Name: Ein 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie ein 3D organotypisches Melanom-Sphäroid-Hautmodell erstellen, das die Architektur und Komplexität von Tumoren in vivo nachbildet. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Tumor-Wirt-Interaktionen und therapeutischen Interventionen.

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Die Autoren danken für die 3D organotypischen Melanom-Sphäroid-Haut-Modell zu etablieren und bietet ausgezeichnete Protokolle Hanna Voersmann. Die Autoren danken auch Silke Busch für wertvolle technische Unterstützung. Die Arbeit wurde unterstützt vom BMBF e: Med Programm "Melanom Sensitivity" 031A423A.

Alle menschlichen Gewebe Arbeiten erfolgte mittels zugelassenen institutionellen Protokolle.
(1) Trennung der Dermis und Epidermis aus der menschlichen Haut (Juvenile Vorhaut von Beschneidung)
<ol><li>Legen Sie die Vorhaut (in der Regel 1 – 2 cm2) in einer Kulturschale nichtklebenden sterile Zelle (Ø 10 cm) und decken Sie es mit 10-12 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung+ (0,5 mM MgCl2, PBS, pH 7,2, 0,9 mM CaCl2= PBS+). Entfernen Sie alle überschüssiges (adipös) Gewebe mit sterilen Skalpell und Pinzette.</li>
	<li>Schneiden Sie die Haut in 3 x 5 mm Stücke mit PBS waschen Sie und übertragen Sie sie auf ein nicht klebendes sterile Zelle Kulturschale (Ø 6 cm). Die Gewebe-Stücke mit ca. 5-7 mL Dispase-Lösung (2 U/mL PBS) zu decken. Versiegeln Sie der Zelle Kulturschale mit Paraffin Film und 16 h bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Einfahren der epidermalen aus dem dermalen Teil mit zwei sterile Pinzetten. Seziert Gewebe Stücke auf Einzelzelle nichtklebenden Kultur Gerichte (Ø 6 cm) übertragen und jeder von ihnen mit PBS+zu decken.</li>
</ol>2. Isolierung der primären Keratinozyten aus der Epidermis
<ol><li>Sorgfältig die PBS+ aus der Zelle Kulturschale mit einer Pasteurpipette entfernen und die epidermalen Gewebe Stücke (Abschnitt 1.3) mit PBS waschen. Schneiden Sie die Epidermis in kleinere Stücke (1 mm2) und sammeln sie in einem 50 mL konische Röhrchen. Fügen Sie 10 mL 1 x Trypsin-EDTA (vorgeheizt auf 37 ° C) und 5 min im Wasserbad bei 37 ° c inkubieren Wirbel der Gewebe-Aufhängung alle 2 min.</li>
	<li>Stoppen Sie die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 1 mL fetalen Kälberserum (FCS). Aufzuwirbeln Sie die Zellen von oben und unten mit einer 10-mL-Kunststoff-Pipette für 4 min. versuchen zur Vermeidung von Luftblasen und Schaum-Bildung pipettieren.</li>
	<li>Pipettieren der Zellsuspension in eine Zelle Sieb (Pore Größe 100 µm), auf eine frische 50 mL konische Rohr platziert, 3 X mit 5 mL PBS spülen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 X g, für 5 min. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2-6 mL Kulturmedium mit 1 % (V/V) Gentamycin. Bestimmen Sie die Zellenzahl manuell durch zählen Zellen in einem Hemocytometer und Samen 6 x 105 Zellen in einer T75 Zelle Kultur Kolben.</li>
</ol>3. Anbau von primären Keratinozyten
<ol><li>Inkubieren Sie primären Keratinozyten in Schritt 2.3 in einer Zelle Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 in Keratinozyten Medium ohne FCS, um 50-70 % Konfluenz isoliert.</li>
	<li>Um die Keratinozyten sorgfältig die passage des Mediums zu entfernen, geben Sie 5 mL PBS-EDTA und die Zellen für 10 min bei 37 ° c inkubieren Überprüfen Sie, ob Zellen begonnen haben, trennen Sie den Kultur-Kolben unter einem Lichtmikroskop (4 X Vergrößerung: Zellen abgerundeten erscheint aber noch befestigt!). Wenn dies nicht der Fall ist, ersetzen Sie alte PBS-EDTA mit frischen PBS-EDTA und erneut für weitere 10 Minuten bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Geben Sie 5 mL 1 X Trypsin-EDTA zu den abgerundeten Zellen noch bedeckt mit 10 mL PBS-EDTA und wieder lang 1-3 min bei 37 ° c inkubieren Die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 1 mL FCS zu stoppen und die freistehenden Zellen in einem 50 mL konische Röhrchen sammeln. Die Zellen bei 200 X g für 5 min zentrifugieren, das Pellet in Keratinozyten Medium und 6 x 105 Samenzellen in einer frischen T75 Zelle Kultur Flasche aufzuwirbeln. Hinweis: Um organotypischen Haut rekonstruiert zu erzeugen, sollte die primären Keratinozyten spätestens 3-4 Durchgang verwendet werden.</li>
</ol>4. Isolierung der primäre Fibroblasten aus der Dermis
<ol><li>Schneiden Sie das Hautgewebe (Abschnitt 1.3) in kleinere Stücke (1 mm2) und übertragen Sie sie in ein 50 mL konische Röhrchen. 10 mL Kollagenase-Lösung (5 U/mL PBS+) hinzufügen und 45 Minuten im Wasserbad bei 37 ° c inkubieren Zentrifugieren Sie die Mischung von Gewebe und Zellen bei 200 X g für 5 min.</li>
	<li>Waschen Sie die Zelle Pellet zweimal mit 10 mL DMEM mit 4,5 g/L Glucose und L-Glutamin, aber ohne L-Pyruvat. Schließlich erneut die Gewebe-Stücke in 2 mL DMEM mit 10 % FCS 1 % (V/V) Gentamycin. In einem T25 Zelle Kultur Kolben übertragen Sie und inkubieren sie über Nacht in einer Zelle Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 . Hinweis: Das geringe Volumen ermöglicht die Fibroblasten, aus dem Gewebe-Schutt zu migrieren und zwingt sie in den Kultur-Kolben befestigen.</li>
	<li>Am nächsten Morgen fügen Sie ein weiteres 6 mL DMEM/Gentamycin/FCS hinzu und 2-3 Tage bei 37 ° C inkubieren Sie, bis die Zellen 80-90 % Konfluenz erreicht haben.</li>
</ol>5. Anbau der primäre Fibroblasten
