Verbesserte Genom Bearbeitung mit Cas9 Ribonucleoprotein in verschiedenen Zellen und Organismen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, gezielte genomische Veränderungen in einer Vielzahl von Zellen und Organismen unter Verwendung von CRISPR/Cas9-Ribonukleoproteinkomplexen vorzunehmen. Diese Methode kann helfen, grundlegende biologische Fragen zu beantworten, indem sie den Forschern die Möglichkeit gibt, maßgeschneiderte Insertionen, Deletionen und Substitutionen in ansonsten unveränderten Genomen von Modell- und Nicht-Modellorganismen zu generieren. Der Hauptvorteil der Verwendung von Ribonukleoprotein- oder RNP-Komplexen anstelle von Plasmid-DNA besteht darin, dass die Effizienz höher ist und Off-Target-Ereignisse reduziert werden.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf Ex-vivo-Therapien zur Bekämpfung von Krebs, HIV oder genetischen Krankheiten. Denn Genome Editing kann eingesetzt werden, um schädliche Mutationen zu korrigieren oder sogar die Fähigkeit der Zellen zu verbessern, schädliche Krankheiten abzuwehren. Diese Methode kann also Einblicke in primäre menschliche Zellen, C. elegans und Parhyale hawaiensis, liefern.

Es kann angewendet werden, um genetische Veränderungen in Hunderten von anderen Systemen vorzunehmen, einschließlich zuvor hartnäckiger Organismen. Beginnen Sie dieses Verfahren mit dem Design und der Vorbereitung der Guide-RNA, wie im Textprotokoll beschrieben. Assemblieren Sie einen RNP-Komplex, indem Sie eine ein- bis zweifache molare Menge an Guide-RNA mit 200 Pikosolen des Cas9-Proteins in einem Gesamtvolumen von 10 Mikrolitern mischen.

Fügen Sie sehr langsam etwa 30 Sekunden lang konzentriertes Cas9 zur Leit-RNA hinzu und machen Sie mit der Pipette schnelle Kreise. Dadurch wird die Cas9-Endkonzentration auf 20 Mikromolare erhöht. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter RNP in jede Küvettenvertiefung.

Nach der Vorbereitung der HSPCs, wie im Textprotokoll beschrieben, werden die Zellen mit einem Hämozytometer gezählt und 150.000 bis 200.000 Zellen pro Küvette zur Elektroporation in ein Zentrifugenröhrchen übertragen. Drehen Sie das Rohr 10 Minuten lang mit der 100-fachen Schwerkraft, um die Zellen zu pelletieren. Saugen Sie den Überstand mit einer Pipette oder einem Vakuum ab und entfernen Sie alle Blasen.

Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig mit 20 Mikrolitern Elektroporationspuffer pro Küvettenvertiefung. Geben Sie dann 20 Mikroliter der Zellen, die 150.000 bis 200.000 HSPCs enthalten, in jede Küvettenvertiefung, die bereits 10 Mikroliter des RNP enthält, und mischen Sie sie gut, indem Sie auf und ab pipettieren, ohne Blasen zu bilden. Zum Schluss elektroporaten Sie die Küvetten, nachdem Sie sie in einen Nukleofektor gelegt haben.

Verwenden Sie für die HSPCs den Impulscode ER-100. Beginnen Sie mit der Zubereitung von C.elegans in Agarose-Pads, wie im Textprotokoll beschrieben. Legen Sie ein Agarose-Injektionspad und einen Deckschirm auf ein Präparierfernrohr.

Lege mit einem Wurmstocher eine kleine Spur Halocarbon-Öl entlang einer Kante des Pads. Verwenden Sie dann den mit Öl beschichteten Wurmpickel, um mehrere Würmer von der NG-Agarplatte in die Ölspur zu heben. Positionieren Sie die Würmer mit einem feinen Haar, das an einer Pipette befestigt ist, wie z. B. einer Wimper oder einem Katzenbart, parallel und schieben Sie die Würmer vorsichtig in das Agarose-Pad.

Bis Sie sich mit dem Mikroinjektionsverfahren vertraut gemacht haben, montieren und injizieren Sie nur einen Wurm nach dem anderen. Sobald sie in Position gebracht und am Pad befestigt sind, überlagern Sie die Würmer mit einigen weiteren Tropfen Halogenkohlenwasserstofföl von der Spitze des Wurmpickels. Legen Sie das Deckglas mit den montierten Würmern auf das Injektionsmikroskop.

Positionieren Sie die Würmer bei geringer Vergrößerung senkrecht zur Injektionsnadel, die mit der RNP-Lösung gefüllt wurde, wie im Textprotokoll beschrieben. Wechseln Sie zu einer hohen Vergrößerung und positionieren Sie die Nadel neben dem Gonadenarm neu, entsprechend der Region in der Nähe der Zellkerne im mittleren bis späten Pachyten. Bewegen Sie die Nadel mit dem Mikromanipulator gegen den Wurm und drücken Sie die Nagelhaut leicht ein.

Tippen Sie dann mit einer Hand auf die Seite des Mikroskoptisches, um die Nadel durch die Nagelhaut zu führen. Drücken Sie das Injektionspaddel oder den Knopf, füllen Sie langsam den Gonadenarm mit der Injektionsmischung und entfernen Sie die Nadel. Wiederholen Sie den Schritt mit dem anderen Gonadenarm.

Sobald die Würmer injiziert sind, entfernen Sie das Deckglas und das Agarose-Pad und legen Sie es unter ein Präpariermikroskop. Verdrängen Sie mit einer gezogenen Kapillarpipette das Öl von den Würmern, indem Sie einen M9-Puffer über sie pipettieren. Führen Sie diese Behandlung durch, um die Würmer aus dem Agar zu lösen.

