Name: Stoffwechselanalyse von Drosophila Melanogaster Schildzecken und erwachsenen Gehirn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Lernen Sie die Stoffwechselanalyse von Drosophila melanogaster Gehirnen mit einem metabolischen Analyzer. Diese Methode misst Sauerstoffverbrauch und extrazelluläre Azidifizierung in intakten Geweben.

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Bestände aus Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018637) gewonnen wurden in dieser Studie verwendet. Die Forschung berichtet in dieser Publikation wurde von der institutionellen Development Award (IDeA)-Netzwerk für biomedizinische Forschung Spitzenleistungen aus dem National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Grant-Nummer unterstützt. P20GM103430, und durch die Rhode Island Foundation. Autoren danken J. Waters und P. Snodgrass-Gürtel für ihre Unterstützung bei der Entwicklung dieses Protokolls.

1. Test Vorbereitung (Tag 1)
<ol><li>Legen Sie den metabolischen Analyzer (Table of Materials) im Inkubator oder einem temperierten Raum setzen auf 11 ° C. Hinweis: Diese Temperatur ist ideal für Messungen bei 25 ° C, da es für ~ 14 ° C-Temperatur-Schwankungen, die auftritt, während der Ausführung des Tests ermöglicht. Dies wird durch die Wärmeentwicklung durch das Instrument während des Laufs verursacht.</li>
	<li>Öffnen Sie die entsprechende Software auf dem Computer, an den metabolischen Analysator angeschlossen. Klicken Sie auf die numerische Temperatur in der unteren linken Seite des Bildschirms. Klicken Sie in dem neuen Fenster, das geöffnet wird auf das Kontrollkästchen neben "Heizung auf" Befehl und sicherzustellen Sie, dass wird ein Häkchen angezeigt. Stellen Sie die Temperatur auf 25 ° C und passen Sie den Toleranzbereich bis 0,2 ° C mithilfe der Pfeile. Hinweis: Mehrere Stunden sind erforderlich, um stabile Temperaturen zu erreichen.</li>
	<li>Öffnen Sie den Container Patrone (Table of Materials) und entfernen Sie die Patrone aus der Dienstprogramm-Platte ohne Berührung der Sonden. Hinweis: Die Dienstprogramm Platte dient während der Kalibrierung der Patrone und wird nicht verwendet, während die metabolische Test ausgeführt wird.</li>
	<li>Das Dienstprogramm Platte und Platz auf der Patrone die Patrone wieder am Anfang der Dienstprogramm-Platte des Sensors zu rehydrieren Sonden fügen Sie 200 μL der Kalibrator Lösung (Table of Materials hinzu). Berühren Sie die Sonden nicht und vor Licht zu schützen.</li>
	<li>Verschließen Sie die Patrone mit dem Paraffin-Film.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Patrone über Nacht bei 25 ° C.</li>
</ol>(2) Assay Media Vorbereitung (Tag 2)
<ol><li>Der Assay-Medium 10 mM Glukose und 10 mM Natrium Pyruvat hinzufügen.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Medium bei 25 ° C, bis die Flüssigkeit auf diese Temperatur equilibriert hat.</li>
	<li>Anpassen des pH-Werts 7,4 mit pH-Meter.</li>
</ol>3. Einrichtung der Software für die Stoffwechselanalyse von Drosophila Melanogaster Gehirne (Tag2)
<ol><li>Richten Sie die metabolische Software auf der metabolischen Analyzer in Schritt 1.2 verwendet.</li>
	<li>Wählen Sie "Vorlage" auf dem Startbildschirm Software.</li>
	<li>Doppelklicken Sie auf "Leer", um ein neues Test-Design zu starten.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche "Platte Karte" in der oberen Symbolleiste, die Gestaltung der Zellplatte Assay anzuzeigen. Hinweis: Der Zellplatte Assay enthält die Gehirn-Muster und wird vor Beginn des metabolischen Tests laufen mit der Patrone gekoppelt werden.</li>
	<li>
Klicken Sie auf die hinzufügen Gruppen Taste 3 X.
	<ol>
<li>Doppelklicken Sie auf die Bezeichnung "Gruppe 1" und benennen Sie sie in "Experimental". Hinweis: Diese Gruppe enthält Gehirn einer Fliege und einer Rückhalteeinrichtung für Mikro-Gewebe mit Medikamenten behandelt.</li>
		<li>Doppelklicken Sie auf die Bezeichnung "Gruppe 2" und benennen Sie ihn zu "Kontrollieren". Hinweis: Diese Gruppe enthält Gehirn einer Fliege und ein Micro-Gewebe Zurückhaltung mit keine medikamentöse Behandlung.</li>
		<li>Doppelklicken Sie auf die "Gruppe 3" beschriften und benennen Sie sie um "Zurückhaltung nur". Hinweis: Diese Gruppe enthält eine Mikro-Gewebe Zurückhaltung ohne Gehirne oder medikamentöse Behandlung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Jeder Gruppe wo Proben in der Zellplatte gebracht werden sollen anhand weisen Sie der Brunnen zu.
	<ol>
<li>Klicken Sie auf das Etikett "Experimental" und markieren Sie dann Brunnen B2 - B8 auf der Platte-Karte.</li>
		<li>Klicken Sie auf "Control" und markieren Sie dann Brunnen C2-C8 auf der Platte-Karte.</li>
		<li>Klicken Sie auf die "Zurückhaltung" nur" Label und dann Höhepunkt Wells D2-D8 auf der Platte-Karte.</li>
		<li>Überprüfen Sie, dass alle vier Ecken (A1, A12, H1 und H12) als Hintergrund bestimmt sind. Hinweis: Brunnen entlang des Umfangs der Platte werden keine Kante von Nebenwirkungen zu verringern. Dies ist eine Standard-Einstellung in der Software.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Klicken Sie auf die Schaltfläche "Protokoll" in der oberen Symbolleiste, um das Protokoll einzurichten.
