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Eine Einführung in die Endozytose und Exozytose

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Cell Biology

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An Introduction to Endocytosis and Exocytosis

4.6: Invasion Assay Using 3D Matrices

4.8: Cell-surface Biotinylation Assay

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09:27 min

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April 30, 2023

Overview

Zellen nehmen Stoffe aus der extrazellulären Umgebung durch Endozytose und Freigabe aktiv Moleküle hinein durch Exozytose. Solche Prozesse beinhalten Lipid Membrane-springen Sacs Vesikel genannt. Kenntnis der molekularen Architektur und Mechanismen der beiden ist Schlüssel zum Verständnis der normalen Zelle Physiologie sowie die Krankheitszustände, die entstehen, wenn sie beschädigt werden.

Dieses Video wird zuerst kurz ein paar entscheidende Entdeckungen in der Geschichte der Endo und Exozytose Forschung überprüfen. Als nächstes einige wichtige Fragen geprüft werden, gefolgt von einer Diskussion der prominenten Methoden verwendet, um diese Probleme, einschließlich der Zelle Kennzeichnung, Fusion-Assays und Fluoreszenz-Bildgebung untersuchen. Schließlich wird es aktuelle Forschung durchgeführt von Wissenschaftlern auf dem Gebiet heute beschäftigen.

Procedure

Endocytic und Exocytic Wege sind entscheidend für die zelluläre Homöostase, Gewebefunktion und Gesamtüberleben Zelle. Einfach ausgedrückt, ist Endozytose der Prozess, den eine Zelle benutzt, um in den Molekülen aus dem extrazellulären Raum durch das Falten der Membran um ihn herum und bilden eine Vesikel. Exozytose ist der umgekehrte Vorgang, der Vesikel verwendet, um Substanzen in den extrazellulären Raum freigeben. Diese Prozesse sind vorgeschlagen worden, um eine kritische Rolle bei der Hormonsekretion, Membran-Rezeptor Internalisierung und Erreger Engulfment neuronale Kommunikation.

Heute, wir verfolgen einige der Wahrzeichen Entdeckungen auf dem Gebiet der Endozytose und Exozytose, markieren Sie einige unbeantworteten Fragen, Feature bekannte Methoden, die heute verwendet werden und zu guter Letzt entdecken Sie ein paar Experimente durchgeführt, um diese Prozesse besser zu verstehen.

Lassen Sie uns noch einmal einige der bedeutsamen Entdeckungen, die das gegenwärtige Verständnis der Endozytose und Exozytose geführt.

Die ersten Dokumentationen über Endozytose kann zurück bis 1882, zugeordnet werden, wenn Ilja Metschnikow, mit einem Lichtmikroskop beobachtet, dass bestimmte Zellen eindringende Krankheitserreger verschlungen. Er nannte diesen Prozess “Phagozytose,” wo verschlingen Zellen Erreger über Vesikel Bildung. Fast ein halbes Jahrhundert später, im Jahre 1931 beobachtet Warren Lewis einen ähnlichen Prozess der Vesikel Formation als Flüssigkeit Zellen antrat. Er nannte dieses Verhalten “Pinozytose.”

Später im Jahr 1953 George Palade, bei der Untersuchung der strukturellen und funktionellen Organisation der Zelle, entdeckt “höhlenartigen” Invaginations der Membranen und nannte sie dabei. Er gefolgert, dass diese für die Zelle-Aufnahme erforderlich sein müssen. Bald nach 1955 prägte Nobel Laureatus Christian de Duve den Begriff Endozytose, die “Phagozytose” und “Pinozytose.” umfasste Aber die Geschichte der Endozytose war noch nicht vorbei.

Im Jahr 1975, Michael Brown und Joseph Goldstein, mit Elektronenmikroskopie-Experte Richard Anderson, beobachtet, dass bei geringer Dichte Lipoprotein oder LDL, an seiner Zelle Oberfläche Rezeptor bindet führt es zur Bildung von “beschichtete Gruben.” Diese Gruben sind dann verinnerlicht, und Endocytose LDL-Rezeptoren. Dies war die Entdeckung der dritten Art, genannt “Rezeptor-vermittelte Endozytose.” Im selben Jahr Barbara Pearse isoliert die großen Hüllprotein ein gestrichenes Molekül und Clathrin genannt. Daher ist dieser Vorgang auch genannt “Clathrin-vermittelte Endozytose.”

