primer verfügen jeweils über einen Barcode mit sechs Basenpaaren und spezifische Sequenzen, die von der Next-Generation-Sequencing-Plattform erkannt werden. Als nächstes geben Sie drei Mikroliter des zweiten PCR-Produkts auf ein 2%Agarose-Gel. Die Bibliothek sollte einen Abstrich mit dem Großteil des Signals zwischen 200 und 600 Basenpaaren aufweisen, und es sollte keine Verstärkung in der Kontrollreaktion beobachtbar sein.Reinigen Sie anschließend die Genombibliotheken mit einem PCR-Aufreinigungskit und eluieren Sie die DNA mit 30 Mikrolitern Elutionspuffer. Messen Sie dann die DNA-Konzentration mit einem Fluorometer. Berechnen Sie nun das Volumen jeder Bibliothek, das für 15 bis 20 Nanogramm DNA benötigt wird.Mischen Sie die Bibliotheken und bestimmen Sie die molare DNA-Konzentration im Pool mit einem öffentlich zugänglichen Rechner. Senden Sie nun die gepoolten Genombibliotheken zur Hochdurchsatz-Sequenzierung. Verarbeiten Sie später die FASTQ-Dateien, die Sie bei der Sequenzierung mit Open-Source-Software erhalten haben, und analysieren Sie die Ergebnisse.Acht Hamster wurden mit einem Milliliter gepoolter Transposon-Mutanten konfrontiert und die Infektion konnte sich vier Tage lang entwickeln. Nach der Extraktion der DNA aus der Leber dieser Hamster wurde sie geschoren und auf einem Agarosegel charakterisiert. Die meisten Fragmente waren zwischen 200 und 600 Basenpaare.Nach dem Hinzufügen von C-Schwanz zur gescherten DNA wurden PCRs zur Erstellung von Genombibliotheken verwendet. Eine Elektrophorese wurde durchgeführt, um die Größe der PCR-Produkte zu bestätigen. Die Größe der meisten PCR-Produkte lag zwischen 200 und 600 Basenpaaren.Nach der Verarbeitung der Sequenzier-Reads wurden die Ausgangs-/Eingangsverhältnisse mit dem Transposon-Sequenzierungsansatz bestimmt. Wie erwartet zeigen Mutanten, die als virulent bekannt sind, wie flaA1 und IlgB, keine Veränderung der Fitness. Im Gegensatz dazu zeigen Mutanten, von denen bekannt ist, dass sie abgeschwächt sind, wie z.B. loa22, eine Abnahme der Fitness.Es wurden Mutanten mit einem reduzierten in vivo Fitnesslevel identifiziert, wie z.B. lic12327. Nachfolgende Experimente zeigten, dass die Virulenz dieser Mutanten bei Hamstern abgeschwächt ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie genomische DNA-Bibliotheken generiert werden, um Mutanten mit veränderter In-vivo-Fitness zu quantifizieren und zu identifizieren.Nachdem Mutanten mit in vivo Fitnessdefekten identifiziert wurden, können diese einzeln an Hamstern getestet werden, um festzustellen, ob ihre Virulenz abgeschwächt ist. Vergessen Sie nicht, dass Leptospira interrogans tödlich sein können und mit BSL2-Containment behandelt werden müssen. Beim Umgang mit den Bakterien muss persönliche Schutzausrüstung wie Handschuhe und ein Laborkittel getragen werden.

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Research

Forschung

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Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Enterobacter sp. Ysu wächst in Glucose-Minimalsalzmedium. Auxotrophe werden durch Transformation mit einem transposome die zufällig fügt sich in das Wirtsgenom erzeugt. Mutanten werden durch Replika-Plattierung aus komplexen Medium, um Minimalmedium gefunden. Unterbrochen Gene durch Gen Rettungs- und Sequenzierung identifiziert.

Erzeugung Enterobacter Sp. Ysu Auxotrophe Mit Transposon-Mutagenese

Coxiella burnetii ist ein obligat intrazelluläre Gram-negative Bakterium für die Zoonose Q-Fieber verantwortlich. Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung von Coxiella Fluoreszenz Transposon-Mutanten als auch die automatisierte Identifizierung und Analyse der resultierenden Internalisierung, Replikation und zytotoxische Phänotypen.

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Präsentiert hier ist eine einfache Methode zum Erstellen einer High-Density Transposon Einfügung Bibliothek in Escherichia coli oder Shigella Flexneri mit bakteriellen Konjugation. Dieses Protokoll ermöglicht die Erstellung einer Sammlung von Hunderten von Tausenden von einzigartigen Mutanten in Bakterien durch die zufällige genomische Einfügung ein Transposon.

Schaffung einer dichten Transposon Insertion Bibliothek verwenden bakterielle Konjugation in Enterobacterial Stämme wie Escherichia Coli oder Shigella flexneri

Man (PN) Injektion von den gruppierten dazwischen regelmäßig kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) und CRISPR-assoziierten Protein-9 Nuklease (CRISPR/Cas9) System ist ein hocheffizientes Verfahren zur Herstellung gentechnisch veränderter syrischen Goldhamster. Hier beschreiben wir die detaillierte PN Injektion Protokoll zur Herstellung von gen-Knockout-Hamster mit dem CRISPR/Cas9-System.

