Stoffwechselanalyse von Drosophila Melanogaster Schildzecken und erwachsenen Gehirn

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zur Messung von Sauerstoff-Verbrauch und extrazelluläre Übersäuerung in Drosophila Melanogaster Larven und adulten Gehirn. Eine metabolische Analyzer ist eine angepasste und optimierte Protokoll genutzt. Micro-Gewebe Fesseln waren sind ein wesentlicher Bestandteil dieses Protokolls entworfen und speziell für den Einsatz in dieser Analyse erstellt.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über den Gehirnstoffwechsel von Drosophila zu beantworten und darüber, wie sich eine übermäßige Proliferation von Gliazellen auf die metabolische Reprogrammierung auswirkt, unabhängig davon, ob die Ernährung oder das Verhalten den Stoffwechsel verändert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Fliegengehirne metabolisch als ein ganzes intaktes Gewebe analysiert werden können, wobei reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden, wenn jeweils nur ein Gehirn gemessen wird. Obwohl diese Methode Einblicke in den Stoffwechsel des Fliegengehirns geben kann, kann sie auch auf andere Gewebe und Modellsysteme wie Imaginalscheiben bzw. C.elegans angewendet werden.

Um die Mikrogewebefesseln vorzubereiten, wählen Sie aus dem Vorratsbehälter eine Mikrogewebefessel pro Gehirn aus, das gemessen wird, plus mindestens drei für die Verwendung als reine Fixierungskontrollen. Spülen Sie die Fesseln mit einem Netzkorb und einer Sechs-Well-Platte mit siebzigprozentigem Ethanol und waschen Sie sie dreimal jeweils zwei Minuten lang mit entionisiertem Wasser. Führen Sie zusätzliche Wasserwäschen durch, wenn die Fesseln immer noch einen Alkoholgeruch abgeben.

Waschen Sie die Mikrogewebe-Fesseln in Assay-Medien und lassen Sie sie in der Lösung, bis sie gebrauchsfertig sind. Um das Gehirn der Drosophila melanogaster-Larve zu sezieren, wählen Sie die Larven des späten dritten Stadiums aus einem Fläschchen mit kultivierten Organ-R-Fliegen aus. Legen Sie die Larve in die Vertiefung einer sauberen Präparierfleckplatte, die 500 Mikroliter 1x PBS enthält.

Waschen Sie anschließend die Larve, indem Sie sie in der Vertiefung vorsichtig schütteln und in eine andere saubere Vertiefung umfüllen. Legen Sie dann die Spotplatte unter das Präpariermikroskop. Fassen Sie die Larve mit einer Pinzette an ihrem Mittelteil, während Sie die Ösenhaken mit einer zweiten Pinzette greifen.

Ziehen Sie die Larve vorsichtig und gleichmäßig mit den beiden Pinzetten in entgegengesetzte Richtungen. Stellen Sie sich das Gehirn vor, das normalerweise an den Ösenhaken befestigt bleibt und an dem häufig Augenantennenscheiben befestigt sind. Verwenden Sie die Augenhaken, um das Gehirn an Ort und Stelle zu halten, und entfernen Sie vorsichtig zusätzliches Gewebe.

Trennen Sie zum Schluss die Ösenhaken vom Gehirn. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um das präparierte Gehirn in eine neue Vertiefung zu übertragen, die 1x PBS enthält. Um die präparierten Gehirne zu einer 96-Well-Stoffwechsel-Assay-Platte hinzuzufügen, fügen Sie zunächst 50 Mikroliter Assay-Medium zu allen Vertiefungen hinzu, einschließlich der Versuchs-, Kontroll-, Nur-Rückhalte- und Hintergrund-Wells.

Platzieren Sie dann vorsichtig ein Gehirn in jeder Vertiefung. Verwenden Sie unter dem Präpariermikroskop eine Mikrosonde mit gebogener Nadel, um das Gehirn auf den Boden der Vertiefung zu drücken. Positionieren Sie das Gehirn vorsichtig mit der Sonde in der Mitte der drei erhabenen Kugeln.

Um der 96-Well-Stoffwechsel-Assay-Platte eine Mikrogewebefixierung hinzuzufügen, legen Sie sie zuerst auf den Rand. Richten Sie es unter einem Mikroskop so aus, dass der Kunststoffring nach unten und das Netz nach oben zeigt. Nehmen Sie anschließend die Platte aus dem Mikroskop.

Fassen Sie die Fessel mit der Pinzette auf beiden Seiten an und lassen Sie sie vorsichtig in die Vertiefung fallen. Verwenden Sie eine Mikrosonde mit gebogener Nadel, um die Rückhaltevorrichtung in die Vertiefung zu drücken. Die Mikrogewebefesseln müssen in jeder Vertiefung richtig über dem zentrierten Gehirn positioniert werden, damit diese Technik aussagekräftige Ergebnisse liefert.

Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob das präparierte Gehirn durch die Gewebefessel gesehen werden kann und dass es in der Vertiefung zentriert ist, und wiederholen Sie den Vorgang für alle Vertiefungen, die im Assay verwendet werden. Geben Sie vorsichtig 130 Mikroliter Assay-Medium in jede der Versuchs-, Kontroll- und Nur-Rückhalte-Wells. Vergewissern Sie sich, dass sich das Gehirn und die Mikrogewebefesseln beim Hinzufügen des Mediums nicht bewegt haben.

Geben Sie dann 180 Mikroliter Assay-Medium in die vier Eck-Wells, um sie als Hintergrundkontrolle zu verwenden. Entfernen Sie bei diesem Verfahren die Gebrauchsplatte und geben Sie die Zellplatte ohne Deckel in der gleichen Ausrichtung in den Stoffwechselanalysator. Wählen Sie "Wägezellenplatte", damit das Gerät die Zellplatte aufnimmt, das Fach schließt und dann mit dem Assay beginnt.

Wenn der Assay abgeschlossen ist, entfernen Sie die ausgestoßene Zellplatte und die Patrone. Überprüfen Sie mit einem Präpariermikroskop, ob das Gehirn und die Mikrogewebefesseln nach Abschluss des Assays noch richtig in der Vertiefung positioniert sind, und schließen Sie alle Vertiefungen mit Anomalien von der Analyse aus. Wenn die optimierten Bedingungen befolgt werden, führen die Assays mit dem Larven- und dem adulten Gehirn zu OCR-Messwerten von leicht über 150 Pikomol pro Minute zum stabilisierten sechsten Zeitpunkt, etwa 25 Minuten nach Beginn des Assays.

Dieser Tarif wird für mindestens 30 Minuten und bis zu zwei Stunden beibehalten. Die ECAR ist zum sechsten Zeitpunkt in erwachsenen Gehirnen etwas niedriger als in Larvengehirnen und wird mindestens 30 Minuten lang aufrechterhalten. Dieser Befund entspricht einer Zunahme der Glykolyse während der Larvenstadien zur Unterstützung des Wachstums

Eine Injektion mit einem mitochondrialen Inhibitor wie Oligomycin senkt die OCR-Messwerte, um die ATP-abhängige Atmung aufzudecken, und eine weitere Behandlung mit Rotenon und Antimycin A senkt die OCR, um einen nicht-mitochondrialen Sauerstoffverbrauch aufzudecken. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, das Gehirn zu zentrieren und sicherzustellen, dass die Mikrogewebefessel an Ort und Stelle ist, bevor der Assay und während der Analyse durchgeführt werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie quantitative PCR und Western-Blot-Analyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen darüber zu beantworten, wie die Genexpression zum beobachteten metabolischen Phänotyp beiträgt.