<ol><li>Durchgang der Fibroblasten, entfernen das Medium und adhärente Zellen mit PBS waschen. Geben Sie 5 mL 1 x Trypsin-EDTA und 3 min bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 5 mL DMEM/FCS zu stoppen und die freistehenden Zellen in einem 50 mL konische Röhrchen sammeln. Die Zellen bei 200 X g für 5 min zentrifugieren, Aufschwemmen das Pellet in DMEM Medium, und Saatgut 6 x 105 Zellen in einer frischen T75 Zelle Kultur Kolben. Hinweis: Um organotypischen Haut rekonstruiert zu erzeugen, sollte die primäre Fibroblasten spätestens 4-6 Gang verwendet werden.</li>
</ol>6. Generation der 3D Melanom Sphäroide über der hängenden-Drop-Methode
<ol><li>Kultur Melanomzellen (z.B., 451-LU oder irgendwelche Melanom-Zell-Linie von Interesse) nach allgemeine Protokolle, mit RPMI mit 10 % FCS15.<ol>
<li>Um Melanom Sphäroide von ähnlicher Größe und Qualität zu erzeugen, waschen Sie die Melanomzellen in PBS, fügen Sie 5 mL 1 X Trypsin-EDTA mit PBS-Puffer für die Zellen in einem T175 Zell-Kultur-Kolben und inkubieren Sie für ca. 3-5 min bei Raumtemperatur (RT). Neutralisieren Sie die Trypsin durch Zugabe von 5 mL RPMI/10% FCS. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 200 X g für 5 min. die Zelle Pellet in RPMI/FCS eine Endkonzentration von 10.000 Zellen/mL als durch auszählen in einem Hemocytometer wieder aussetzen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>40 x 25 µL (= 250 Zellen) der Zellsuspension auf der inneren Oberfläche des Deckels eine sterile nichtklebenden Zelle Kulturschale (Ø 10 cm) mit einer elektronischen Multi-Pipette zu erkennen. Drehen Sie mit einer schnellen aber glatte Bewegung den Deckel um und legen Sie sie auf der jeweiligen Zelle Kulturschale mit 5 mL PBS.<ol>
<li>Kultur "hängenden Tropfen Gerichte" in eine Zelle Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 10-14 Tage, je nach Zelltyp verwendet. Hinweis: Zellen aus der MM-Wachstumsphase in der Regel schneller wachsen und bilden solidere Sphäroide in den hängenden Tropfen gegenüber Melanomzellen RGP oder VGP abgeleitet. Beachten Sie bei individuellen Bewertung Sphäroid Wachstum unter Fernglas oder unter einem Lichtmikroskop (4 X Vergrößerung). Sphäroide werden in der Regel nach 48 h unter Fernglas oder unter einem Lichtmikroskop (4 X Vergrößerung) nachweisbar. Nach 10-14 Tagen sind sie ohne Vergrößerung Gerät sichtbar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 Tage nach dem ersten Tropfen Schmierblutungen hinzufügen 10 µL des frischen RPMI/10% FCS-Medium zu jedem Tropfen. Anschließend tauschen Sie 10 µL Medium jeden zweiten Tag. Die Verwendung von einem elektronischen Dispenser ist sehr hilfreich in diesem Schritt.</li>
	<li>Je nach Zelltyp ernten Sie die Sphäroide (siehe Abschnitt 10) nach 10-15 Tagen durch sanft abspülen des Zelle Kultur Schale Deckels mit PBS. Sammeln sie in einer Kulturschale nichtklebenden Frischzellen. Hinweis: Die Anbau Zeit richtet sich nach der Tumor Wachstumsphase der Melanomzellen Wenn sie zunächst abgeleitet wurden, z.B.Sphäroide abgeleitet von 451-LU Zellen wachsen, um etwa 500 µm im Durchmesser innerhalb von 12 Tagen der Kultivierung in den hängenden Tropfen15 .</li>
</ol>7. Generation von dermalen Abteil des organotypischen voll Haut rekonstruiert
<ol><li>Generieren Sie hautmodelle mit 24 Wohlen Zelle mikroporösen Membran Einsätze (pore Größe 8 µm) in 24-Well Platten gelegt. Hinweis: Stellen Sie sicher, nicht hängend zu verwenden aber ständigen Einsätze, weil sie in einer 6-Well-Platte für den Luft-Flüssigkeit Anbau zu einem späteren Zeitpunkt gestellt werden.</li>
	<li>Bereiten Sie das Gel Neutralisation Lösung (GNL)15sowie die Nährmedien als MM und endothelial Wachstum Medien (EGM)16,17bezeichnet. Um die Gerinnung zu verhindern, laden das Kollagen Typ I (in der Regel von Rattenschwanz, 3,5-4 mg/mL in 0,02 N Essigsäure) auf Eis bis zum Gebrauch, denn es beginnt zu Gelieren bei RT</li>
	<li>Neu 1 x 105 Fibroblasten pro Einsatz in GNL und mischen Sie schnell die Zellsuspension mit Kollagen in einem Verhältnis von 1:3 in einem Endvolumen von 500 µL/einfügen. Mix von sanft pipettieren rauf und runter, um Blasenbildung zu vermeiden, da Luftblasen die Qualität der Haut beeinträchtigt zu rekonstruieren.</li>
	<li>Lassen Sie die einzelnen dermal Gele, indem man sie ohne Medium bei RT für 30 min in einem sterilen Abzug zu begleichen. Decken Sie anschließend jedes Gel mit DMEM mit 4,5 g/L Glukose, 1 % L-Glutamin, 10 % FCS, und ohne L-Pyruvat, und über Nacht bei 37 ° c inkubieren</li>
</ol>8. Generation der epidermalen Abteil des organotypischen voll Haut rekonstruiert
<ol><li>Am nächsten Tag entfernen Sie das Medium aus der dermalen Gele und equilibrate sie mit EGM Medien (10 % FCS, 1 % PenStrep, 10 mg/mL Gentamicin) für 2 h bei 37 ° C. Zurückziehen Sie des Mediums und Samen Sie sorgfältig 1 x 105 Keratinozyten in 100 µL EGM auf die dermale Gel Nukleinsäuretablette.</li>
	<li>Inkubieren Sie rekonstruiert für 1,5 h bei 37 ° C um die Keratinozyten zur Einhaltung der dermalen Kompartiment zu ermöglichen. Hinweis: Während dieser Inkubationszeit beginnt die Gele zu schrumpfen durch Fibroblasten-induzierten Kontraktion und somit zumindest teilweise von den Wänden einfügen lösen.</li>
	<li>Decken Sie die Haut Entsprechungen mit rund 800 µL EGM und entfernen Sie vorsichtig das restliche Gel aus der einfügen-Wand mit einer kleinen (weiß) PIPETTENSPITZE. Die Haut-äquivalente untergetaucht in EGM für 7 Tage in einer Zelle Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2, Kultur und das Medium täglich verändern. Hinweis: Während dieser Zeit werden die Haut Entsprechungen deutlich schrumpfen.</li>
</ol>9. Air-Liquid-Anbau von organotypischen voll Haut rekonstruiert