Produktion von gentechnisch syrischen Goldhamster durch man Injektion des Komplexes CRISPR/Cas9

Dieser molekulare Ansatz zur Bestimmung der bakteriellen Fitness ermöglicht die präzise und genaue Detektion von Mikroorganismen mithilfe einzigartiger genomischer DNA-Barcodes, die über digitale PCR quantifiziert werden. Das Protokoll beschreibt die  Berechnung des Wettbewerbsindex für Salmonellenstämme; Die Technologie ist jedoch leicht an Protokolle anpassbar, die eine absolute Quantifizierung jedes genetisch verformbaren Organismus erfordern.

Digitaler PCR-basierter Wettbewerbsindex für High-Throughput-Analyse der Fitness bei Salmonellen

Die reziproke Hemizygosität durch Sequenzierung (RH-seq) ist eine leistungsstarke neue Methode, um die genetische Grundlage eines Merkmalsunterschieds zwischen den Arten abzubilden. Pools von Hemizygoten werden durch Transposon-Mutagenese erzeugt und ihre Fitness wird durch Wettbewerbswachstum mit einer durchgehenden Sequenzierung verfolgt. Die Analyse der resultierenden Daten zeigt Gene, die dem Merkmal zugrunde liegen.

Genetische Kartierung von Thermotoleranzunterschieden zwischen Spezies von Saccharomyces Hefe über Genom-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Wir beschreiben eine Methode zur Generierung von sättigungsverstärkenden Mutationsbibliotheken in gramnegativen Bakterien und der anschließenden Herstellung von DNA-Amplikonbibliotheken für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Als Beispiel konzentrieren wir uns auf den ESKAPE-Erreger Acinetobacter baumannii, aber dieses Protokoll ist für eine Vielzahl von Gram-negativen Organismen zugänglich.

Generieren von Transposon-Einfügungsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz

Hier wird die Anwendung der CRISPR-Interferenz (CRISPRi) für spezifisches Gen-Silencing bei Leptospira-Spezies beschrieben. Leptospira-Zellen werden durch Konjugation mit Plasmiden transformiert, die dCas9 (katalytisch "totes" Cas9) und eine Single-Guide-RNA (sgRNA) exprimieren, die für die Basenpaarung zum gewünschten genomischen Ziel verantwortlich ist. Methoden zur Validierung des Gen-Silencing werden vorgestellt.

Anwendung der CRISPR-Interferenz (CRISPRi) zur Gen-Silencing bei pathogenen Leptospira-Spezies

Dies ist eine angepasste Methode zur Identifizierung von Kandidaten für Insektenbesiedlungsfaktoren in einem Burkholderia-nützlichen Symbionten. Der Käferwirt ist mit einer zufälligen mutanten Bibliothek infiziert, die durch Transposonmutagenese erzeugt wird, und die Bibliothekskomplexität nach der Kolonisation wird mit einer in vitro gezüchtetenKontrolle verglichen.

Transposon-Insertionssequenzierung als Werkzeug zur Aufklärung bakterieller Besiedlungsfaktoren in einem Burkholderia gladioli Symbionten von Lagria villosa Käfern

In dieser Arbeit präsentieren wir eine longitudinale Auswertung von Goldhamstern, die intraperitoneal (IP) oder intragingival (IG) mit L. infantum-Luc infiziert wurden, mittels biolumineszierender Bildgebung und mittels PCR. Hamster wurden 1 Tag nach der Infektion (1 dpi), 1 Woche nach der Infektion (8 dpi) und 3 Wochen nach der Infektion (22 dpi) untersucht und bei der 50. dpi und 8 Monate nach der Infektion euthanasiert.

Im lebenden Organismus Bildgebung von mit Leishmania infantum infizierten Hamstern durch gingivale Inokulation von axenischen Amastigoten, die Luciferase exprimieren

Dieses Protokoll liefert einen modularen BSL-2-Workflow, der Kristall-Violett-Biomasse-Assays, Zeitraffer-Phasenkontrastkinetik, konfokale 3D/Matrix-Kartierung, SEM-Ultrastruktur und ein Modul zur Hamsterinfektion in vivo kombiniert, um die funktionelle Rolle des Leptospira-Biofilms zu kultivieren, quantifizieren, charakterisieren und untersuchen und so eine standardisierte Bewertung von Mutanten und Anti-Biofilm-Interventionen in Laboren ermöglicht.

Ein modularer Arbeitsablauf für quantitative, strukturelle und funktionale Analyse von Leptospira-Biofilmen

Erfahren Sie eine Hochdurchsatz-Transposon-Sequenzierungsmethode zur Identifizierung von Fitness-Defekten in Leptospira interrogans Mutanten während der Infektion im Hamstermodell.

Hochdurchsatz-parallele Sequenzierung Maßnahme Fitness Leptospira Interrogans Transposon Insertion Mutanten während Golden syrischen Hamster Infektion (Video) | JoVE Journal

Hochdurchsatz-parallele Sequenzierung Maßnahme Fitness Leptospira Interrogans Transposon Insertion Mutanten während Golden syrischen Hamster Infektion

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