Das war alles Endozytose in Bezug auf. Jetzt lassen Sie uns besprechen, wie wir über Exozytose gelernt. Randy Schekman Gruppe erwirtschaftete in 1980 Hefe-Mutanten, die Sekretion mangelhaft waren, und zeigte die Anwesenheit von kritischen Genen, die für Proteine notwendig für die Exozytose codiert.

Im Jahr 1993, James Rothman einige dieser Proteine identifiziert und anhand ihrer chemischen Natur nannte sie Schlingen. In seinem bahnbrechenden, “SNARE-Hypothese”, schlug er vor, dass diese spiralförmigen Strukturen Haken auf einander, verursacht Membranen mit ausreichender Kraft, um Sicherung und generieren Exozytose näher zu kommen.

Etwa zur gleichen Zeit festgestellt Thomas Südhof, dass dieser Prozess auch streng in Neuronen durch Calcium-sensing Proteine kontrolliert wurde, sogenannte Synaptotagmins, die gefördert und zeitlich exakt Vesicle Fusion für Neurotransmitter-Freisetzung. Zusammen erhielten diese Wissenschaftler den Nobelpreis im Jahr 2013.

Trotz der Breite dieser Entdeckungen bleiben viele faszinierende Rätsel. Werfen Sie einen Blick auf einige der Fragen, die heute untersucht werden.

Wissenschaftler beginnen zu Fragen, wie die Funktionen der Endozytose und Exozytose hinausgehen, zu erwerben und Sekretion von Substanzen. Zum Beispiel verschmelzen an der Zellmembran ohne eine katastrophale Expansion der Zellengröße wie Neurotransmitter kontinuierlich von Vesikeln veröffentlicht? Sie versuchen, die Signale zu identifizieren, die dazu führen, Zellen Membran dass, um kompensiert die Expansion und Recycling Ressourcen zu verinnerlichen.

Ein weiteres interessantes Thema ist: was die molekularen Maschinen, die diese Prozesse antreibt, Komponenten ausmachen? Beispielsweise erfordert die Phagozytose große Membran Deformationen eindringende Krankheitserreger zu umgeben. Wissenschaftler untersuchen, wie Zellskelett Proteine wie Aktin zu dramatischen Membran Umbau beitragen.

Zu guter Letzt da aberranten Endozytose und Exozytose schwere Krankheiten verursachen können, interessieren sich Wissenschaftler verstehen, was diese Dysregulation verursacht. Eines der Proteine werden unter die Lupe genommen ist α-Synuclein, deren Sekretion von Neuronen in den progressiven Tod des nahe gelegenen Neuronen in Verbindung gebracht hat. Verständnis der Exozytose könnten wertvolle Erkenntnisse über die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson.

Jetzt, wo wir einige der wichtigsten Fragen untersucht in Betracht gezogen haben, mal sehen, welche Werkzeuge zur Verfügung, um sie zu beantworten sind.

Forscher verwenden eine Zelle-Biotinylierungen-Assay, Endozytose Zelle Oberflächenproteine verfolgen. Dieser Prozess beinhaltet eine Oberfläche Protein mit Gewebekulturen tagged Biotin labeling und dann damit die Zelle Endozytose unterziehen. Dies kann durch immun Blot Analyse, enthüllt Protein Internalisierung verfolgt werden.

Um neuronale Vesicle recycling zu quantifizieren, kennzeichnen viele Wissenschaftler Zellen mit Membran-spezifische fluoreszierende Moleküle, wie FM Farbstoffe. Diese Farbstoffe binden stabil an der äußeren Broschüre und sind nur durch Endozytose internalisiert. Nach sequentieller Stimulation sind sie exocytosed. Version mit einem Fluoreszenzmikroskop analysieren ermöglicht tiefere Einblicke in die gesamte recycling-Prozess.

Oft, zu manipulieren und zu verstehen die Beiträge der Komponenten, die Exozytose ermöglichen, Wissenschaftler eingerichtet Fusion-Assays. Zwei Sätze von Vesikeln mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff Inhalt sind vorbereitet und erlaubt, zusammen zu kommen. Fusion zwischen ihnen entsteht ein neues Produkt, das mit einer Mikrotestplatte Reader überwacht werden kann.