	<ol>
<li>Klicken Sie auf "Edit Messung Details" im Messfeld Grundlinie.</li>
		<li>Stellen Sie die Zeit, dass der metabolische Analyzer im Gehirn Messen werden, indem die basalen Maßnahme Zykluszeit zu "03:00", indem Sie auf die nach-oben und unten Pfeile.</li>
		<li>Stellen Sie die Zeit, die der metabolische Analyzer zwischen Gehirn Messungen wartet durch Ändern der basalen warten auf "0:00" durch Klicken auf die nach-oben und unten Pfeile.</li>
		<li>Stellen Sie die Zeit, die der metabolische Analyzer den Mediamix wird vor der Messung des Gehirns durch eine Änderung der basalen mischen Zykluszeit "01:00", indem Sie auf die nach-oben und unten Pfeile.</li>
		<li>Passen Sie die Gesamtzahl der basalen Zyklen umfasst die Maßnahme, warten und mischzyklen, zu "7" durch Klicken auf die nach-oben und unten Pfeile. Hinweis: Stabile Sauerstoff-Verbrauchsrate Messungen sind nach ~ 25 min von Anfang des Assays erzielt.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche "Hinzufügen Injektion", befindet sich in der oberen linken Seitenleiste.</li>
		<li>Klicken Sie auf"Injektion" und ändern Sie ihn auf "Oligomycin".</li>
		<li>Passen Sie die Injektion Maß, warten und Mischung Mal jenen für die basale entsprechen.</li>
		<li>Passen Sie die Gesamtzahl der Injektion Zyklen bis "6", indem Sie auf die nach-oben und unten Pfeile.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.7.6 - 3.7.8 aber ändern Sie die Beschriftung auf "Rot/AA" und einstellen Sie die Gesamtzahl der Injektion Zyklen bis 7, indem Sie auf die nach-oben und unten Pfeile.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche "Test Run" in der oberen Symbolleiste.</li>
		<li>"Save" Assays und Einrichten der Assay-Patrone (Table of Materials).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Vorbereitung der Patrone für die Kalibrierung (Tag 2)
<ol><li>
Entfernen Sie die Patrone aus dem Inkubator 25 ° C und den Deckel abheben.
	<ol>
<li>Die kleine obere linke kreisförmige Injektion Port, Port A, in der Kartusche für alle entsprechenden experimentellen Brunnen auf der Zellplatte 20 μL von 100 μM Oligomycin hinzu und Anschluss A in alle anderen Brunnen, einschließlich die Kontrolle und Hintergrund Brunnen fügen Sie 20 μl Assays Medien hinzu. Hinweis: Die Patrone enthält 4 Ports (A-D) für jede der 96 Wells, der Zellplatte entspricht, was die Proben enthalten wird. Dieser Schritt wird vor dem Hinzufügen der Proben durchgeführt. Hinzufügen von 20 μL von 100 μM Oligomycin Ergebnisse in einer abschließenden Oligomycin-Konzentration von 10 μM in der Zellplatte, gut, sobald das Medikament vom metabolischen Analyzer eingespritzt wird. Oligomycin ist ein Hemmstoff der ATP-Synthase. Der Ergebniswert der Sauerstoff-Verbrauch wird der Betrag der ATP-linked Atmung im Gehirn dar. Um die Medikamente richtig in die angegebenen Brunnen zu injizieren, müssen alle Ports von den gleichen Brief mit dem gleichen Volumen der Flüssigkeit, auch bei Nichtgebrauch gefüllt werden.</li>
		<li>Die kleinen oberen rechts kreisförmige Hafen 22 μl 50 μM Rotenon/Antimycin A hinzu, Anschluss B, in der Kartusche für alle entsprechenden experimentellen Brunnen auf der Zellplatte, und Port B für alle anderen Brunnen, einschließlich die Kontrolle und Hintergrund Brunnen 22 μl Assays Medien hinzufügen. Hinweis: Dadurch wird eine endgültige Rotenon/Antimycin eine Konzentration von 5 μM in der Zellplatte gut, sobald das Medikament vom metabolischen Analyzer eingespritzt wird. Rotenon und Antimycin A sind Inhibitoren der Elektronentransport-Kette komplexe I und III, beziehungsweise. Der Ergebniswert der Sauerstoff-Verbrauch wird nicht mitochondriale Atmung im Gehirn widerspiegeln.</li>
		<li>Klicken Sie auf "Start ausführen" um die geladene Patrone mit dem Dienstprogramm Teller in den metabolischen Analysator mit gut A1 in der oberen linken Ecke positioniert, wenn das Instrument mit der Platte Lader erstreckt sich von der rechten Seite der Maschine vor Ort.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie "I 'm Ready" in der Software die Gleichgewichtherstellung und Kalibrierung der Patrone vor Beginn des metabolischen Tests mit der Zellplatte mit den Proben beginnen. Hinweis: Das Programm fragt, speichern Sie die Datei und dann beginnen äquilibrierung und kalibrieren. Diese Schritte können bis zu 1 h Schritte 5 – 8 während der Gleichgewichtherstellung und Kalibrierung durchgeführt werden.</li>
</ol>5. Vorbereitung der Micro-Gewebe Beschränkungen (Tag 2)
<ol><li>Wählen Sie 1 Micro-Gewebe Zurückhaltung pro Gehirn, der gemessen wird, plus mindestens 3 für den Einsatz als Zurückhaltung nur Steuerelemente aus dem Vorratsbehälter (enthält 70 % Ethanol).</li>
	<li>Die Fesseln mit frischen 70 % Ethanol spülen und waschen Sie sie mit entionisiertem Wasser 3 X für jeweils 2 min mit einem Netz Korb und 6-Well-Platte (Table of Materials). Fügen Sie zusätzliche Wasser wäscht, wenn die Fesseln noch einen Alkohol-Geruch abgeben.</li>
	<li>Waschen Sie die Micro-Gewebe-Beschränkungen in Assay Medien und in dieser Lösung belassen Sie, bis sie betriebsbereit sind.</li>
</ol>(6) sezieren von Drosophila Melanogaster Larven Gehirne (Tag2)
<ol><li>Wählen Sie spät (wandernden) dritte Instar Larven von einem Fläschchen von kultivierten Oregon-R fliegen mit hoher Präzision, Stil 5 (0,10 x 0,06 mm2) Pinzette.</li>
