Ein 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell

Das übergeordnete Ziel dieses 3D-organotypischen Melanom-Sphäroid-Hautmodells ist es, sowohl die Architektur als auch die multizelluläre Komplexität eines Organs oder Tumors in vivo zu rekapitulieren und gleichzeitig systematische experimentelle Eingriffe zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Melanomforschung zu beantworten, wie z.B. Tumor-Wirt-Interaktion und therapeutische Intervention. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die 3D-Architektur von nicht-vaskularisierten Metastasen in vivo nachahmen können.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie des Melanoms, da sie die Heterogenität des Tumors widerspiegelt. Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Qualität der Primärzellen entscheidend ist und während des Zellprozesses keine Antibiotika verwendet werden. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie des Melanoms, da sie die Heterogenität des Tumors widerspiegelt.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die richtige Handhabung des 3D-Melanom-Hautmodells sehr wichtig ist. Zu Beginn werden Melanomzellen 451LU mit RPMI-Medium kultiviert, das 10 % FCS enthält, gemäß den allgemeinen Zellkulturprotokollen. Um Melanom-Sphäroide zu erzeugen, waschen Sie die kultivierten Melanomzellen in PBS.

Fügen Sie dann fünf Milliliter einmal Trypsin EDTA in PBS hinzu. Drei bis fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie fünf Milliliter RPMI mit 10% FCS hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren.

Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 200 mal g, um die Zellen zu ernten. Suspendieren Sie das Zellenpellet wieder in RPMI mit 10 % FCS.

Zählen Sie als Nächstes die Zellen und verdünnen Sie die Zellsuspension auf eine Endkonzentration von 10.000 Zellen pro Milliliter. Verwenden Sie eine elektronische Multipipette, um 40 bis 25 Mikroliter große Flecken Zellsuspension auf der Innenfläche des Deckels einer sterilen, nicht klebenden 10-Zentimeter-Zellkulturschale herzustellen. Drehen Sie dann den Deckel mit einer schnellen, sanften Bewegung um und legen Sie ihn auf die Zellkulturschale mit fünf Millilitern PBS.

Kultivieren Sie die hängenden Tropfschalen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für 10 bis 14 Tage. Fünf Tage nach der ersten Tropfenfleckenbildung verwenden Sie einen elektronischen Spender, um 10 Mikroliter RPMI mit 10 % FCS zu jedem Tropfen hinzuzufügen. Nach 10 bis 15 Tagen ernten Sie die Sphäroide, indem Sie sie vorsichtig mit PBS vom Deckel abspülen.

Sammeln Sie die Sphäroide in einer frischen, nicht klebenden Zellkulturschale. Um das dermale Gegenstück der Hautrekonstruktionen zu erzeugen, platzieren Sie acht Mikrometer porengroße Membraneinsätze in einer 24-Well-Zellkulturplatte. Für jeden Einsatz resuspendieren Sie 100.000 Fibroblasten in einer Gel-Neutralisationslösung.

Mischen Sie anschließend die Fibroblastensuspension schnell mit Kollagen Typ eins im Verhältnis eins zu drei in einem Endvolumen von 500 Mikrolitern, ohne Blasen zu bilden. Verwenden Sie dann eine Pipette, um die Suspension zu jedem Einsatz hinzuzufügen. Legen Sie die Einsätze in einer sterilen Haube 30 Minuten lang bei Raumtemperatur ohne Medium, damit sich die Hautgele absetzen können.

Als nächstes bedecken Sie die Gele mit dem DMEM und inkubieren über Nacht bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation über Nacht das DMEM aus den Hautgelen und dequilibrieren Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit EGM, um das epidermale Gegenstück der Hautrekonstruktionen zu erzeugen. Verwenden Sie anschließend eine Pipette, um das EGM von den Gelen zu entfernen.