<ol><li>Am Tag 8 Übertragung jedes stecken Sie in einem einzelnen Brunnen einer 6-Well-Platte. Nur fügen Sie 1,2-1,4 mL MM Medium jedes gut hinzu, so dass die Haut zu rekonstruieren ist mit Medium von der Unterseite des Brunnens geliefert, aber nicht mit Medium fällt. Hinweis: Anbau an der Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle ermöglicht Schichtung der epidermalen Teil und Einrichtung einer vollen Hornschicht (Stratum Corneum).</li>
	<li>In den nächsten Tagen von 10-17 verändern Sie das Medium wie in Abschnitt 9,1 jeden zweiten Tag. Während dieser Zeit fügen Sie Drogen oder andere Reize bei Bedarf auf das Medium. Entfernen Sie vorsichtig die volle Haut rekonstruieren aus dem mikroporösen Membran einfügen gebogenen Pinzette für weitere Analysen, z.B.immunhistochemische Analyse (Abbildung 1).</li>
</ol>10. Generation der organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodelle
<ol><li>Melanom Sphäroide in der dermalen Fach des organotypischen volle Haut rekonstruiert zu integrieren, spülen Sie sorgfältig die Sphäroide (nach Schritt 6.4) den Deckel der hängenden Tropfen Zelle Kulturschale mit PBS. Sammeln Sie 10-20 Sphäroide/einfügen in eine sterile Zelle nichtklebenden Kulturschale. Entfernen Sie vorsichtig die übermäßige PBS mit einer Pasteurpipette.</li>
	<li>Aspirieren Sie die Sphäroide in die kleinstmögliche Volumen der EGM. Zu diesem Zeitpunkt beobachten Sie und zählen Sie die Sphäroide mit bloßem Auge, ohne jede weitere Vergrößerung Gerät. Nehmen Sie 10-20 Sphäroide pro Haut Modell/Gel, wie in Schritt 10.1 angegeben.</li>
	<li>Übertragen Sie sie auf die gewünschte Lautstärke GNL mit Fibroblasten (während Schritt 7.3) und mischen mit dem Kollagen Typ ich. Von diesem Schritt auf wie in den Abschnitten 7.3-9.1 beschrieben vorgehen. Hinweis: Tumor Sphäroide werden sichtbar in der dermalen Gel als weiße Flecken (Abbildung 2)</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell hier vorgestellten garantiert neue Erkenntnisse für ein tieferes Verständnis der Intra-Tumor und Tumor-Wirt-Interaktion, und bieten eine erweiterte Screening-Plattform zur Untersuchung von molekularer Mechanismen der Tumorentstehung und Therapieresistenz in der Zukunft.
Um die beste Garantie physiologische und rekonstruiert in Vivo Bedingungen der Haut imitiert, die Qualität der PV-Zellen ist von größter Bedeutung. Wie bereits erwähnt, juvenile oder pränatale Hautzellen zeigen die niedrigsten Differenzierungsgrad und eignen sich daher am besten, voll-dicke Haut Entsprechungen zu generieren. Die erste mögliche Qualitätskontrolle ist das Ausmaß der dermalen Kontraktion am 2. Tag nach der Aussaat der Keratinozyten und äquilibrierung das Gel EGM (Protokoll Abschnitte 8.2 und 8.3). Dermale Gele werden am meisten mit der besten Qualität von Fibroblasten schrumpfen. Auch kann die Integration der zu wenige oder zu viele Fibroblasten dermal Kontraktion und folglich Befestigung der der epidermalen, dermalen Kompartiment beeinträchtigen. Dies beeinträchtigt wiederum epidermalen Differenzierung, weil dieser Prozess eine umfangreiche Übersprechen zwischen den dermalen und epidermalen Zellen erfordert.
Die Qualität von Primärzellen hängt auch die Zelle Konfluenz sowie die Passage der Zellen. Wenn Keratinozyten, ≥80 % Konfluenz angebaut werden sie sofort stoppen, wuchernden und beginnen zu unterscheiden. Es ist daher wichtig Kultur sie zu 40-70 % Konfluenz während passagierung und verwenden Sie sie nicht später als Durchgang 3-4. Fibroblasten sind weniger empfindlich, aber sollte nicht später als 4-6 Durchgang verwendet werden. Bitte beachten Sie, dass alle Primärzellen und Zelllinien zur Erzeugung von organotypischen Melanom Sphäroid hautmodelle kultiviert sind frei von Antibiotika, und daher ist das Kontaminationsrisiko hoch. Aber die Zugabe von Antibiotika ändert sich die Physiologie der einzelnen Zellen und reduziert somit die Qualität der Haut Entsprechungen.
Im Allgemeinen ist Sphäroid Tumorbildung möglich aus fast allen Arten von Tumor-Zell-Linien und auch von Tumorzellen, die frisch von Patientenmaterial isoliert. Die erste Zelle Nummer bzw. Anbau Zeit für die Gewinnung optimaler Sphäroid Größen variieren je nach Zelltyp verwendet. Bis zu einer Größe von 150-200 µm können alle Zellen in einem Sphäroid enthalten noch ausreichend mit Nährstoffen durch einfache Diffusion versorgt werden. Nur Sphäroide mit Größen ≥500 µm zeigen ein hohes Maß der Zelldifferenzierung und typischen Merkmale nicht durchblutet Tumor Gewebe22vertreten.
Die organotypischen Melanom-Sphäroid-Haut-Modell entwickelt, hier eignet sich besonders zur Tumor-Wirt Interaktionen zu untersuchen und für Melanom Drogentests unter in Vivo-Bedingungen15mag. Dennoch ist die Umgebung des Melanoms in Vivo noch komplexer, beherbergen eine Vielzahl von Zelltypen Tumor verbunden sind, einschließlich der Immunzellen und Endothelzellen. Da die Zugabe der richtigen primären Immunzellen Problemen mit Histocompatibility konfrontiert ist, sind diese Modelle noch nicht in der Lage, angemessen zu überwachen, immun-therapeutische Ansätze.
Dennoch, Melanom Sphäroide aus frisch isolierte Patientenmaterial generiert werden und nach in die volle Haut zu rekonstruieren, kann dienen als individuelle Drug screening Plattformen. Auch die Integration der Stücke von Melanom-Metastasen in Haut rekonstruiert ist denkbar, Medikamenten-Kombinationen in einer maßgeschneiderten Therapieansatz zu testen. Einschließlich organotypischen 3D-Modell Haut Melanom in der präklinischen Prüfung dürfte dazu beitragen, dass nur die vielversprechendsten neuartige therapeutische Konzepte in klinischen Tests, vorangebracht werden wodurch die Ausfallrate von potenziellen neuen Behandlungen für diese Krankheit und Erhöhung der Therapieerfolg in klinischen Studien.