	<li>Legen Sie die Larve in den Brunnen einer sauberen sezierenden spot Platte (Table of Materials) mit 500 μl 1 X PBS. Hinweis: Eine spot Platte ist eine Glasplatte mit Depressionen, verwendet, um kleine Geweben und Organismen zu sezieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Larve durch Schütteln es sanft in den Brunnen mit einer Pinzette.</li>
	<li>Verschieben Sie die Larve zum sauberen Brunnen, einer Stelle Platte mit 500 μl 1 X PBS.</li>
	<li>Platzieren Sie die vor Ort Platte unter dem sezierenden Mikroskop.</li>
	<li>Halten Sie die Larve in den Mittelteil mit einer Pinzette, während die Auge-Haken mit einem zweiten Pinzette greifen.</li>
	<li>Ziehen Sie sanft und gleichmäßig die Larve in entgegengesetzte Richtungen mit den zwei Sätzen von Pinzette.</li>
	<li>Das Gehirn, das in der Regel Aufenthalte an den Augen Haken und werden häufig haben Auge riechzentrum Scheiben befestigt zu visualisieren.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig zusätzliche Gewebe aus dem Gehirn, mit dem Auge Haken um das Gehirn zu halten. Schließlich trennen Sie die Auge-Haken aus dem Gehirn.</li>
	<li>Benutzen Sie eine Pinzette, um sezierten Gehirns zu einem neuen Brunnen auf einem Fleck Teller mit 1 X PBS zu bewegen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 6.1 – 6.10 bis 14 Gehirne seziert werden. Hinweis: Die Gesamtzeit von Anfang an die Zerlegung der Assay-Run sollte 30 min nicht überschreiten.</li>
</ol>7. Ergänzung der seziert Gehirne zu 96-Well metabolische Assay Zellplatte (Tag 2)
<ol><li>Fügen Sie 50 μL der Assay-Medien in die Vertiefungen der Platte 96-Well metabolische Assay (Table of Materials) im Experiment, einschließlich der experimentellen, Kontrolle, nur Zurückhaltung, und Hintergrund Brunnen verwendet wird.</li>
	<li>Legen Sie vorsichtig ein Gehirn in jede Vertiefung von A2-A8 und B2-B8 der Zellplatte, mit einer Pinzette, einem Spatel oder einer Pipette. Hinweis: Dies kann von dem sezierenden Mikroskop erfolgen.</li>
	<li>Verwenden Sie unter dem Mikroskop Dissektion eine verbogene Nadel Mikro-Sonde, um die Köpfe auf den Boden des Brunnens zu versenken.</li>
	<li>Positionieren Sie sanft das Gehirn in der Mitte der drei erhöhten Kugeln mit der Sonde.</li>
</ol>8. Ergänzung der Micro-Gewebe Beschränkungen für 96-Well metabolische Assay Zellplatte (Tag 2)
<ol><li>Mit einer Pinzette, legen Sie die Micro-Gewebe Zurückhaltung am Rande der Assay-Platte gut, und verwenden Sie das Mikroskop um zu kontrollieren, dass es mit der Kunststoff-Ring nach unten und das Netz oben ausgerichtet ist.</li>
	<li>Entfernen Sie die Platte unter die Lupe und Pinzette zu greifen die Zurückhaltung auf beiden Seiten und legen Sie es sanft in den Brunnen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine verbogene Nadel Mikro-Sonde, um die Zurückhaltung in den Brunnen nach unten zu drücken.</li>
	<li>Unter dem Mikroskop stellen Sie sicher, dass das Gehirn durch das Gewebe Zurückhaltung gesehen werden kann und dass es in der gut zentriert ist.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 8.1-8.4 für die Brunnen, die in der Probe werden – A2-A8, B2-B8 und C2-C8.</li>
	<li>Fügen Sie sorgfältig 130 μL der Assay-Medien zu jedem der experimentellen, Kontrolle und Zurückhaltung nur Brunnen.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass das Gehirn und die Micro-Gewebe Fesseln nicht, beim Hinzufügen von Medien bewegt haben durch unter dem Mikroskop zu visualisieren.</li>
	<li>Die vier Ecken Vertiefungen für den Einsatz als Hintergrundkontrolle 180 μL der Assay Medien hinzufügen.</li>
</ol>9. Zusatz der Zellplatte, die metabolische Analyzer und dem Beginn des Assays (Tag 2)
<ol><li>Überprüfen Sie, ob die Gleichgewichtherstellung und Kalibrierung abgeschlossen sind, durch das Warten der Software aufgefordert, für die Zelle Platte mit der Probe.</li>
	<li>Wählen Sie "Open Tray" und warten Sie, bis das Instrument, die Dienstprogramm Platte auszuwerfen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Dienstprogramm und fügen Sie der Zellplatte, ohne Deckel hinzu, in der gleichen Ausrichtung.</li>
	<li>Wählen Sie "Load Cell Platte" für das Instrument in der Zellplatte zu nehmen und schließen Sie das Fach, und dann beginnt des Tests.</li>
	<li>Anzeigen der Messwerte in Echtzeit mit Fehlerbalken läuft die Software auf dem Computer.</li>
	<li>Die ausgeworfene Zellplatte und Patrone zu entfernen, wenn der Test abgeschlossen ist. Bemerkung: Gepaarte Patronen und Zellplatten kann wiederverwendet 5 X.</li>
</ol>10. nach der Messung Analyse (Tag 2)
<ol><li>Sezierenden Mikroskop verwenden, um sicherzustellen, dass die Gehirne und die Mikro-Gewebe-Beschränkungen sind nach wie vor richtig positioniert im Brunnen nachdem der Test abgeschlossen ist. Jeder Brunnen mit Anomalien aus der Analyse ausgeschlossen.</li>
	<li>Exportieren der Sauerstoff Verbrauch Rate (OCR) und die extrazelluläre Übersäuerung Rate (ECAR) Daten zur weiteren Analyse.</li>
</ol>

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</ol>

M. Tipping hält eine vorläufige Patent für die Micro-Gewebe-Beschränkungen in diesem Protokoll17beschrieben.

Hier ist eine neuartige Methode zur Stoffwechselanalyse von D. Melanogaster Larven und adulten Gehirn ex Vivo beschrieben. Basalen Bedingungen hervorgehen, Sauerstoffverbrauch und extrazelluläre Übersäuerung Preise wie metabolisch aktiv das Gehirn und kann bestimmen, ob eine Gewebe abhängiger von mitochondrialen versus glykolytischen Atmung geworden ist, bzw.11.
