Tandem-Massenspektrometrie

Die Tandem-Massenspektrometrie verbindet mehrere Stufen der Massenspektrometrie, um zunächst ein Biomolekül zu isolieren und dann Aspekte seiner chemischen Zusammensetzung zu bestimmen. Biomoleküle haben große, komplexe Strukturen, die es schwierig machen, ihre molekulare Zusammensetzung zu bestimmen. Die Tandem-Massenspektrometrie wählt ein Molekül von Interesse aus, das später in mehrere Untereinheiten fragmentiert wird, was zur Aufklärung seiner Identifizierung und Sequenzierung beitragen kann. Dieses Video zeigt die Konzepte der Tandem-Massenspektrometrie, ein allgemeines Verfahren und einige seiner Anwendungen in der Biochemie.

Die Tandem-Massenspektrometrie beginnt wie ein typisches Massenspektrometer-Instrument: mit einer Ionenquelle, die die Probe in Ionen umwandelt, und einem Massenanalysator, der die Ionen anhand ihres Masse-Ladungs-Verhältnisses trennt. Ein gängiger Massenanalysator, der Quadrupol, lässt nur Ionen mit einem bestimmten Verhältnis durch, während die anderen in die Stäbe der Apparatur krachen. Die Spezies, die durchgelassen wird, das sogenannte Vorläuferion, ist das Biomolekül von Interesse. Das Ion bewegt sich in eine Kollisionszelle, typischerweise einen weiteren Quadrupol, wo Energie angewendet wird, um das Ion in einem vorhersagbaren Muster zu fragmentieren.

Diese Fragmente wandern in einen anderen Massenanalysator, z. B. einen Time-of-Flight, der diese “Produktionen” trennt. Die produzierten Ionen werden dann zum Detektor geschickt, wie in einem normalen MS-Instrument. Im Falle eines unbekannten Proteins enthält das resultierende Spektrum zahlreiche überlappende Fragmente, so dass eine endgültige vollständige Sequenz des Biomoleküls nur schwer zu generieren ist. Das spektrale Muster ist jedoch für ein bestimmtes Protein einzigartig. Eine Analysesoftware vergleicht das Spektrum mit einer Datenbank bekannter Peptidsequenzen und klärt das unbekannte Protein aus den überlappenden Fragmenten auf.

Je nach Probe und gewünschtem Fragmentierungsgrad sind mehrere Fragmentierungsmethoden möglich. Fragmentierungsmuster hängen davon ab, wie die Energie übertragen wird, wie viel sie hat und wie sie durch das Vorläuferion verteilt wird. Energie kann über neutrale Teilchen, Strahlung oder Elektronen übertragen werden. Bei der Verwendung neutraler Atome wird ein Prozess, der als kollisionsinduzierte Dissoziation oder CID bezeichnet wird, hauptsächlich an der Peptidbindung zwischen den Aminosäuren gespalten, ideal für deren Identifizierung.

Nachdem nun die Grundlagen der Technik behandelt wurden, schauen wir uns die CID-Tandem-Massenspektrometrie an, die zur Untersuchung einer Komponente von bakteriellen Zellhüllen eingesetzt wird.

Wie bei allen massenspektrometrischen Experimenten besteht der erste Schritt darin, die Probe zu ionisieren. Bei Biomolekülen geschieht dies typischerweise mit matrixgestützter Laserdesorption oder Elektrospray-Ionisation. Das Vorläufer-Ionensignal wird dann durch Abstimmung der Ionenoptik optimiert. Sobald dies erledigt ist, wird das Ziel isoliert und die Fragmentierungsmethode ausgewählt, z. B. CID.

Die Stärke einer angelegten Spannung, die das Vorläuferion in die Kollisionszelle beschleunigt, beeinflusst den Grad der Fragmentierung. Diese Spannung wird erhöht, bis der Vorläufer im Vergleich zum Ion mit dem höchsten Produkt eine Abundanz von etwa 10 % aufweist. Es werden mehrere Spektren erfasst und gemittelt, bis ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis erreicht ist. Die Anzahl der benötigten Scans hängt von der Signalintensität des ursprünglichen Vorläuferions ab und kann zwischen 3 und 300 liegen.

Der Analyt in diesem Beispiel, Lipid A aus Escherichia coli K-12, hatte nach CID 19 Hauptfragmente. Die allgemeine Struktur von Lipid A ist gut bekannt, so dass Software die spezifische Zusammensetzung aus der Probe rekonstruieren kann.

Nachdem wir uns nun das Verfahren angesehen haben, schauen wir uns einige der Möglichkeiten an, wie die Tandem-Massenspektrometrie in der Biochemie eingesetzt wird.

Ein gängiger Scanmodus in der Tandem-Massenspektrometrie ist die gewählte Reaktionsüberwachung (Reaction Monitoring, SRM). Bei der SRM sind beide Massenanalysatoren auf ein ausgewähltes Masse-Ladungs-Verhältnis fixiert, wobei der Schwerpunkt auf spezifischen Vorläufer- und Produktionen liegt. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit von SRM können die Spektren von Peptidstandards bekannter Konzentration verwendet und mit denen der unbekannten Proben verglichen werden, wodurch Proteine von Interesse quantifiziert werden können.

Proteine werden in der Regel nach der Translation modifiziert, typischerweise durch Zugabe von funktionellen Gruppen wie Methylgruppen, Phosphatgruppen oder Zuckern, die als Glykane bekannt sind. Diese sind wichtig für zelluläre Signalprozesse, um aufzuklären, wie Zellen miteinander kommunizieren. Da die Tandem-Massenspektrometrie die Proteine in kleinere Bestandteile zerlegt, ist es möglich, die Position des PTM zu einem bestimmten Fragment oder sogar einer Aminosäure zu bestimmen. Einige Modifikationen, wie z. B. Acetylierung und Trimethylierung, sind allein anhand der Masse schwer zu unterscheiden, so dass die chromatographische Trennung vor der Massenspektrometrie durchgeführt wird.

Viele Analyten im Blut von Patienten werden in Konzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze für die typische Massenspektrometrie gefunden. Ein weiterer Vorteil von SRM besteht darin, dass alle bis auf ein Produktion verworfen werden, was die Empfindlichkeit erhöht und die untere Nachweisgrenze um das bis zu 100-fache erhöht. In diesem Beispiel konnte das Immunsuppressivum Tacrolimus in Konzentrationen von 1 ng/ml nachgewiesen werden.

Sie haben sich gerade das Video von JoVE über die Tandem-Massenspektrometrie angesehen. Dieses Video beschreibt die Theorie des Instruments, geht auf ein allgemeines Verfahren ein und erklärt einige der Möglichkeiten, wie die Technik derzeit eingesetzt wird. Danke fürs Zuschauen!