Zu guter Letzt anspruchsvolle bildgebende Verfahren, einschließlich Fluoreszenz Imaging und Fluoreszenz live Cell Imaging, stellen Forscher die einzigartige Möglichkeit, Bildstrukturen morphologischen und molekularen Ereignisse der Endozytose und Exozytose.

Zu guter Letzt schauen wir uns einige spezifische Möglichkeiten, in denen Wissenschaftler diese Werkzeuge in den Labors heute umsetzen.

Zellbiologen interessieren wie Exozytose hilft heilen verletzte Membranen zu studieren. Hier verletzt Forscher zuerst Zellen in Lösung FM Farbstoffe durch sie Glasperlen überrollen. Nachfolgende Fluoreszenz-Bildgebung zeigt, dass wenn die Rate der Exozytose schnell ist, wird es schnell der Membran versiegeln und stoppen, FM in die Zelle eindringen. Wenn Exozytose langsam ist, führt dies zu umfangreichen intrazellulären FM Färbung.

Fusion-Assays können Forscher um den Beitrag der spezifischen Fusionsproteine zu modellieren. Hier ausgedrückt Forscher verschiedener Vesikel-assoziierte Membranproteine oder “VAMPs,” die SNARE-Proteine sind, auf der Oberfläche der beiden Pools von Zellen. Die Fusion durfte dann stattfinden, und das Ergebnis wurde mit einem Spektrometer quantifiziert. Mit diesem Setup, konnten die Wissenschaftler die Fusion Wirkungsgrade von mehreren VAMPs zu vergleichen.

Zu guter Letzt wollen Forscher Zelle Oberfläche Rezeptor Endozytose in Reaktion auf ein Medikament zu verstehen. Hier Wissenschaftler Eindringmittel tagged Zellen mit einem Medikament behandelt, und visualisierte Rezeptor Arzneimittel Endocytose geschieht in Echtzeit mit Zeitraffer-Mikroskopie.

Sie habe nur Jupiters Einführung in die Endozytose und Exozytose beobachtet. In diesem Video haben wir die historische Highlights, ausgehend von der Entdeckung der Phagozytose zu definieren die Mechanismen der Freisetzung von Neurotransmittern überprüft. Als nächstes haben wir ein paar wichtige Fragen. Wir auch prominente Forschungsstrategien erforscht und diskutiert einige ihrer aktuellen Anwendungen. Wie immer vielen Dank für das ansehen!

Transcript

Endocytic and exocytic pathways are critical for cellular homeostasis, tissue function, and overall cell survival. Simply put, endocytosis is the process that a cell uses to take in molecules from the extracellular space by folding its membrane around it and forming a vesicle. Exocytosis is the reverse process, which uses vesicles to release substances to the extracellular space. These processes have been suggested to play a critical role in hormone secretion, membrane receptor internalization, pathogen engulfment, and neuronal communications.

Today, we’ll retrace some of the landmark discoveries in the field of endocytosis and exocytosis, highlight some of the unanswered questions, feature notable methods that are used today, and lastly, explore a few specific experiments performed to better understand these processes.

Let’s revisit some of the momentous discoveries that led to the current understanding of endocytosis and exocytosis.

The first documentation related to endocytosis can be mapped back to 1882, when Ilya Metchnikov, using a light microscope, observed that specific cells engulfed invading pathogens. He called this process “phagocytosis,” where cells engulf pathogen via vesicle formation. Almost half a century later, in 1931, Warren Lewis observed a similar process of vesicle formation when cells took in fluid. He named this behavior “pinocytosis.”

Later in 1953, George Palade, while examining the structural and functional organization of the cell, discovered “cave-like” invaginations of the membranes, and called them caveolae. He inferred that these must be required for cell-intake. Soon after, in 1955, Nobel laureate Christian de Duve coined the term endocytosis, which encompassed “phagocytosis” and “pinocytosis.” However, the story of endocytosis wasn’t over yet.

In 1975, Michael Brown and Joseph Goldstein, with electron microscopy expert Richard Anderson, observed that when low density lipoprotein, or LDL, binds to its cell surface receptor, it leads to formation of “coated pits.” These pits are then internalized, and endocytose LDL receptors. This was the discovery of the third type, called “receptor-mediated endocytosis.” In the same year, Barbara Pearse isolated the major coat protein, a triskelion molecule, and named it as clathrin. Therefore, this process is also called “clathrin-mediated endocytosis.”