Behandlung von den Gehirnen mit Inhibitoren oder Medikamente kann weitere Informationen über den metabolischen Zustand des Gewebes liefern. Metabolische Substrate können auch hinzugefügt werden, um Abhängigkeiten von bestimmten Metaboliten, wie Glucose für den Warburg-Effekt22 oder Glutamin zu untersuchen, Glutaminolysis23testen bestimmen – beide gemeinsam im Stoffwechsel umprogrammieren. Für Langzeitstudien Larven oder fliegen könnte auch Drogen anstatt Injektion Häfen gefüttert werden, und Gehirn könnte geprüft werden, in Abständen oder auf den Endpunkt, abhängig von den experimentellen Design. Diese Methode kann für zahlreiche Anwendungen optimiert werden.
Diese Methode wurde optimiert, um Köpfe aber kann verwendet werden, um andere Larven18 und adulten Geweben zu analysieren. Darüber hinaus können andere kleine Modellsysteme diese Methode, um ganze Organismen18 oder Geweben Messen nutzen. Die einzige Einschränkung zur Optimierung dieser Methode für andere Systeme ist die Größe von dem Organ, Gewebe oder Organismus. Die Kammer erstellt von Micro-Gewebe Zurückhaltung ist die Größe Barriere den Test ausgeführt. Wenn die metabolische Ausgabe ist zu niedrig für das Gehirn oder Gewebe getestet, und die Größe der Stichprobe keine Einschränkung ist, Bündelung von Proben lässt sich die Test-Messungen und die Empfindlichkeit zu erhöhen. Änderung dieses Protokolls für andere Anwendungen sollten nur kleinere Optimierungen, einschließlich (1) wählen die geeignete Maßnahme erfordern und mischen Taktzahlen und Timing und (2) Bestimmung wirksame Behandlung Konzentrationen für das Gewebe. Die Maßnahme und Mischzeiten wurden durch die Überwachung Sauerstoffkonzentration gemessen vom metabolischen Analyzer bei jedem Zyklus bestimmt. Dies kann angezeigt werden, indem Sie O2 in die Y2-Achse-Schaltfläche im Fenster "Übersicht" auswählen, nach der abgeschlossen ist. Bei jedem Zyklus sollte ein Drop-in-Sauerstoff-Konzentration spiegelt das Gewebe Sauerstoffverbrauch während der gemessenen Zeit, gefolgt von einer Rückkehr zu der anfänglichen Sauerstoffkonzentration während des mischenden Zyklus. Die Maßnahme und Mix-Zeiten sollte getestet werden, bis dieses Muster beobachtet wird. Mit dieser Methode wurden andere Insekten Gehirne untersucht. Diese Gehirne waren größer als die Fliege Gehirne verwendet hier aber immer noch fit in der Kammer durch die Zurückhaltung der Gewebe erzeugt. Die OCR-Lesungen aus diese Gehirne waren so hoch wie 400 Pmol/min (Daten nicht gezeigt). Die Ergebnisse aus diesen Studien sowie OCR-Preise, die mit anderen Studien Messen ganz-Fly Sauerstoff Verbrauch18,24, ausrichten legen nahe, dass die D. Melanogaster Gehirne nicht Sauerstoff begrenzt waren. Für D. Melanogaster Gehirn und Gewebe von anderen Organismen erfordert die Anwendung dieser Methode besondere Aufmerksamkeit auf vier wichtige Schritte.
Um reproduzierbare und biologisch relevante Messungen erfolgreich zu erreichen, gibt es wichtige Schritte des Protokolls, die befolgt werden müssen. Erstens ist die Verwendung einer Rückhalteeinrichtung für Mikro-Gewebe für diese Methode erforderlich. Die Herstellung von diese Fesseln mit den Spezifikationen und Materialien aufgeführt ist unerlässlich. Die Materialien wurden aufgrund ihrer inerten chemischen Zusammensetzung und ihrer Fähigkeit, die richtigen Medien Austausch während der mischenden Schritte ohne die Bildung von Luftblasen zu ermöglichen. Zweitens ist eine rechtzeitige Dissektion und Platte Vorbereitung erforderlich, um den Stoffwechsel des Gewebes zu maximieren. Kurze Dissektion Zeiten sollte das Gehirn nicht wesentlich beeinträchtigen. Andere Studien haben gezeigt, dass fliegen Gehirne für Stunden bis Tage lebendig gehalten werden können, nach Dissektion bei sachgemäßer Lagerung in einer Perfusion Kammer25. Jedoch werden wie in Abbildung 3 b und 3Dgesehen wenn Gehirne im Assay Medien für längere Zeit vor der Probe sitzen gelassen werden, das Sauerstoff-Verbrauch verringert. Während der Test unterziehen Proben einen Mischpulten Schritt bei jedem Zyklus. Diese Vermischung nicht nur aids mit Injektionen von chemischen Verbindungen, sondern dient auch zum Umwälzen der Medien und liefern Sauerstoff. Die Köpfe sind in der Lage, metabolisch aktiv über einen längeren Zeitraum während dieser Maßnahme-Mix-Zyklen als sie in den Medien auf die Benchtop Inkubation werden würde zu bleiben. Daher sollte die Zerlegung des larvalen Gehirne beherrscht werden, vor Beginn dieser Assay einrichten. Beim Aufbau dieser Assay analysieren eine kleine Anzahl von Genotypen in einer Zeit, zur Minimierung der Anzahl der Köpfe benötigt und Brunnen eingesetzt. Dies verhindert Verzögerungen zwischen dem sezieren und die Test-Messungen. Drittens ist eine stabile Temperatur erforderlich, um die Stoffwechselrate in physiologisch relevanten Bedingungen zu analysieren. Erhöhte Assay Temperaturen können dazu führen, dass Absterben von Gewebe, beobachtet von niedriger Sauerstoff-Verbrauch (Abbildung 3). Wenn fliegen bei unterschiedlichen Temperaturen um zu Versuchszwecken aufgezogen werden, sollten die Messungen auch bei dieser Temperatur durchgeführt werden. Während Sezierungen höchstwahrscheinlich bei Raumtemperatur, ausgeführt werden, wenn der Test bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt wird, sollte die vergoldeten und zurückhaltend Gehirne bei der erforderlichen Temperatur 15 min. vor dem Ausführen des Tests inkubiert werden. Zu guter Letzt Beobachtung der Brunnen nach dem Test ist wichtig, festzustellen, ob die Messungen Positionierung Gewebe betroffen werden. Gelegentlich werden auch einen Ausreißer, der, nachdem er die Platte unter dem sezierenden Mikroskop beobachtet aus der Datenanalyse durch entweder Verlust von Gewebe oder kariesherden, beseitigt werden kann, wo das Gehirn hat schlüpfte aus der Mitte des Brunnens und steckt unter dem Polymer-Ring der Rückhalteeinrichtung. Gewebe kann verloren gehen, wenn die Zurückhaltung nicht richtig, zum Brunnen gesichert war und wurde während der mischenden Zyklen gestört. Während keines dieser Ereignisse oft passiert, wenn sie nicht von der Analyse ausgeschlossen sind, werden sie die Rate Werte erheblich senken.