Die menschliche Haut besteht aus zwei verschiedenen Fächern, die unterschiedliche Funktionen im Schutz des Körpers vor nachteiligen Auswirkungen auf die Umwelt1dienen. Die untere dermale Fach besteht aus einer Fibro-elastisches Bindegewebe. Es besteht aus lose miteinander verbundenen Kollagen und Elastin-Fasern von Fibroblasten, dient eine mechanische Barrierefunktion synthetisiert. Die Dermis ist von der oberen Epidermis durch die Basallamina getrennt als eine extrazelluläre Matrix durch eine ständige Kommunikation zwischen beiden Kammern der Haut produziert wird. Im Gegensatz zu der Dermis Epidermis ist ein Plattenepithel besteht hauptsächlich aus Keratinozyten und kann in vier Schichten unterschieden werden. Das Stratum Basale besteht aus undifferenzierten basalen Keratinozyten, die ständig aus Vorläuferzellen der Haut durch die Stadien des Stratum Spinosum und Stratum Granulosum in Stratum Corneum stratifiziert , schützen den Körper vor Austrocknung und Infektionen2. Melanozyten sind ausgerichtet auf die Basalmembran und kommunizieren über dendritische Erweiterungen mit mehreren Keratinozyten. Sie produzieren das Pigment Melanin zum Schutz der Haut vor den schädlichen Auswirkungen der UV-Strahlung, wie Hautalterung, Immunsuppression, Entzündung und Induktion von nicht-Melanom-Hautkrebs. UV Strahlungen Beitrag zur Transformation der Melanozyten, malignes Melanom, ist jedoch noch in der Diskussion3.
Melanom Entwicklung differenziert nach verschiedenen Tumorstadien Fortschreiten, und von bestimmten genetischen, morphologischen und histologischen Veränderungen4gekennzeichnet. Sie stammen entweder de Novo oder von einer angeborenen oder erworbenen Nävus aufgrund einer lokalen erhöhen der Melanozyten Proliferation verursachen gutartige Neoplasie. Diese Vorstufe Läsion kann wandeln in strukturell veränderten dysplastische Gewebe werden Zellen, die zu der ersten malignen Phase der radialen Wachstumsphase (RGP) fortsetzen kann. Diese frühen Tumor Progression Phase zeichnet sich durch Zellen vermehren Radial innerhalb der Epidermis, zeigt einige lokal invasive Zellen innerhalb der papillären Dermis. Während der anschließenden vertikales Wachstum Phase (VGP) Melanom zeigen Zellen bereits metastasierendem und invasiven Phänotyp durch das brechen durch die Basallamina, die tieferen Bereiche der Dermis sowie die Unterhaut5zu infiltrieren. Schließlich stellt metastasierendem Melanom (MM) die aggressivste Progression-Bühne mit metastasierenden Zellen systemisch Verbreitung im gesamten System der Blut- und Lymphzirkulation, Organe wie Leber, Lunge und Gehirn6nach distal zu erobern.
Früherkennung, gefolgt von einer Operation bleibt bis heute die effektivste Therapie des malignen Melanoms. Die Prognose bei Patienten mit Fernmetastasen, bleibt allerdings besonders schlecht7, weil klassische Chemotherapie-Regimen nur wenig überleben nutzen8,9übertragen. Allerdings haben die jüngsten Fortschritte in zielgerichtete Therapien nach Jahrzehnten der Stagnation, die Prognose des malignen Melanoms erheblich verbessert.
Dysregulation der zwei wichtige Mitogen aktiviert Signalwege, die RAS-RAF-MEK-ERK und die Signalwege PI3K-AKT-PTEN präsentieren Schlüsselfaktoren der Melanom-Progression, zumal konstitutiv Punktmutationen des Proto-oncogenes BRAFV600 aktivieren und NRB sind vorhanden10. Entsprechend versprach die Erfindung des gezielten Kinase-Inhibitoren therapeutischen Nutzen für Patienten mit metastasierendem Melanom. Eine Vielzahl von klinischen Studien zu diesem Punkt hat erhebliche Vorteile für Patienten mit metastasierendem Melanom nicht erreicht. Fast alle Antworten sind teilweise mit einer Subpopulation von Patienten mit primären Widerstand. Darüber hinaus wurde die Übernahme von sekundären Widerstand bis zum Rezidiv führt in der Mehrzahl der Patienten11,12beobachtet.
Es wird klar, dass Analyse der Mutationsstatus allein nicht ausreichen, um die stärkste therapeutische Strategie zu entwickeln. Neue schnelle und zuverlässige Diagnose-Tools sind notwendig, um systematisch erfassen und analysieren die Reaktionsfähigkeit der einzelnen Krebszellen. Die überwiegende Mehrheit der derzeit verfügbaren Daten zur menschlichen Melanom wurden aus zweidimensionalen (2D) Melanom Zellkulturen gewonnen. Tumorzellen, jedoch gewachsen in 3D ermöglichen interzellulären Übersprechen zwischen differenzierte Krebs Zelle Subpopulationen sowie zwischen Krebszellen und die nicht-transformierten umliegende Wirtsgewebe. Daher wäre es am besten, die 3D-Umgebung zu rekonstruieren, in dem das Melanom entwickelt, als eine präklinische Screening verwendet werden, Modell13,14.

