4.7: Eine Einführung in die Endozytose und Exozytose

Endozytäre und exozytäre Signalwege sind entscheidend für die zelluläre Homöostase, die Gewebefunktion und das allgemeine Überleben der Zelle. Einfach ausgedrückt ist Endozytose der Prozess, den eine Zelle nutzt, um Moleküle aus dem extrazellulären Raum aufzunehmen, indem sie ihre Membran um sich faltet und ein Vesikel bildet. Exozytose ist der umgekehrte Prozess, bei dem Vesikel verwendet werden, um Substanzen an den extrazellulären Raum abzugeben. Es wird vermutet, dass diese Prozesse eine entscheidende Rolle bei der Hormonsekretion, der Internalisierung von Membranrezeptoren, der Verschlingung von Krankheitserregern und der neuronalen Kommunikation spielen.

Heute werden wir einige der bahnbrechenden Entdeckungen auf dem Gebiet der Endozytose und Exozytose nachvollziehen, einige der unbeantworteten Fragen beleuchten, bemerkenswerte Methoden vorstellen, die heute verwendet werden, und schließlich einige spezifische Experimente untersuchen, die durchgeführt wurden, um diese Prozesse besser zu verstehen.

Schauen wir uns einige der bedeutsamen Entdeckungen an, die zum heutigen Verständnis von Endozytose und Exozytose geführt haben.

Die erste Dokumentation im Zusammenhang mit der Endozytose lässt sich bis ins Jahr 1882 zurückverfolgen, als Ilya Metchnikov mit Hilfe eines Lichtmikroskops beobachtete, dass bestimmte Zellen eindringende Krankheitserreger verschlangen. Er nannte diesen Prozess "Phagozytose", wo Zellen Krankheitserreger über Vesikelbildung verschlingen. Fast ein halbes Jahrhundert später, im Jahr 1931, beobachtete Warren Lewis einen ähnlichen Prozess der Vesikelbildung, wenn Zellen Flüssigkeit aufnahmen. Er nannte dieses Verhalten "Pinozytose".

Später im Jahr 1953 entdeckte George Palade bei der Untersuchung der strukturellen und funktionellen Organisation der Zelle "höhlenartige" Einstülpungen der Membranen, und nannte sie Caveolae. Er folgerte, dass diese für die Zellaufnahme erforderlich sein müssen. Bald darauf, im Jahr 1955, prägte der Nobelpreisträger Christian de Duve den Begriff der Endozytose, der die "Phagozytose" umfasste. und "Pinozytose". Die Geschichte der Endozytose war jedoch noch nicht zu Ende.

Im Jahr 1975 beobachteten Michael Brown und Joseph Goldstein zusammen mit dem Elektronenmikroskopie-Experten Richard Anderson, dass, wenn ein Lipoprotein niedriger Dichte (LDL) an seinen Zelloberflächenrezeptor bindet, es zur Bildung von "beschichteten Vertiefungen" führt. Diese Gruben werden dann internalisiert und endozytieren LDL-Rezeptoren. Dies war die Entdeckung des dritten Typs, der als "Rezeptor-vermittelte Endozytose" bezeichnet wird. Im selben Jahr isolierte Barbara Pearse das wichtigste Hüllprotein, ein Triskelionenmolekül, und nannte es Clathrin. Daher wird dieser Prozess auch als "Clathrin-vermittelte Endozytose" bezeichnet.

Das war auch schon alles in Bezug auf die Endozytose. Lassen Sie uns nun darüber sprechen, wie wir von der Exozytose erfahren haben. Im Jahr 1980 erzeugte die Gruppe von Randy Schekman Hefemutanten, die einen Mangel an Sekretion aufwiesen, und entdeckte das Vorhandensein kritischer Gene, die für Proteine kodierten, die für die Exozytose notwendig sind.

Im Jahr 1993 identifizierte James Rothman einige dieser Proteine, und aufgrund ihrer chemischen Natur wurden sie SNAREs genannt. In seinem bahnbrechenden ? SNARE-Hypothese,? Er schlug vor, dass diese helikalen Strukturen aneinander aneinander hängen, wodurch die Membranen mit ausreichender Kraft näher kommen, um zu verschmelzen und Exozytose zu erzeugen.

Etwa zur gleichen Zeit stellte Thomas S?dhof fest, dass dieser Prozess auch in Neuronen durch Kalzium-empfindliche Proteine, sogenannte Synaptotagminen, streng kontrolliert wurde, die die Vesikelfusion für die Freisetzung von Neurotransmittern förderten und genau zeitlich abstimmten. Gemeinsam wurden diese Wissenschaftler 2013 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet.

Trotz der Breite dieser Entdeckungen bleiben viele faszinierende Rätsel bestehen. Werfen wir einen Blick auf einige der Fragen, die heute untersucht werden.

Wissenschaftler beginnen zu fragen, wie die Funktionen von Endozytose und Exozytose über die Aufnahme und Sekretion von Substanzen hinausgehen. Wie werden zum Beispiel Neurotransmitter kontinuierlich von Vesikeln freigesetzt, die mit der Zellmembran verschmelzen, ohne dass es zu einer katastrophalen Ausdehnung der Zellgröße kommt? Sie versuchen, Signale zu identifizieren, die Zellen dazu veranlassen, Membranen zu internalisieren, um die Expansion auszugleichen und Ressourcen zu recyceln.