Die Messung des gesamten Gewebe metabolische Flux durch Überwachung Sauerstoffverbrauch und extrazelluläre Übersäuerung bietet eine biologisch relevante Methode für das Verständnis, wie Stoffwechsel durch die genetische Landschaft oder anderen Versuchsbedingungen geändert wird. Diese Methode ist empfindlich genug, um metabolische Veränderungen in einem einzigen erkennen D. Melanogaster Gehirn, das mit Stop-Flow respirometrie oder indirekte Kalorimetrie nicht möglich ist. Es ist auch technisch weniger schwierig als die Verwendung einer Clark-Elektrode, um Sauerstoff-Verbrauch zu messen. Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist die Möglichkeit, ein ganzes Gehirn pro Bohrloch zu analysieren. Die 96-Well-Format ermöglicht empfindlicher Lesungen, und somit mehr als ein Genotyp kann zu einem Zeitpunkt aufgrund der geringeren Anzahl von Proben pro Assay geprüft werden. Während Messen Stoffwechsel im Gewebe nach wie vor eine Herausforderung ist und sorgfältig erfordert aufgezogen und synchronisierte Tiere, dieses Protokoll beschreibt eine schnelle und relativ einfache Methode, und hat das Potenzial, zahlreiche metabolische Empfindlichkeiten in D. analysieren Melanogaster Larven und adulten Gehirn.

Metabolische Umprogrammierung wurde in vielen neurologischen Krankheiten, einschließlich Glioblastoma Multiforme (GBM), Chorea Huntington und großen Depressive Störung (MDD)1,2,3identifiziert. Stoffwechsel wird im Mittelpunkt der therapeutischen Strategien, haben Werkzeuge für metabolische Grundlagenforschung fortgeschritten. Jedoch wurden die meisten dieser Methoden entwickelt, Zelllinien und Primärzellen zu studieren oder größeren Gewebe nach Fixierung oder -Einfrieren zu analysieren. Einige Ansätze haben sich verlassen-Kits zu spezifische Metaboliten vereinfachend zu messen, während andere kostspielige und komplexe Analysen nutzen Chromatographie in Kombination mit Massenspektrometrie4 für das gleiche Ziel genutzt haben. Um die größere metabolische Landschaft zu verstehen, entstand metabolic profiling,5,6 und metabolische Flussmittel Analyse (MFA)7 um die groß angelegte Proteomic und genomische Studien ergänzen. Profilerstellung bietet eine quantitative Darstellung der Metaboliten in einer Zelle oder eines Gewebes an einem Punkt in der Zeit, während MFA hierauf dadurch, dass die Verfolgung von beschrifteten Metaboliten im Laufe der Zeit erweitert. Letztere waren nützlich bei der Aufdeckung, wie Energien anders genutzt werden, in einer Zelle oder eines Gewebes bei einer Krankheit Stand8. Diese Methoden beinhalten jedoch nicht die Messung von insgesamt metabolische Rate.
Um der allgemeinen Stoffwechsellage kleine Modellsysteme zu verhören, traditionelle Methoden, z. B. Clark-Elektrode9 und indirekte Kalorimetrie10, zur Messung der Sauerstoffverbrauch oder konfiguriert für Stop Fluss respirometrie, Messen Sie Sauerstoff und Kohlendioxid-Konzentration, bzw.. Diese Techniken haben genau gleichzeitig Einblick in das Auslesen der metabolischen Umprogrammierung auf der Ebene des Organismus, Einschränkungen. Die Verwendung der Clark-Elektrode kann technisch anspruchsvoll und eignet sich nicht für Hochdurchsatz-Studien. Stop-Fluss-Respirometer funktionieren nicht mit der Empfindlichkeit erforderlich, um Zellen oder Gewebe zu bestimmen. Vor einigen Jahren wurde speziell für diese kleineren Anwendungen11neuer Technologie entwickelt. Diese Instrumente wurden ursprünglich entwickelt, um den Sauerstoffverbrauch und die extrazelluläre Übersäuerung von Zelllinien und Primärzellen in einem 24 oder 96-Well-Format messen. Die Einfachheit des Set-up und Datenausgabe etabliert diese Methode als eine Alternative zu den traditionellen Ansätzen. Diese Methodik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für Zellen, und die jüngsten Fortschritte konnten für die Messung von Gewebe Schläge12,13,14. Jedoch lassen sich die Methoden in diesen Tests nicht zur Messung von ganzen Organen von kleinen Modellsystemen.
Die Stoffwechselanalyse Krankheitsmodelle beinhaltet häufig die Interaktion zwischen den Zellen spezialisierte Funktion, die ihren Wohnsitz innerhalb des gleichen Gewebes. Zum Beispiel produzieren Gliazellen Metaboliten von Neuronen genutzt. Diese metabolischen Wechselwirkungen sind erforderlich für die neuronale überleben15. Kleines Modellsystemen sind vorteilhaft für die Untersuchung von Fragen wie diese. Studien zur Messung des Stoffwechsels eines ganzen Organs, mit einer Vielzahl von Zelltypen, fügt das Verständnis von Energie Auslastung in Vivo. Becker Et Al. berichtete kürzlich, eine Methode zur Messung des Sauerstoffverbrauchs im ganzen fliegen Köpfe16. Durch die Bündelung vieler Köpfe zusammen in einen Brunnen von einer 24-Well Zellplatte, waren Sauerstoff Verbrauch Körperfettanteil mit einer metabolischen Analyzer. Während das funktioniert gut für Köpfe, die leicht vom Körper getrennt sind, ist es viel schwieriger für Organe wie Larven Gehirne zu verwenden, da eine große Menge für diese Methode zerlegt werden muss. Daher wurde eine Methode unter Verwendung einer 96-Well Zellplatte, die erhöht die Empfindlichkeit der Sauerstoffverbrauch und extrazelluläre Übersäuerung Lesungen entwickelt, um eine einzelne ganze Larven Gehirn assay.