<table><tbody><tr><td>Fötales Serumalbumin (FCS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>10 % dem Zellkulturmedium zusetzen</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td>1X verdünnt in PBS</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61870010</td><td>für die Kultivierung von Melanomzelllinien</td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965062</td><td>für die Kultivierung von primären Fibroblasten</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco life technologies&nbsp;</td><td>17105041</td><td>2U/ml, in PBS</td></tr><tr><td>Kollagen Typ I</td><td>BD Biosciences</td> auflösen <td>354249</td><td>normalerweise aus dem Rattenschwanz, die Konzentration sollte 3,5-4 mg/ml betragen</td></tr><tr><td>24-Well-Einsätze Nunclon&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>140629</td><td>8 &micro; M Porengröße; Verwenden Sie stehende, keine hängende Einsätze!</td></tr><tr><td>Zellsieb</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>gelb</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15750060</td><td>in PBS auflösen</td></tr><tr><td>Keralife Keratinzytmedium</td><td>Cell Systems</td><td></td><td>fügt kein FCS oder Antibiotika</td></tr><tr><td>hinzu Kollagenase</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td>NB4</td></tr><tr><td>jugendliche menschliche Keratinozyten</td> in Standardqualität <td>Cell Systems</td><td>FC-0007</td><td>Alternative zum eigenen Präparat aus juveniler Vorhaut</td></tr><tr><td>juvenile humane Fibroblasten</td><td>Cell Systems</td><td>FC-0001</td><td>Alternative zum eigenen Präparat aus juveniler Vorhaut</td></tr><tr><td>DMEM [+] 4,5 g/l Glucose, [+] L- Glutamin, [-] L- Pyruvat</td><td>Gibco life technologies</td><td>41965</td><td>1:1 mit Schinken mischen; s F-12 für MM medium; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 3:1 mit Schinken mischen; s F-12 für EGM medium</td></tr><tr><td>Schinken&akut; s F-12 [+] L-Glutamin</td><td>Gibco Lebenstechnologien</td><td>&nbsp; 21765-029</td><td>Hinzufügen zu DMEM für die Erzeugung von EGM- und MM-Medium (siehe Spur 15)</td></tr><tr><td>EGF&nbsp;</td><td>Gibco life technologies</td><td>&nbsp; 13247-051</td><td>Zugabe von 10 ng/ml nur für die Erzeugung von EGM-Medium</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Merck Chemicals</td><td>2381</td><td>Zugabe von 1,9 mM für die Erzeugung von EGM und 3,8 mM für MM-Medium</td></tr><tr><td>Selensäure</td><td>Alfa Aesar</td><td>18851</td><td>Zugabe von 53 nM für die Erzeugung von EGM und MM-Medium</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Lilly</td><td>HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml</td><td>Zugabe von 5 &; micro; g/ml zur Erzeugung von EGM- und MM-Medium</td></tr><tr><td>Ethanolamin</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>E-0135</td><td>add 0,1 mM für die Erzeugung von EGM und MM-Medium</td></tr><tr><td>P-Ethanolamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-0503</td><td>add 0,1 mM für die Erzeugung von EGM und MM-Medium</td></tr><tr><td>Holo-Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T-0665</td><td>add 5 & micro; g/ml für die Erzeugung von EGM- und MM-Medium</td></tr><tr><td>Triiodthyronin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6397</td><td>add 20 pM für die Erzeugung von EGM- und MM-Medium</td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-088816</td><td>add 0,4 &micro; g/ml für die Erzeugung von EGM- und MM-Medium</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8783</td><td>10 nM nur für die Erzeugung von EGM-Medium</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3784</td><td>15 mM für die Erzeugung von EGM- und MM-Medium</td></tr><tr><td>Serin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4311</td><td>1 mM für die Erzeugung von EGM- und MM-Medium</td></tr><tr><td>Cholinchlorid</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C-7017</td><td>0,64 mM für die Erzeugung von EGM und MM-Medium</td></tr><tr><td>dFCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-0392 Los 086K0361</td><td>Add 2 % für die Erzeugung von EGM und MM-Medium</td></tr><tr><td></td><td>Adenin Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A-9795</td><td>add 0,18 mM für die Erzeugung von EGM und MM-Medium</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>PromoCell</td><td>C-42209</td><td>add 7,25 mM für die Erzeugung von EGM und MM-Medium</td></tr><tr><td>Strontiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255521</td><td>1 mM für die Erzeugung von EGM und MM-Medium</td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin 10 Antikörper</td><td>Dako</td><td>M7002</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin 14 Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-53253</td><td>1:200</td></tr><tr><td>&nbsp; Anti-Laminin-5-Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32794</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Anti-Filagrin-Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA5-13440</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Anti-Involucrin-Antikörper</td><td>Acris Antikörper</td><td>AM33368PU</td><td>1:50</td></tr><tr><td>sekundärer polyklonaler Ziegen-Anti-Maus-IgG FITC-markierter</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-C153907</td><td>1:50</td></tr><tr><td>sekundärer polyklonaler Ziegen-Anti-Maus-Antikörper IgG Cy3 gekennzeichnet mit</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>115-165-003</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10236276001</td><td>1:100</td></tr></tbody></table>

ein 3d organotypischen melanom sphäroid hautmodell

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Maligne Transformation der Melanozyten, die Pigmentzellen der menschlichen Haut verursacht Bildung eines Melanoms, einen sehr aggressiven Krebs mit metastasiertem Potenzial. Vor kurzem, Mono-Chemotherapien weiterhin von Melanom spezifische Kombinationstherapien mit gezielten Kinase-Inhibitoren verbessern. Dennoch bleibt metastasierendem Melanom eine lebensbedrohliche Krankheit weil Tumoren primäre Resistenz aufweisen oder entwickeln Resistenz gegen neuartige Therapien, damit wieder tumorigenic Kapazität. Um den therapeutischen Erfolg des malignen Melanoms zu verbessern, ist die Bestimmung der molekularen Mechanismen, die Übertragung der Resistenz gegen herkömmliche Behandlungsansätze notwendig; jedoch braucht es innovative zelluläre in-vitro- Modelle. Hier stellen wir eine in-vitro- dreidimensionale (3D) organotypischen Melanom Sphäroid Modell, das kann die in Vivo -Architektur des malignen Melanoms darzustellen und kann neue Erkenntnisse rechtfertigen Intra-Tumor sowie Tumor-Wirt Interaktionen. Das Modell enthält definierte Anzahl von Reifen und differenzierte Melanom Sphäroide in einem 3D voll Menschenhaut Wiederaufbau Modell bestehend aus primären Hautzellen. Die zelluläre Zusammensetzung und Differenzierung Status des eingebetteten Melanom Sphäroide ähnelt der eines kutanen Melanom Metastasen in Vivo. Mit diesem organotypischen Melanom Sphäroid Modell, wie ein Drogen-screening-Plattform die Identifizierung der Responder zu unterstützen kann Kombinationstherapien, während erspart unnötige Behandlung Belastung für non-Responder, wodurch des Vorteils ausgewählt therapeutische Interventionen.

Erfolgreicher Behandlung von Melanomen Metastasen kann durch das Übersprechen zwischen Tumorzellen sowie zwischen Tumor und nicht-transformierten Wirtszellen beeinflusst werden. Organotypischen Modelle von Krebs in Vitro zu entwickeln soll geeignete präklinische Testsysteme bereitstellen, die die 3D Organisation und Komplexität der menschlichen Melanom rekapitulieren in-vivo. Dies ermöglicht die Untersuchung der therapeutischen Wirkung auf den Tumor innerhalb einer organotypischen Umgebung und die negativen Auswirkungen auf das umliegende Gewebe der primären parallel.
Um die besten organotypischen hautmodelle zu entwickeln, ist die Qualität der PV-Zellen entscheidend. Es ist vorteilhaft, juvenile primäre Fibroblasten und Keratinozyten, zu verwenden, weil sie in der Regel weniger im Vergleich zu Erwachsenen primäre Hautzellen unterscheiden. Juvenile Haut Zellen können entweder isoliert von juvenile Vorhaut wie beschrieben im Abschnitt "Protokoll" 1-5, sondern auch werden von Firmen wie pränatale primäre Fibroblasten und Keratinozyten erworben. Wenn Kauf, ist es notwendig, Bestellung Zellen von verschiedenen Spendern Spender-spezifische Ergebnisse, z.B.für Drogen Empfindlichkeit zu vermeiden. Das gesamte Protokoll wird als ein Schema in Abbildung 3dargestellt.
