Ein einfacher, rasches und quantitativen Assay zur Maßnahme Reparatur von DNA-Protein-Querverbindungen auf Plasmide transfiziert in Säugerzellen

Das Ziel dieses Protokolls ist, die Reparatur von definierten DNA-Protein-Querverbindungen auf Plasmid DNA zu quantifizieren. Lesioned Plasmide sind in Säugetieren Empfängerzelle Linien und niedermolekularen Gewicht geerntet mehrere Zeit Punkte nach Transfektion transfiziert. DNA Reparatur Kinetik werden quantifiziert, gefolgt von qPCR Strang-spezifische Primer-Erweiterung verwenden.

Das übergeordnete Ziel dieses transpazifischen Primer-Erweiterungs-QPCR-Aufsatzes ist es, die Reparatur von Addukten, die mit Plasmid-DNA vernetzt sind, nach der Transfektion in Säugetierzellen quantitativ zu bewerten. Diese Methode könnte helfen, Schlüsselfragen im Bereich der DNA-Reparatur zu beantworten. Zum Beispiel, welche Signalwege an der Reparatur von DNA-Protein-Vernetzungen beteiligt sind.

Diese Technik hat das Potenzial, ein besseres Verständnis der DNA-Schadensreaktion zu ermöglichen. Weil es ermöglicht, die Reparatur von DNA-Protein-Vernetzungen und das Fehlen anderer Arten von DNA-Schäden selektiv zu untersuchen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Reparatur von DNA-Protein-Vernetzungen geben kann, kann sie auch auf andere Arten von DNA-Schäden angewendet werden.

Wie zum Beispiel abbasische Stellen und andere Polymerase-blockierende Addukte. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Reparatur von addukthaltigen Plasmiden zu Zeitpunkten von bereits zwei Stunden nachweisen kann. Ursprünglich hatten wir vor, die Reaktivierung von Hauszellen zu verwenden, um die Reparatur zu untersuchen, aber diese Assays messen die Reparatur nicht direkt oder überschätzen möglicherweise die Reparatureffizienz.

Insbesondere dann, wenn die RNA-Polymerase unvollständige Reparaturprodukte durchlesen kann. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Aufreinigung und die strangspezifischen Primerverlängerungsschritte sonst schwer zu visualisieren sind. Mischen Sie 20 Mikroliter einer Lösung, die 80 Pikomolen eines acht Oxoguanin enthaltenden Oligonukleotids enthält, mit fünf Mikrolitern 10x Ligase-Puffer.

Und fügen Sie einen Mikroliter einer Lösung hinzu, die 10 Einheiten T4-Polynukleotidkinase enthält. Stellen Sie das endgültige Volumen auf 50 Mikroliter ein und inkubieren Sie das Röhrchen 30 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Als nächstes wird die Primer-Verlängerungsreaktion auf Eis durchgeführt.

Stellen Sie das Programm auf dem Thermocycler ein und starten Sie den Lauf. Stellen Sie nach der Inkubation das Gesamtvolumen auf 375 Mikroliter ein, indem Sie verschiedene Reagenzien, Enzyme und Puffer hinzufügen. Dann inkubieren Sie die Reaktion in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius über Nacht.

Um ein Phenyl-Chloroform-Gemisch im Verhältnis 50:50 herzustellen, fügen Sie gleiche Mengen Phenol und Chloroform hinzu. Dann beide Komponenten mischen und in einer Tischzentrifuge bei 21.130 g fünf Minuten lang schleudern. Nachdem das Schleudern beendet ist, fügen Sie 375 Mikroliter der organischen Schicht zur Primer-Verlängerungsreaktion hinzu. Mischen.

Und wieder bei 21.130 g fünf Minuten lang zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren die oberste Schicht vorsichtig pipettieren. Und mischen Sie es mit Ammoniumacetat bis zu einer Endkonzentration von 0,3 molaren.

Und dann fügen Sie zwei Volumen 100% Ethanol hinzu. Lagern Sie die Mischung bei minus 20 Grad Celsius für mindestens 30 Minuten bis über Nacht. Sobald die Inkubationszeit abgelaufen ist, zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 15.000 U/min bei vier Grad Celsius.

Entsorgen Sie dann den Überstand und waschen Sie das Pellet in 70%igem Ethanol. Schleudern Sie die Probe erneut in einer Tischzentrifuge bei 15.000 U/min für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und lösen Sie das Pellet in 100 Mikrolitern Wasser auf.

Kombinieren Sie 50 Mikroliter der DNA mit 34 Mikrolitern Wasser und 16 Mikrolitern 6x Gel-Loading-Farbstoff. Führen Sie die Probe sechs Stunden lang auf einem 10 Zentimeter großen, 0,8 %igen niedrigschmelzenden Agarosegel mit 0,5 Mikrogramm pro Milliliter Ethidiumbromid bei zwei Volt pro Zentimeter in 1x TAE-Puffer durch. Verwenden Sie dann eine Rasierklinge, um die supercoiled DNA herauszuschneiden.

Und wiegen Sie die Gelscheibe. Fügen Sie als nächstes einen Mikroliter Beta-Agarase-Reaktionspuffer hinzu, um alle 10 Milligramm Gelscheibe zu verdauen. Dann wird die Scheibe 10 Minuten lang bei 65 Grad Celsius inkubiert, gefolgt von einem Abkühlen auf 42 Grad Celsius in einem Thermocycler.

Sobald sich die Gelscheibe aufgelöst und auf 42 Grad Celsius abgekühlt hat, fügen Sie 10 Einheiten Beta-Agarase hinzu und lassen Sie sie eine Stunde lang bei 42 Grad Celsius im Thermocycler. Nach einer Stunde messen Sie das Volumen der gelösten Gelscheibe und fügen Sie Ammoniumacetat bis zu einer Endkonzentration von 0,3 molar hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten lang auf Eis. Nach der Inkubation wird die Mischung bei 15.000 g 15 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert.