Der metabolische Analyzer in dieser Studie verwendeten erfordert die Probe wird gemessen, um an der Unterseite des Brunnens eine 96-Well-Platte Zelle bleiben. Für Zellen und Gewebe relativ flach ist das keine Herausforderung; Allerdings ist es für D. Melanogaster Larven und adulten Gehirn, nicht mit traditionellen Teller Beschichtung Protokolle möglich. Die dreidimensionale Kugelform der Gehirne haften nicht zuverlässig an der Plattenoberfläche, und diejenigen, die tun oft beim Versuch, sie richtig in den Brunnen Platz beschädigt sind. Ein wichtiger Bestandteil dieses neue Protokoll ist das Design und die Entwicklung von Mikro-Gewebe Fesseln17 , die eine kleine Kammer für das Gehirn in aufzuhalten, ohne zu stören den Stoffwechsel Messungen liefern. Die Kammer erzeugt ist ca. 0,016 in Höhe und bietet genügend Platz um viele D. Melanogaster Gehirn leicht zu halten. Die Fesseln bestehen aus Nylon-Mesh mit einem inerten Polymer-Ring verbunden und wird weiter diskutiert werden in den Vertreter Ergebnisse. Mit diesen Beschränkungen minimiert den Zeitaufwand für seziert Gehirne für die metabolische Messung vorbereiten. Optimierung des Messvorgangs generiert stetig und reproduzierbare Sauerstoffverbrauch und extrazelluläre Übersäuerung Preise nach sechs Messzyklen (von 25 min). Die Köpfe bleiben metabolisch aktiv unter diesen Bedingungen für ein Minimum von 2 h, die Injektionen von Therapeutika, Inhibitoren oder andere Behandlungen über die metabolische Analyzer Patrone Medikament Lieferung Ports ermöglicht. Dieses Protokoll kann auch für andere Gewebe und kleines Modell Systeme18leicht angepasst werden.
Die nachgenannten Protokoll beschreibt den Sauerstoffverbrauch in einem ganzen Drosophila Larven Gehirn wenn herausgefordert mit mitochondrialer Stress test. Um das Gehirn zu unterstreichen, wird Oligomycin hinzugefügt, um die ATP-Synthase-19zu hemmen. Die Abnahme der Sauerstoff-Verbrauch von basalen Lesungen zeigt ein Maß für die Menge von ATP je Atmung im Gehirn. Weitere Rückgänge bei den Sauerstoffverbrauch nach Behandlungen mit Rotenon20 und Antimycin A21, Inhibitoren der Elektronentransport-Kette-komplexe I und III, bzw. Geben Sie die Höhe des nicht-mitochondriale Sauerstoff-Verbrauch in der Gehirn. Dieser Test ist ein Beispiel dafür, wie mitochondriale Atmung im Gehirn einer Fliege verglichen werden könnte und wie kann dieses Protokoll verwendet werden, um den Stoffwechsel in unterschiedlichen Genotypen zu vergleichen. Dieses Protokoll kann einfach basale Sauerstoffverbrauch und extrazelluläre Übersäuerung Preise, sowie aufwändigere Studien untersuchen bestimmte energetische Nutzung oder Substrat Auslastung Hypothesen zu gestalten Messen angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>Assay-Medium</td><td>Agilent</td><td>102365-100</td><td></td></tr><tr><td>Calibrant solution</td><td>Agilent</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DLW354240</td><td></td></tr><tr><td>delrin</td><td>Grainger</td><td>2XMK6</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Schneider Media</td><td>Thermo Fisher</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Dumont High Precision Pinzette (Stil 5)</td><td>Ted Pella</td><td>5622</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 409</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mitostress Bausatz&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td>Oligomycin, Rotenon und Antimycin A enthalten</td></tr><tr><td>Netwell-Einsätze (6-Well)</td><td>VWR</td><td>29442-136</td><td></td></tr><tr><td>Nylonnetz</td><td>Komponentenversorgung</td><td>U-CMN-64</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M Verpackungsfolie</td><td>Fisher</td><td>Scientific S37440</td><td></td></tr><tr><td>PYREX Spotplatte</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-748B</td><td></td></tr><tr><td>Seepferdchen XFe96 Analysator</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wave v2.4 XFe96 Analysatorsoftware</td><td>Agilent</td><td>https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop</td><td>kostenloser Download auf Mac oder Windows</td></tr><tr><td>XFe96 Catridge und Zellplatten</td><td>Agilent</td><td>102416-100</td><td></td></tr></tbody></table>

stoffwechselanalyse von drosophila melanogaster schildzecken und erwachsenen gehirn

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Messung des Stoffwechsels in Drosophila Melanogaster Larven und adulten Gehirn. Quantifizierung der Stoffwechsel im ganzen Organen bietet ein Gewebe-Ebene Verständnis der energetischen Nutzung, die nicht erfasst werden kann, bei der Analyse der primäre Zellen und Zell-Linien. Während dieser Analyse ex Vivoist, erlaubt die Messung aus einer Reihe von spezialisierten Zellen, die zusammenarbeiten, um eine Funktion in einem Gewebe führen und genauer Modelle die in-Vivo -Orgel. Metabolische Umprogrammierung ist bei vielen neurologischen Erkrankungen, einschließlich Neoplasie und neurodegenerativen Erkrankungen beobachtet worden. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die D. Melanogaster Gemeinschaft Untersuchung des Stoffwechsels bei neurologischen Erkrankung Modelle mit einem handelsüblichen metabolische Analyzer zu unterstützen. Stoffwechsel der ganze Köpfe in den metabolischen Analyzer zu messen ist schwierig, aufgrund der Geometrie des Gehirns. Dieser Analysator erfordert Proben am unteren Rand einer 96-Well-Platte zu bleiben. Zellproben und Gewebe Schläge können an der Oberfläche der Zelle Platte haften oder Sphäroid Platten bzw. zu nutzen. Die kugelförmigen, Dreidimensionale Form D. Melanogaster Gehirne verhindert jedoch das Gewebe von der Einhaltung der Plattenrandes. Dieses Protokoll erfordert eine speziell entwickelt und hergestellte Micro-Gewebe Zurückhaltung, die dieses Problem umgeht durch jede Bewegung des Gehirns gleichzeitig metabolische Messungen aus der Analyzer zwei Solid-State-Sensor Sonden zu verhindern. Sauerstoff-Verbrauch und extrazelluläre Übersäuerung Preise sind reproduzierbar und empfindlich auf eine Behandlung mit metabolische Inhibitoren. Mit einer kleinen Optimierung kann dieses Protokoll für die Verwendung mit jedem ganze Gewebe und/oder Modellsystem, angepasst werden, vorausgesetzt, dass die Stichprobengröße die Kammer erzeugt durch die Zurückhaltung nicht überschreitet. Während basale metabolische Messungen und eine Analyse nach einer Behandlung mit mitochondrialen Inhibitoren innerhalb dieses Protokoll beschrieben sind, konnten unzählige experimentelle Bedingungen, wie z. B. Energie Quelle Präferenz und Aufzucht Umgebung abgefragt werden.