Qualitätskontrolle von 3D Full-Haut-äquivalenten erfordert immunhistochemische Analyse. Ein erster Eindruck erhalten Sie durch die Hämatoxylin-Eosin (H &amp; E) Färbung von Paraffin eingebettet Abschnitte (3 µm). Detaillierte Analyse der Qualität der epidermalen Differenzierung und Bildung von der Basallamina zwischen Dermis und Epidermis erfordert immunhistochemische Analyse mit spezifischen Antikörpern gegen einen epidermalen Schichtung-Marker. Dies ermöglicht Unterscheidung zwischen undifferenzierte, hoch proliferativen Zellen liegt in der Nähe der Basalmembran und sehr differenziert und keratinized Zellen an das Stratum Corneum durch die Bildung von epidermalen Schichten dazwischen . Dargestellt durch immun-histologische Färbung (Abbildung 4), Differenzierung der Keratinozyten in der Epidermis ähnlich wie normale Haut erzielt werden konnten: vor allem die undifferenzierten Zellen aus den unteren epidermalen Schichten (Schicht Basale und Stratum Spinosum) positiv für Keratin 14, färben, während die differenzierteren Zellen aus den supra basalen Schichten (Stratum Granulosum und Stratum Corneum) 10 und Involucrin positiv für Keratin färben. Dementsprechend konnte die Filaggrin Färbung nur in hoch differenzierten Zellen des Stratum corneumsbeobachtet werden. Am wichtigsten ist, zeigt Laminin 5 Färbung, dass eine Basallamina generiert wurde, um mit dermalen Abteil des kunsthaut rekonstruieren physiologisch der epidermalen verbinden. Dies beweist, dass eine Verbindungstür organotypischen Mikroumgebung Host Melanomzellen oder Sphäroide für physiologische und pathophysiologische Analyse generiert wurde.
Zum Zwecke der Melanom-Drogen-Screening, können einzelne Melanomzellen auch in der Dermis volle Haut äquivalente erlauben de Novo Melanom Nest Bildung18,19integriert werden. Daher sind Melanomzellen kombiniert mit primäre Fibroblasten in einem Verhältnis von 5:1, zusammen mit 200 X g für 5 min zentrifugiert und Nukleinsäuretablette in GNL vor dem Vermischen mit Kollagen. Infolgedessen bilden die Melanom-Zelle-Nester spontan in der dermalen Kompartiment. Unserer Erfahrung nach phase nur Zellen des metastasierten Wachstums Form richtige Nester, im Vergleich zu Melanomzellen RGP oder VGP15. Ein großer Nachteil dieser Art von Modellen die Tatsache, die die Anzahl und Größe der Melanom-Nester gebildet können nicht vorhergesagt werden ist, variieren zwischen den einzelnen Haut rekonstruiert, unabhängig von jeder Behandlung. Zum Beispiel können 1.000 Zellen ausgesät in der dermalen Fach 10 Nester bestehend aus 100 Zellen oder 100 Nester, bestehend aus 10 Zellen jeweils (Abbildung 5) gewinnen. Diese biologischen Variablen präsentieren mit drei Mängel: Erstens die Anzahl und Größe der Melanom-Nester gebildet sind unvorhersehbar; Zweitens die Metastasen in Vivo sind meist größer als Melanom Nester und zeigen vielfältige komplexer Intra-Tumor; und drittens durch die begrenzte Lebensdauer der Tumor-Nest Modelle Behandlung wird frühzeitig eingeleitet, und folglich eher hemmt Tumor Auswuchs statt verursacht Rückbildung von bestehenden Tumor Nester.
Um diese Einschränkungen organotypischen Melanom Sphäroid hautmodelle überwinden kann generiert werden. Durch die Kultivierung 250 metastasierendem Melanom Zellen in einer hängenden für 14 Tage20fallen, werden Sphäroide reproduzierbar erzeugt bestehend aus lebensfähigen Melanom, die Zellen präsentiert einen kompakten Aufbau mit einem Enddurchmesser von etwa 500 µm imitiert nicht durchblutet Tumor-Knoten, Mikro-Metastasen oder Inter Kapillare Mikro Regionen von soliden Tumoren21,22. In der Regel Melanom-Zell-Linie eignet sich für die Generation der Sphäroide über das HÃ ¤ ngen drop-Methode; Allerdings Zellen abgeleitet weiter fortgeschritten metastasiertem Tumor Stadien Form fester Sphäroide verglichen mit Zelllinien aus Fortschreiten Anfangsphase, z. B.die RGP.
Für einige Zellen ist es vorteilhaft für richtige Sphäroid Bildung zur Verbesserung der Viskosität der hängenden Tropfen Kulturmedium. Dies kann durch die Zugabe von 10-50 % Methylcellulose auf dem Kulturmedium erreicht werden. Für die Methylcellulose Stammlösung Autoklaven 1,2 g Methyl-Zellulose zusammen mit einer magnetischen rühren Bar in einer 100 mL-Glasflasche. Hinzufügen von 100 mL vorgewärmten (60 ° C) Medium und rühren für 20 min bei Raumtemperatur und eine weitere 1-2 h bei 4 ° c Die Stammlösung für 2 h bei 5.000 x g zentrifugieren und viskosen Überstand bei 4 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.
Ordnungsgemäße Validierung von volle Haut Melanom Sphäroid Modellen erfolgt durch die Tatsache, dass eine definierte Anzahl von Melanom Sphäroide können - zumindest statistisch gesehen - in der dermalen Fibroblasten/Kollagen integriert werden, die ich am 1. Tag des Haut-Modellbau, Gerüst ermöglicht Sie während der epidermalen Differenzierung für 25-27 Tage gemeinsam zu entwickeln. Die Ausbeute an Sphäroide kann direkt nach der Aussaat, analysiert werden, weil Sphäroide erscheinen als weiße Flecken innerhalb der transparenten dermal gel und ohne Vergrößerung Gerät (Abbildung 2) gesehen werden können. Dadurch entsteht eine 3D Hautmodell, dass Häfen Reife Melanom Sphäroide, die kultivierten in Vitro für insgesamt ca. 42 Tage, zeigt das höchste Niveau der Intra-Tumor war-Differenzierung15 Zell.