Nach 10 Minuten, wenn die Würmer im Puffer herumschlagen, bringen Sie sie mit der gezogenen Kapillarpipette auf eine NG-Agarplatte mit OP50-Bakterien. Stellen Sie die Platte für zwei bis drei Stunden bei 20 Grad Celsius auf, bis sich die Würmer erholt haben und sich bewegen. Nach der Genesung werden die Würmer einzeln auf NG-Agarplatten mit OP50 übertragen.

Übertragen Sie dann die Platten in einen 25 Grad Celsius heißen Inkubator. Entnehmen Sie die einzelligen Parhyale-Embryonen null bis vier Stunden nach der Befruchtung, indem Sie die trächtigen Weibchen zuerst mit 0,02 % Nelkenöl und Meerwasser betäuben. Kratzen Sie die Embryonen vorsichtig mit einer flammengezogenen und abgerundeten Glaspipette und einer stumpfen Pinzette Nummer drei aus ihrem ventralen Brutbeutel heraus.

Injizieren Sie die Parhyale-Embryonen mit komprimiertem Stickstoff unter einem Präpariermikroskop mit einem Mikroinjektor und einem Mikromanipulator. Laden Sie 1,5 Mikroliter der Injektionsmischung mit einer Mikrolader-Pipettenspitze in die Rückseite eines gezogenen Kapillarröhrchens. Nachdem Sie die Nadel auf das Injektionsgerät gesetzt haben, brechen Sie die Spitze der Nadel mit einer Pinzette unter dem Präparierfernrohr

Kalibrieren Sie das abgegebene Volumen, indem Sie in Halogenkohlenwasserstofföl 700 injizieren und den Durchmesser der Blase messen. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge eine Mulde aus dem Härter heraus. Füllen Sie es zur Hälfte mit filtersterilisiertem Meerwasser und legen Sie die Parhyale-Embryonen zur Injektion in den Trog.

Injizieren Sie die Embryonen mit Hilfe der Mikroinjektion und stabilisieren Sie jeden Embryo während der Injektion mit einer Pinzette. Nach der Injektion können Sie die Embryonen mit einer Glastransferpipette in eine frische 60-Millimeter-Kulturschale übertragen, die zur Hälfte mit filtersterilisiertem Meerwasser gefüllt ist, bevor Sie die Embryonen in verschiedenen Stadien präparieren und fixieren. Stellen Sie Präpariernadeln her, indem Sie ein gebogenes Stück Wolframdraht mit einer Länge von etwa 0,5 Zoll in das Ende einer Insulinnadel einfädeln.

Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze als Griff der Präpariernadel und schärfen Sie die Nadel in Natronlauge unter Strom. Füllen Sie eine Vertiefung einer Glasschale mit drei Vertiefungen zur Hälfte mit einer frisch hergestellten Lösung aus neun Teilen PEM-Puffer, einem Teil 10X PBS und einem Teil 32 % PFA. Legen Sie drei bis fünf Embryonen in die Schale und stechen Sie ein kleines Loch in jeden Embryo, indem Sie eine scharfe Wolframnadel zum Einstechen und eine leicht abgestumpfte Nadel zum Stabilisieren verwenden, damit das Eigelb herausfließen und das Fixiermittel einlaufen kann.

Ziehe mit einem Paar geschärfter Wolframnadeln vorsichtig die äußeren beiden Membranen ab, die den Parhyale-Embryo umgeben. Präparieren Sie sie in Fixiermittel, um die Embryonen robuster zu machen, aber arbeiten Sie schnell, um zu verhindern, dass die Membran am Embryo fixiert, was die Entfernung der Membran erschwert. Lassen Sie die Embryonen insgesamt 15 bis 20 Minuten für die Antikörperfärbung oder 40 bis 50 Minuten für die In-situ-Hybridisierung fixieren.

Manchmal lassen sich die Ergebnisse eines Bearbeitungsexperiments am besten durch einen experimentellen Assay bewerten. Repräsentative Ergebnisse sowohl von Wildtyp-T-Zellen als auch von CD25-Knock-out-Zellen sind hier dargestellt. Die Durchflusszytometrie zeigt, dass Zellen, die nicht mit Cas9 RNP editiert wurden, CD25 exprimieren.

Zellen, in denen CD25 ausgeschaltet wurde, exprimieren das Protein jedoch nicht. Bei großflächigen Störungen können die Bearbeitungsergebnisse klare visuelle Phänotypen aufweisen. Zum Beispiel haben Wildtyp-Parhyale hawaiensis einen normalen Hinterleib mit Schwimm- und Ankerbeinen.

Durch die Störung des Abd-B-Gens werden die Bauchschwimm- und Ankerbeine durch Sprung- und Gehbeine ersetzt, die normalerweise nur mit dem Thorax assoziiert sind. Neben der Überprüfung auf Phänotypen sollten die Experimentatoren auch den Genotyp analysieren, um die Gesamteffizienz der Editierung zu beurteilen und spezifische genetische Veränderungen zu erkennen. Bei einzelnen Klonen kann dies durch eine einfache Sanger-Sequenzierung erreicht werden.

In gemischten Zellpopulationen wird eine weitergehende Sequenzierungsanalyse empfohlen. TIDE kann z. B. alle verschiedenen Indels zuordnen, die in einzelnen Zellen innerhalb eines RNP-bearbeiteten Pools aufgetreten sind. Wenn Sie dieses Verfahren zum ersten Mal versuchen, versuchen Sie, eine der positiven Kontrollen zu verwenden, die wir in Tabelle eins aufgelistet haben.

Die Verwendung einer bewährten Leit-RNA kann Ihnen helfen, ein Gefühl für die Bearbeitung mit RNP zu bekommen, bevor Sie Ihr eigenes Experiment entwerfen.