Ein weiteres interessantes Thema ist: Aus welchen Komponenten besteht die ausgeklügelte molekulare Maschinerie, die diese Prozesse antreibt? Zum Beispiel erfordert die Phagozytose große Membrandeformationen, um eindringende Krankheitserreger zu umgeben. Wissenschaftler untersuchen, wie Zytoskelettproteine wie Aktin zu einem dramatischen Umbau der Membran beitragen.

Da eine abweichende Endozytose und Exozytose zu schweren Krankheiten führen kann, sind Wissenschaftler daran interessiert zu verstehen, was diese Dysregulation verursacht. Eines der Proteine, die untersucht werden, ist ?-Synuclein, dessen Sekretion von Neuronen mit dem fortschreitenden Absterben benachbarter Neuronen in Verbindung gebracht wird. Das Verständnis der Exozytose könnte wertvolle Erkenntnisse über die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson liefern.

Nachdem wir nun einige der wichtigsten Fragen betrachtet haben, die untersucht werden, wollen wir uns ansehen, welche Werkzeuge zur Verfügung stehen, um sie zu beantworten.

Forscher verwenden einen Zell-Biotinylierungs-Assay, um die Endozytose von Zelloberflächenproteinen zu verfolgen. Bei diesem Prozess wird ein Oberflächenprotein mit fluoreszenzmarkiertem Biotin markiert und die Zelle dann einer Endozytose unterzogen. Darauf kann eine Immun-Blot-Analyse folgen, die die Proteininternalisierung aufdeckt.

Um das Recycling neuronaler Vesikel zu quantifizieren, markieren viele Wissenschaftler Zellen mit membranspezifischen fluoreszierenden Molekülen, wie z.B. FM-Farbstoffen. Diese Farbstoffe binden stabil an das äußere Segel und werden erst durch Endozytose internalisiert. Nach sequentieller Stimulation werden sie exozytiert. Die Analyse der Freisetzung mit einem Fluoreszenzmikroskop ermöglicht einen tieferen Einblick in den gesamten Recyclingprozess.

Um die Beiträge von Komponenten, die eine Exozytose ermöglichen, zu manipulieren und zu verstehen, richten Wissenschaftler häufig Fusionsassays ein. Zwei Sätze von Vesikeln mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffgehalten werden hergestellt und zusammenkommen gelassen. Die Fusion zwischen ihnen führt zur Bildung eines neuen Produkts, das mit einem Mikroplatten-Reader überwacht werden kann.

Ausgefeilte bildgebende Verfahren, einschließlich Fluoreszenzbildgebung und Fluoreszenzbildgebung lebender Zellen, bieten Forschern die einzigartige Möglichkeit, morphologische Strukturen und molekulare Ereignisse der Endozytose und Exozytose abzubilden.

Schauen wir uns zum Schluss einige spezifische Möglichkeiten an, wie Wissenschaftler diese Werkzeuge heute in Labors einsetzen.

Zellbiologen interessieren sich dafür, wie Exozytose hilft, verletzte Membranen zu heilen. Hier schädigten Forscher zunächst Zellen in Lösung von FM-Farbstoffen, indem sie Glasperlen über sie rollten. Die anschließende Fluoreszenzbildgebung zeigt, dass eine schnelle Exozytoserate die Membran schnell verschließt und verhindert, dass FM in die Zelle eindringt. Wenn die Exozytose langsam verläuft, führt sie zu einer ausgedehnten intrazellulären FM-Färbung.

Forscher können Fusionsassays verwenden, um den Beitrag spezifischer Fusionsproteine zu modellieren. Hier exprimierten die Forscher verschiedene Vesikel-assoziierte Membranproteine oder ? Vamps? Dabei handelt es sich um SNARE-Proteine auf der Oberfläche von zwei Zellpools. Anschließend ließ man die Fusion stattfinden und das Ergebnis wurde mit einem Spektrometer quantifiziert. Mit diesem Aufbau konnten die Wissenschaftler die Fusionseffizienzen mehrerer VAMPs vergleichen.

Schließlich zielen die Forscher darauf ab, die Endozytose des Zelloberflächenrezeptors als Reaktion auf ein Medikament zu verstehen. Hier behandelten die Wissenschaftler fluoreszenzmarkierte Zellen mit einem Medikament und visualisierten die rezeptormedikamentöse Endozytose in Echtzeit mithilfe von Zeitraffermikroskopie.

Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die Endozytose und Exozytose gesehen. In diesem Video haben wir die historischen Höhepunkte von der Entdeckung der Phagozytose bis hin zur Definition der Mechanismen der Neurotransmitterfreisetzung Revue passieren lassen. Als Nächstes stellen wir einige wichtige Fragen vor, die gestellt werden. Wir untersuchten auch prominente Forschungsstrategien und diskutierten einige ihrer aktuellen Anwendungen. Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!