H &amp; E Färbung der Haut Melanom Sphäroid Modell zeigt die histologischen Erscheinungsbild und zelluläre Verteilung von Melanom Sphäroide sehr ähnlich dem menschlichen Melanom nicht durchblutet Haut Metastasen in Vivo15 (Abbildung 6 zu ). Zwei Subpopulationen von Melanomzellen sind unter diesen Bedingungen deutlich zu unterscheiden: einer peripheren wuchernden Subpopulation und einer zentralen Subpopulation, hauptsächlich bestehend aus geschrumpft, Apoptotic oder nekrotischen Zellen bilden die so genannte "nekrotische" Zentrum. -Proteins Leben und vermehren Subpopulationen detektiert werden mit Antikörpern gegen die Verbreitung Marker KI-67, während Zellen des nekrotischen Center von TUNEL-Färbung15visualisiert werden können. Diese besondere Verteilung der Tumor Zelle Subpopulationen gerechtfertigt ist durch die Sphäroid Größe (≥500 µm), durch einen Mangel an Nährstoffen und Sauerstoff im zentralen Teil denen katabolen Abfall ansammelt. Nach dem Protokoll, sofern hier die Generierung von eine zuverlässige und reproduzierbare organotypischen erlaubt eingebettet voll Dicke Menschenhaut Modell mit menschlichen Melanom Sphäroide, die menschlichen Melanom Haut Metastasen zu imitieren. Anwendungen von diesem Modell gehören Drogentests, screening von Toxinen, kosmetische Substanzen beeinflussen oder laser-Therapie auf Melanom Auswuchs und Behandlung.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig1.jpg"> Abbildung 1 : Anbau von 3D organotypischen Haut rekonstruiert untergetaucht mit Medium und an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit. Am Tag 0, die primären Keratinozyten auf der Oberseite der dermalen Kompartiment bestehend aus primären Fibroblasten entkernt sind eingebettet in eine Kollagen-Typ ich Matrix. 3D Haut rekonstruiert kultiviert mit EGM für 7 Tage unter Wasser zu bleiben, trennen Sie die Insert-Wand und schrumpft. Am Tag 8 sind die Einsätze auf 6-Brunnen übertragen und an der Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle erlauben epidermalen Schichtung kultiviert. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig2.jpg"> Abbildung 2 : Melanom Sphäroide eingebettet in das dermal Fach als weiße Flecken erscheinen. Während der Vorbereitung der dermalen Fachs des 3D Haut rekonstruieren, eine definierte Anzahl von Melanom Sphäroide Fibroblasten Kollagen Typ hinzugefügt werden kann mischen ich. Sobald das dermale Gel gelegt hat, werden Melanom Sphäroide als weiße Flecken sichtbar.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig3.jpg"> Abbildung 3 : Schema der 3D organotypischen Haut Modellbau. Die Hautprobe Fettgewebe entfernen und in kleine Stücke schneiden. Inkubation mit Dispase Lösung über Nacht bei 4 ° C erleichtert die Trennung der Epidermis von der Dermis. Isolierte primäre Fibroblasten und Keratinozyten sollte separat angebaut und zwischen Durchgang 4-6 und 3-4, bzw. verwendet werden. Anschließend kann die Generierung des Modells 3D Haut wie im Protokoll beschrieben vorgehen. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig4.jpg"> Abbildung 4 : 3D organotypischen Haut rekonstruiert zeigen eine Differenzierung Ebene ähnlich wie normale menschliche Haut. Paraffin Abschnitte Haut äquivalente (A) im Vergleich zu normalen menschlicher Haut (B) waren für den Ausdruck der Keratine 14 gefärbt (rot: λex 554 nm; λEm 568 nm) und 10, Involucrin (grün: λex 490 nm; λEm 525 nm ), Filaggrin (grün: λex 490 nm; λEm 525 nm), und Laminin 5 (grün: λex 490 nm; λEm 525 nm), und mit einem konfokale Fluoreszenzmikroskop analysiert. Zellkerne wurden visualisiert durch DAPI-Färbung (blau: λab 340 nm; λEm 488 nm). Immunhistochemische Untersuchung der 3D Full-dicke Haut äquivalente offenbarten richtige epidermalen Schichtung getrennten Schichten der Epidermis bildet, wie in der normalen menschlichen Haut zu sehen. Während Zellen aus den unteren epidermalen Schichten für Keratin 14 positiv gefärbt, unterschieden je mehr Zellen von der supra-Basalschicht zeigte Keratin 10 und Involucrin Färbung. Hoch differenzierte Zellen in der Nähe des Stratum corneums ausgedrückt Filaggrin. Laminin 5 Färbung zeigt, dass eine Basallamina erzeugt wird, um physiologisch der epidermalen dermalen Kompartiment (niedrigste Panel) herstellen. Diese Zahl wurde von Voersmann Et Al. übernommen 15 mit Erlaubnis. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig5.jpg"> Abbildung 5 : Die Anzahl und Größe der spontan gebildeten Melanom Nester können nicht vorhergesagt werden. De Novo Melanom Nest Bildung im dermalen Fach der volle Haut Mittel erreicht werden können, durch Mischen einer definierten Anzahl von Melanom-Zellen mit primäre Fibroblasten zum Einbetten von beiden Zelltypen in Kollagen Typ ich Matrix. Die Anzahl und Größe der spontan gebildeten Melanom Nester können nur von einer Reife 3D Haut rekonstruieren nach ca. 21 Tagen analysiert werden. Wie abgebildet aus zwei Proben (A) und (B), die Zahlen und die Größen der Melanom-Nester variieren zwischen den einzelnen Haut rekonstruiert. Infolgedessen ist es schwierig, diese Modelle zu validieren und die therapeutische Wirkung vorherzusagen. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig6.jpg"> Abbildung 6 : Melanom Sphäroide integriert Haut äquivalente rekapitulieren Hauptmerkmale des menschlichen kutanen Melanom Metastase. H &amp; E gefärbt Paraffin Abschnitte des Tumors Sphäroide eingebettet in Haut äquivalente offenbart Sphäroide Hauptmerkmale mit nicht durchblutet menschlichen kutanen Melanom Metastasen in Vivozu teilen. Zwei Subpopulationen von Zellen sind deutlich erkennbar: eine periphere lebenden Subpopulation und zentrale Subpopulation, hauptsächlich bestehend aus geschrumpft, Apoptotic oder nekrotischen Zellen, die "nekrotische" Zentrum. Diese Verteilung der Tumor Zelle Subpopulationen garantiert der Sphäroid-Größe. Diese Zahl wurde von Voersmann Et Al. modifiziert 15 mit Erlaubnis. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell zu generieren, die sowohl die Architektur rekapituliert und mehrzelligen Komplexität einer Orgel/Tumor in Vivo aber gleichzeitig bietet Platz für systematische experimentelle Intervention.