Sammeln Sie dann das Überstandsmittel und pipettieren Sie zwei Volumen Isopropanol dazu und mischen Sie. Anschließend lagerst du die Mischung bei minus 20 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die gereinigte supercoiled DNA in einer Tischzentrifuge bei 15.000 U/min für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie das Überstandsmittel und resuspendieren Sie das Pellet in 40 Mikrolitern Wasser. Kombinieren Sie dann 15 Mikroliter einer Lösung, die 12 Pikosolen DNA enthält, mit einem Mikroliter einer Lösung von 36 Picomolen Oxoguanin-Glykosylase in einem Puffer und stellen Sie das endgültige Volumen auf 30 Mikroliter ein. Anschließend die Mischung bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten in einem Wasserbad inkubieren.

Einen Tag vor der Transfektion säen Sie die Zellen in eine Sechs-Well-Kulturplatte. Mischen Sie am nächsten Tag 1,5 Mikrogramm des vernetzten Plasmids mit 300 Mikrolitern serumfreiem Kulturmedium in einem Röhrchen, wobei Sie darauf achten, dass ein Mikroliter DNA als Null-Stunden-Zeichenpunkt gespeichert wird. Mischen Sie in einem anderen Röhrchen 12 Mikroliter Transfektionsreagenz mit 300 Mikrolitern serumfreiem Medium.

Kombinieren Sie dann 300 Mikroliter der vernetzten DNA mit einem gleichen Volumen verdünntem Transfektionsreagenz. Und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in einer Laminar-Flow-Haube. Nach der Inkubation geben Sie je 250 Mikroliter des Komplexes in jede der beiden Vertiefungen und inkubieren bei 37 Grad Celsius.

Entfernen Sie nach mindestens einer Stunde das Medium und fügen Sie einen Milliliter 0,6%ige Natriumdodecylsulfatlösung mit 0,1 molaren EDTA hinzu und inkubieren Sie 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur. Dann lösen Sie die Zellen durch Schaben mit einem Gummipolizisten ab und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen. Fügen Sie als nächstes 200 Mikroliter 5 molare Natriumchloridlösung zu einer Endkonzentration von einem molaren hinzu und drehen Sie das Röhrchen fünfmal um.

Dann über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Probe bei 21.130 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation das Überbestände auffangen.

Und fügen Sie Ammoniumacetat bis zu einer Endkonzentration von 0,3 molar hinzu, mischen Sie und fügen Sie zwei Volumen 100%iges Ethanol hinzu, um die DNA auszufällen. Lagern Sie die Mischung mindestens 30 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius. Nach der Ethanolfällung und Resuspension der gewonnenen DNA-Proben in 50 Mikrolitern Wasser wird die Null-Stunden-Probe in 500 Mikrolitern Wasser verdünnt und die PCR-Reaktionen mit den nicht transfizierten und transfizierten Proben durchgeführt.

Stellen Sie dann das Programm am Thermocycler ein und starten Sie den Lauf. Dieser transspezifische Primer-Verlängerungsschritt ist von entscheidender Bedeutung, da er uns eine Amplifikation des beschädigten Strangs ermöglicht. Wenn sie nicht verwendet werden, wären die Delta-CT-Werte kleiner als eins, was es schwierig macht, niedrige DPC-Reparaturniveaus zu erkennen.

Fügen Sie nach Abschluss von acht Zyklen 100 Picomole der zweiten Grundierung hinzu. Mischen Sie dann einen Mikroliter der unamplifizierten DNA aus den nicht transfizierten und transfizierten Proben mit 2x Mastermix, Wasser und 100 Picomole beider Primer zu einem endgültigen Volumen von 60 Mikrolitern. Laden Sie die Proben in dreifacher Ausfertigung auf eine 96-Well-PCR-Platte.

Führen Sie eine quantitative PCR für 30 Zyklen durch und mitteln Sie den Zyklusschwellenwert für jede der dreifachen Proben. In dieser Studie wird die QPCR mit und ohne strangspezifische Primerverlängerung durchgeführt, um den Prozentsatz der reparierten Plasmid-DNA zu berechnen. Die Differenz in den Zyklusschwellenwerten zwischen den primer-verlängerten und den nicht primer-verlängerten Proben wird als Delta-CT.As hier zu sehen ist, hat eine reparierte Probe, die einer SSPE-QPCR unterzogen wurde, eine größere Delta-CT als eine nicht reparierte Probe.

Repräsentative Daten des Prozentsatzes der Reparatur, berechnet aus Delta-CT-Werten, zeigen, dass Proben, die nach drei Stunden Transfektion gewonnen wurden, zu 66 % repariert wurden, während Proben, die nach acht Stunden wiederhergestellt wurden, zu 93 % repariert sind. Hier sind prozentuale Hintergrundwerte dargestellt, die aus zwei Kontrollproben mit jeweils hoher und niedriger Proteinvernetzungseffizienz berechnet wurden. Der geringe prozentuale Hintergrundanteil in der Kontrolle zeigt, warum nur effizient vernetzte Substrate für Transfektionen verwendet werden.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei bis drei Stunden durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, Proben mit Zeit Null zu nehmen, um den Hintergrund von diesem Assay zu entfernen. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Sequenzanalyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B.: Ist die DPC-Reparatur fehleranfällig?

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man addukthaltige Plasmide in Säugetierzellen vorbereitet, transfiziert und die Reparatur quantifiziert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Phenol, Chloroform und Ethidiumbromid gefährlich sein kann. Und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und das Arbeiten in einem Abzug sollten immer getroffen werden.