Die hier vorgestellten Protokoll erfordert die Verwendung von Micro-Gewebe-Beschränkungen, die die unten beschriebenen Spezifikationen entsprechen. Mit anderen Methoden halten die Köpfe in Ort am unteren Rand der 96-Well-Zellplatte blieben erfolglos (Abb. 2A und 2 b). Zunächst verschiedene Agenten, um die Einhaltung der Gewebe auf die Platte zu erhöhen wurden getestet. Ein handelsübliche Gewebe Klebstoff (Table of Materials) empfiehlt für die Verwendung von Zellen und Organellen mit Zelle und Sphäroid Platten. Gehirn schien zunächst an der Oberfläche gut zu halten; jedoch die Sauerstoff-Verbrauch (OCR)-Lesungen waren niedrig, und beobachten die Brunnen nach der Test ergab, dass die Gehirn nicht mehr auf der gut Oberfläche (Abbildung 2A) angebracht wurden. Die gleichen Ergebnisse mit Superkleber (Abbildung 2A) aufgetreten. Als nächstes, Herstellung von kleinen Bildschirmen um die Gehirn in eine kleine Kammer an der Unterseite des Brunnens wurde versucht zu halten (Abb. 2 b).
Metallschirme produziert hohe OCR Messwerte allein, wie Bildschirme mit einem Polymer-Ring halten den Bildschirm (Abbildung 2 b) Metall. Kunststoff Netzgewebe hergestellt wurde mit dem gleichen Polymer-Ring verwendet. Dieses Gerät verursacht eine negative OCR-Lesung eingeholt werden. Schließlich wurden Mikro-Gewebe Fesseln gestaltet mit einem inerten Polymeren für den Ring messen einen Außendurchmesser von 0.146 in einen Innendurchmesser von 0.1335 in einer Dicke von 0,0125 in und einer Höhe von 0,016 In (Table of Materials). Superkleber (Table of Materials) wurde verwendet, um den Ring zu einem Nylon-Mesh mit einer bestimmten Porengröße von 0.0039 im Durchmesser (Table of Materials) befestigen. Die Porengröße ist kritisch, da es den Medien- und Metabolit Austausch ohne die Bildung von Luftblasen ermöglicht, aber immer noch wie eine Barriere, die Gehirne wirkt. Diese Fesseln allein führen wenig bis keine OCR lesen und mit Köpfchen, ermöglichen reproduzierbare Messwerte (Abb. 2A und 2 b). Die Überprüfung nach der Test zeigte, dass die Gehirn noch richtig, in den Brunnen positioniert waren. Diese Gewebe Fesseln sind derzeit nicht im Handel erhältlich, sondern können anhand der oben genannten Spezifikation gefertigt werden. Während dies präzisen Fertigung erfordert, werden die meisten Maschinenhallen diese Zurückhaltung unter Verwendung der oben genannten Materialien reproduzieren können.
Das Protokoll wurde weiter optimiert, um den Assay-Medien, die Zeit, bevor der Test ausgeführt und die Temperatur (Abbildung 3) zu berücksichtigen. Zunächst wurden Assays Mittel-und Schneider eingerichtet, um die Umwelt Larven in Vivo Modell. Jedoch können nicht verwendeten Medien Pufferung Agenten enthalten, da pH-Wert verwendet wird, um die ECAR zu messen. Dieses Medium hat somit nach Maß sein gemacht, die ist teuer. Um dies zu optimieren, wurde eine handelsübliche Assay-Medien zur Stoffwechselanalyse (Table of Materials) anstelle der Schneider-Medien verwendet. Die OCR-Ebenen blieben unverändert, auch bei einer Erhöhung der Blutzuckerspiegel leicht auf Modell-Assay-Medien-Bedingungen (Abb. 3A). Alle Tests von diesem Zeitpunkt an wurden in dem Assay Medium durchgeführt. Die Ergänzungen zu den Medien wurden durch die Beobachtung optimiert, ob den Sauerstoffverbrauch und die extrazelluläre Übersäuerung Preise eine Antwort zeigten, wenn Sie mit bekannten Mitochondrien-Hemmern behandelt. Als nächstes wurde die Wartezeit zwischen den Sektionen und der Test läuft analysiert. Eine Inkubation von 3 h deutlich gesunken, die OCR-Ebenen (Abb. 3 b). 3D Abbildung veranschaulicht den Unterschied am sechsten Zeitpunkt, was ist, wenn die OCR und ECAR Ebenen für Erwachsene und Larven Gehirne stabilisieren. So zeigt das Protokoll um die Probe unmittelbar nach der Sezierungen zu beginnen, es sei denn, das Experiment einer Temperatur Gleichgewichtherstellung erfordert in dem Fall eine Inkubation für weniger als 30 min vorgeschlagen wird. Der metabolische Analyzer lagert in einem Inkubator auf 11 ° C festgelegt, um eine Temperatur von 25 ° C während des Tests zu ermöglichen. Wenn die Temperaturen durch die Umgebungstemperatur und die Bedienung des Geräts erhöht sind, werden verringerte Niveaus der OCR eingehalten (Abbildung 3). Dies ist Hypothese zu Absterben von Gewebe zurückzuführen.