Ein 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Das übergeordnete Ziel dieses 3D-organotypischen Melanom-Sphäroid-Hautmodells ist es, sowohl die Architektur als auch die multizelluläre Komplexität eines Organs oder Tumors in vivo zu rekapitulieren und gleichzeitig systematische experimentelle Eingriffe zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Melanomforschung zu beantworten, wie z.B. Tumor-Wirt-Interaktion und therapeutische Intervention. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die 3D-Architektur von nicht-vaskularisierten Metastasen in vivo nachahmen können.Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie des Melanoms, da sie die Heterogenität des Tumors widerspiegelt. Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Qualität der Primärzellen entscheidend ist und während des Zellprozesses keine Antibiotika verwendet werden. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie des Melanoms, da sie die Heterogenität des Tumors widerspiegelt.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die richtige Handhabung des 3D-Melanom-Hautmodells sehr wichtig ist. Zu Beginn werden Melanomzellen 451LU mit RPMI-Medium kultiviert, das 10 % FCS enthält, gemäß den allgemeinen Zellkulturprotokollen. Um Melanom-Sphäroide zu erzeugen, waschen Sie die kultivierten Melanomzellen in PBS.Fügen Sie dann fünf Milliliter einmal Trypsin EDTA in PBS hinzu. Drei bis fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie fünf Milliliter RPMI mit 10% FCS hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren.Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 200 mal g, um die Zellen zu ernten. Suspendieren Sie das Zellenpellet wieder in RPMI mit 10 % FCS.Zählen Sie als Nächstes die Zellen und verdünnen Sie die Zellsuspension auf eine Endkonzentration von 10.000 Zellen pro Milliliter. Verwenden Sie eine elektronische Multipipette, um 40 bis 25 Mikroliter große Flecken Zellsuspension auf der Innenfläche des Deckels einer sterilen, nicht klebenden 10-Zentimeter-Zellkulturschale herzustellen. Drehen Sie dann den Deckel mit einer schnellen, sanften Bewegung um und legen Sie ihn auf die Zellkulturschale mit fünf Millilitern PBS.Kultivieren Sie die hängenden Tropfschalen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für 10 bis 14 Tage. Fünf Tage nach der ersten Tropfenfleckenbildung verwenden Sie einen elektronischen Spender, um 10 Mikroliter RPMI mit 10 % FCS zu jedem Tropfen hinzuzufügen. Nach 10 bis 15 Tagen ernten Sie die Sphäroide, indem Sie sie vorsichtig mit PBS vom Deckel abspülen.Sammeln Sie die Sphäroide in einer frischen, nicht klebenden Zellkulturschale. Um das dermale Gegenstück der Hautrekonstruktionen zu erzeugen, platzieren Sie acht Mikrometer porengroße Membraneinsätze in einer 24-Well-Zellkulturplatte. Für jeden Einsatz resuspendieren Sie 100.000 Fibroblasten in einer Gel-Neutralisationslösung.Mischen Sie anschließend die Fibroblastensuspension schnell mit Kollagen Typ eins im Verhältnis eins zu drei in einem Endvolumen von 500 Mikrolitern, ohne Blasen zu bilden. Verwenden Sie dann eine Pipette, um die Suspension zu jedem Einsatz hinzuzufügen. Legen Sie die Einsätze in einer sterilen Haube 30 Minuten lang bei Raumtemperatur ohne Medium, damit sich die Hautgele absetzen können.Als nächstes bedecken Sie die Gele mit dem DMEM und inkubieren über Nacht bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation über Nacht das DMEM aus den Hautgelen und dequilibrieren Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit EGM, um das epidermale Gegenstück der Hautrekonstruktionen zu erzeugen. Verwenden Sie anschließend eine Pipette, um das EGM von den Gelen zu entfernen.Dann säen Sie vorsichtig 100.000 Keratinozyten aus, die in 100 Mikrolitern EGM auf jedem Gel resuspendiert sind. Inkubieren Sie die Rekonstruktionen eineinhalb Stunden lang bei 37 Grad Celsius, damit die Keratinozyten am Hautgel haften können. Entfernen Sie mit einer Pipettenspitze vorsichtig das restliche Gel von der Einsatzwand.Als nächstes bedecken Sie jede Rekonstruktion mit 800 Mikrolitern EGM und kultivieren sie sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid. Entfernen Sie vorsichtig mit einer kleinen, breiten Pipettenspitze Gelreste von der Innenwand. Legen Sie die Einsätze am achten Tag in separate Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte.Als nächstes fügen Sie 1,2 bis 1,4 metastasierendes Melanommedium in jede Vertiefung hinzu, um nur die Basis der Hautrekonstruktion zu bedecken. Dann 10 bis 17 Tage bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid inkubieren. Geben Sie nur 1,2 bis 1,4 ml metastasierendes Melanommedium in jede Vertiefung, so dass die Hautrekonstruktion vom Boden der Vertiefung mit Medium versorgt wird, aber nicht mit Medium bedeckt ist.Um Melanom-Sphäroide in das dermale Gegenstück der Vollhautrekonstruktionen zu integrieren, verwenden Sie PBS, um die Sphäroide vorsichtig vom Deckel einer hängenden Tropfzellkulturschale abzuspülen. Für jede vollständige Hautrekonstruktion werden 10 bis 20 Sphäroide in einer sterilen, nicht klebenden Zellkulturschale gesammelt. Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um überschüssiges PBS vorsichtig zu entfernen.Als nächstes aspirieren Sie die Sphäroide in einem minimalen Volumen EGM. Übertragen Sie sie dann in das erforderliche Volumen der Gel-Neutralisationslösung, die 100.000 Fibroblasten enthält. Mischen Sie für jeden Einsatz die Sphäroidsuspension mit Kollagen Typ eins im Verhältnis eins zu drei in einem Endvolumen von 500 Mikrolitern.Generieren Sie schließlich organotypische Vollhautrekonstruktionen, wie im zuvor beschriebenen Protokoll beschrieben. Die normale menschliche Haut wird mit der Hautrekonstruktion verglichen, um die organotypische 3D-Hautrekonstruktion zu validieren. Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung der Paraffinschnitte zeigt, dass die Dermis und Epidermis der Hautrekonstruktion mit denen der normalen Haut vergleichbar sind.Normale menschliche Haut und Hautrekonstruktion werden immunhistochemisch analysiert, um die epidermale Differenzierung zu vergleichen. Die Immunfärbung gegen epidermale Stratifizierungsmarker, nämlich Keratin 14, Keratin 10 sowie Involukrin und Filagrin, deutet auf ein ähnliches Maß an Keratinabside-Differenzierung zwischen der Hautrekonstruktion und normaler Haut hin. Die Immunfärbung gegen Laminin fünf deutet darauf hin, dass die basale Lamina gebildet wird, um die epidermalen und dermalen Gegenstücke der Hautrekonstruktionen physiologisch zu verbinden, ähnlich wie bei normaler Haut.Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung des Paraffinabschnitts der Melanom-Sphäroid-Hautrekonstruktion deutet darauf hin, dass die zelluläre Verteilung von Melanom-Sphäroiden ähnlich ist wie die der nicht vaskularisierten menschlichen Melanom-Hautmetastasen in vivo. Die histologische Untersuchung zeigt das Vorhandensein einer peripheren proliferierenden Subpopulation und einer zentralen nekrotischen Subpopulation der Melanomzellen. Einmal gemeistert, könnte diese Technik in etwa 40 Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, Primärzellen von bester Qualität zu verwenden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Melanomforscher, die Reaktionsfähigkeit in vitro in einer in vivo nachahmenden Umgebung zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein menschliches organotypisches 3D-Melanom-Hautmodell erstellt.

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