Dann säen Sie vorsichtig 100.000 Keratinozyten aus, die in 100 Mikrolitern EGM auf jedem Gel resuspendiert sind. Inkubieren Sie die Rekonstruktionen eineinhalb Stunden lang bei 37 Grad Celsius, damit die Keratinozyten am Hautgel haften können. Entfernen Sie mit einer Pipettenspitze vorsichtig das restliche Gel von der Einsatzwand.

Als nächstes bedecken Sie jede Rekonstruktion mit 800 Mikrolitern EGM und kultivieren sie sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid. Entfernen Sie vorsichtig mit einer kleinen, breiten Pipettenspitze Gelreste von der Innenwand. Legen Sie die Einsätze am achten Tag in separate Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte.

Als nächstes fügen Sie 1,2 bis 1,4 metastasierendes Melanommedium in jede Vertiefung hinzu, um nur die Basis der Hautrekonstruktion zu bedecken. Dann 10 bis 17 Tage bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid inkubieren. Geben Sie nur 1,2 bis 1,4 ml metastasierendes Melanommedium in jede Vertiefung, so dass die Hautrekonstruktion vom Boden der Vertiefung mit Medium versorgt wird, aber nicht mit Medium bedeckt ist.

Um Melanom-Sphäroide in das dermale Gegenstück der Vollhautrekonstruktionen zu integrieren, verwenden Sie PBS, um die Sphäroide vorsichtig vom Deckel einer hängenden Tropfzellkulturschale abzuspülen. Für jede vollständige Hautrekonstruktion werden 10 bis 20 Sphäroide in einer sterilen, nicht klebenden Zellkulturschale gesammelt. Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um überschüssiges PBS vorsichtig zu entfernen.

Als nächstes aspirieren Sie die Sphäroide in einem minimalen Volumen EGM. Übertragen Sie sie dann in das erforderliche Volumen der Gel-Neutralisationslösung, die 100.000 Fibroblasten enthält. Mischen Sie für jeden Einsatz die Sphäroidsuspension mit Kollagen Typ eins im Verhältnis eins zu drei in einem Endvolumen von 500 Mikrolitern.

Generieren Sie schließlich organotypische Vollhautrekonstruktionen, wie im zuvor beschriebenen Protokoll beschrieben. Die normale menschliche Haut wird mit der Hautrekonstruktion verglichen, um die organotypische 3D-Hautrekonstruktion zu validieren. Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung der Paraffinschnitte zeigt, dass die Dermis und Epidermis der Hautrekonstruktion mit denen der normalen Haut vergleichbar sind.

Normale menschliche Haut und Hautrekonstruktion werden immunhistochemisch analysiert, um die epidermale Differenzierung zu vergleichen. Die Immunfärbung gegen epidermale Stratifizierungsmarker, nämlich Keratin 14, Keratin 10 sowie Involukrin und Filagrin, deutet auf ein ähnliches Maß an Keratinabside-Differenzierung zwischen der Hautrekonstruktion und normaler Haut hin. Die Immunfärbung gegen Laminin fünf deutet darauf hin, dass die basale Lamina gebildet wird, um die epidermalen und dermalen Gegenstücke der Hautrekonstruktionen physiologisch zu verbinden, ähnlich wie bei normaler Haut.

Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung des Paraffinabschnitts der Melanom-Sphäroid-Hautrekonstruktion deutet darauf hin, dass die zelluläre Verteilung von Melanom-Sphäroiden ähnlich ist wie die der nicht vaskularisierten menschlichen Melanom-Hautmetastasen in vivo. Die histologische Untersuchung zeigt das Vorhandensein einer peripheren proliferierenden Subpopulation und einer zentralen nekrotischen Subpopulation der Melanomzellen. Einmal gemeistert, könnte diese Technik in etwa 40 Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, Primärzellen von bester Qualität zu verwenden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Melanomforscher, die Reaktionsfähigkeit in vitro in einer in vivo nachahmenden Umgebung zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein menschliches organotypisches 3D-Melanom-Hautmodell erstellt.