That was all regarding endocytosis. Now let’s discuss how we learned about exocytosis. In 1980, Randy Schekman’s group generated yeast mutants that were secretion deficient, and revealed the presence of critical genes that coded for proteins necessary for exocytosis.

In 1993, James Rothman identified some of these proteins, and based on their chemical nature they were called SNAREs. In his seminal, “SNARE hypothesis,” he proposed that these helical structures hook on to each other, causing membranes to come closer with sufficient force to fuse and generate exocytosis.

Around the same time, Thomas Südhof established that this process was also tightly controlled in neurons by calcium-sensing proteins called synaptotagmins that fostered and accurately timed vesicle fusion for neurotransmitter release. Together, these scientists were awarded the Nobel Prize in 2013.

Despite the breadth of these discoveries, many intriguing puzzles remain. Let’s take a look at some of the questions being explored today.

Scientists are starting to ask how the functions of endocytosis and exocytosis go beyond acquiring and secreting substances. For example, how are neurotransmitters continuously released by vesicles fusing to the cell membrane without a catastrophic expansion of cell size? They are trying to identify signals that cause cells to internalize membrane, in order to offset the expansion and recycle resources.

Another interesting topic is: what components make up the sophisticated molecular machinery that drives these processes? For example, phagocytosis necessitates large membrane deformations to surround invading pathogens. Scientists are investigating how cytoskeletal proteins like actin contribute to dramatic membrane remodeling.

Lastly, since aberrant endocytosis and exocytosis can result in serious diseases, scientists are interested in understanding what causes this dysregulation. One of the proteins being scrutinized is α-synuclein, whose secretion from neurons has been implicated in the progressive death of nearby neurons. Understanding its exocytosis could provide valuable insights on the treatment of neurodegenerative diseases like Parkinson’s.

Now that we’ve considered some of the key questions being investigated, let’s see what tools are available to answer them.

Researchers use a cell biotinylation assay to track endocytosis of cell surface proteins. This process involves labeling a surface protein with fluorescently tagged biotin, and then allowing the cell to undergo endocytosis. This can be followed by immune blot analysis, revealing protein internalization.

In order to quantify neuronal vesicle recycling, many scientists label cells with membrane-specific fluorescent molecules, like FM dyes. These dyes bind stably to the outer leaflet, and are only internalized by endocytosis. Following sequential stimulation, they are exocytosed. Analyzing release with a fluorescence microscope allows deeper insight into the whole recycling process.

Often, to manipulate and understand the contributions of components that allow exocytosis, scientists set up fusion assays. Two sets of vesicles with distinct fluorescent dye contents are prepared and allowed to come together. Fusion between them results in formation of a new product, which can be monitored using a microplate reader.

Lastly, sophisticated imaging methods, including fluorescence imaging and fluorescence live cell imaging, present researchers with the unique opportunity to image morphological structures and molecular events of endocytosis and exocytosis.

Finally, let’s look at some specific ways in which scientists are implementing these tools in labs today.

Cell biologists are interested in studying how exocytosis helps heal injured membranes. Here, researchers first injured cells in solution of FM dyes by rolling glass beads over them. Subsequent fluorescence imaging shows that if the rate of exocytosis is fast, it will quickly seal up the membrane and stop FM leaking into the cell. When exocytosis is slow, it results in extensive intracellular FM staining.

Researchers can use fusion assays to model the contribution of specific fusion proteins. Here, researchers expressed different vesicle-associated membrane proteins or “VAMPs,” which are SNARE proteins, on the surface of two pools of cells. The fusion was then allowed to take place, and the result was quantified using a spectrometer. Using this setup, scientists were able to compare the fusion efficiencies of multiple VAMPs.

Lastly, researchers are aiming to understand cell surface receptor endocytosis in response to a drug. Here, scientists treated fluorescently tagged cells with a drug, and visualized receptor medicated endocytosis happening in real time using time-lapse microscopy.

You’ve just watched JoVE’s introduction to endocytosis and exocytosis. In this video, we reviewed the historical highlights starting from the discovery of phagocytosis to defining the mechanisms of neurotransmitter release. Next, we introduced a few key questions being asked. We also explored prominent research strategies, and discussed some of their current applications. As always, thanks for watching!

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