Wenn der optimierten Bedingungen eingehalten werden, die Assays mit den Larven und Erwachsenen Gehirne Ergebnis in Lesungen von etwas mehr als 150 Pmol/min bei der stabilisierten OCR sechsten Mal zeigen, ~ 25 min in den Assay (Abbildung 4 b). Dieser Prozentsatz ist für mindestens 30 min (Abb. 4A) und bis zu 2 h (Daten nicht gezeigt) angewendet. Die ECAR ist etwas niedriger im erwachsenen Gehirn als im Larvenstadium Gehirne am sechsten Zeitpunkt (Abbildung 4) und bleibt für mindestens 30 min (Abbildung 4). Dieser Befund entspricht einer Zunahme der Glykolyse in die Larvenstadien, Wachstum zu unterstützen. Eine Injektion mit einem mitochondriale Inhibitor, wie Oligomycin, senkt die OCR-Lesungen zu offenbaren die ATP-abhängige Atmung, und weitere Behandlung mit Rotenon und Antimycin A senkt die OCR zu offenbaren nicht mitochondriale Sauerstoffverbrauch (Abbildung 5A ). Diese Daten zeigen, dass diese Inhibitoren in der Lage sind, das Hirngewebe zu durchdringen und verwendet werden, können um die mitochondriale Atmung in den Gehirnen von unterschiedlichen Genotypen zu vergleichen. Dieser Assay, der Mix, warten, und Maßnahme durch die Beobachtung der Sauerstoffgehalt, nicht den Verbrauch, und sicherzustellen, dass nach dem Mischen optimiert wurden, kehrte der Sauerstoffgehalt auf das Niveau vor der Messung.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58007/58007fig1.jpg"> Abbildung 1: eine schematische Darstellung des larvalen Gehirn OCR und ECAR Messungen in der metabolischen Analyzer. Die Patrone ist einen Tag vor dem Ausführen des Tests bereit. Am nächsten Tag werden die Injektion-Ports der Patrone Drogen hinzugefügt. D. Melanogaster Larven Gehirne seziert, und Micro-Gewebe Fesseln werden hinzugefügt, um das Gehirn auf den Grund des Brunnens zu sichern. Die Zelle Platte mit dem Gehirn ist in der metabolischen Analyzer untersucht und die Daten analysiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58007/58007fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58007/58007fig2.jpg"> Abbildung 2: Micro-Gewebe Fesseln nicht metabolisch aktiv sind und halten das Gehirn in einer Kammer an der Unterseite der Platte gut. (A) die OCR Oregon-R D. Melanogaster Larven Gehirne bemisst sich in Brunnen beschichtet mit Gewebe-Klebeband (Table of Materials) oder wenn die Gehirne super an der Unterseite des Brunnens geklebt werden. Die Ergebnisse sind mit denen des Gehirns positioniert an der Unterseite des Brunnens mit Micro-Gewebe Fesseln verglichen. (B) die OCR bemisst sich in Brunnen mit Assay Medien und Metall, Metall mit einem Polymer-Ring, Kunststoff Netzgewebe hergestellt und eine Polymer-Ring oder Mikro-Gewebe Fesseln. p-Wert &lt; 0,05, ** p-Wert &lt; 0,01, *** p-Wert &lt; 0,001 *** p-Wert &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58007/58007fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58007/58007fig3.jpg"> Abbildung 3: Optimierung der Medien, Inkubationszeit und Temperatur. (A) der OCR ist gemessen in Oregon-R D. Melanogaster Larven Gehirne mit Schneider Media (S2) mit Natrium Pyruvat hinzugefügt, S2 mit Glukose und Natrium Pyruvat hinzugefügt und assay Medien mit Glukose und Natrium Pyruvat hinzugefügt. (B) die OCR wird in Larven Gehirne nach 3 h Inkubation vor der Probe oder nach 30 min Inkubation vor der Assay gemessen. (C) die OCR wird in Larven Gehirne im Test führen Sie Temperaturen von 33 ° C und 25 ° c gemessen. Der sechste Zeitpunkt ist grafisch dargestellt. (D) die OCR wird in Larven Gehirne nach 3 h Inkubation vor der Probe oder nach 30 min Inkubation vor der Assay gemessen. Die Daten ist für die sechste Zeitpunkt gemeldet. p-Wert &lt; 0,05, ** p-Wert &lt; 0,01, *** p-Wert &lt; 0,001 *** p-Wert &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58007/58007fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58007/58007fig4.jpg"> Abbildung 4: Die OCR ECAR sind reproduzierbar gemessen und in der Erwachsenenbildung und Larven D. Melanogaster Gehirne. (A) die OCR wird gemessen in Oregon-R D. Melanogaster Larven und erwachsenen Gehirn für 30 min. (B) die OCR-Daten des sechsten Zeit Punkts vom zentrale A grafisch dargestellt werden. Dies ist der Zeitpunkt, an dem die OCR-Lesungen zu stabilisieren. (C) die ECAR ist in D. Melanogaster Larven und erwachsenen Gehirn gemessen, für 30 min. (D) die ECAR Daten des sechsten Zeit Punkts vom Panel ein grafisch dargestellt werden. Dies ist der Zeitpunkt, an dem die ECAR Lesungen zu stabilisieren. p-Wert &lt; 0,05, ** p-Wert &lt; 0,01, *** p-Wert &lt; 0,001 *** p-Wert &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58007/58007fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58007/58007fig5.jpg"> Abbildung 5: Oligomycin senkt die D. Melanogaster Larven Gehirn OCR-Spiegel, ATP-abhängige Atmung zu offenbaren und Rotenon/Antimycin weitere senkt die OCR nicht mitochondriale Sauerstoffverbrauch offenbaren. (A) die OCR in Oregon-RD. Melanogaster Larven Gehirn nach einer Behandlung mit 20 µM Oligomycin und 5 µM Rotenon/Antimycin A Mischung gemessen wird. Die Kontrolle und Zurückhaltung nur Brunnen wurden mit Assay Medien injiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58007/58007fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zur Messung von Sauerstoff-Verbrauch und extrazelluläre Übersäuerung in Drosophila Melanogaster Larven und adulten Gehirn. Eine metabolische Analyzer ist eine angepasste und optimierte Protokoll genutzt. Micro-Gewebe Fesseln waren sind ein wesentlicher Bestandteil dieses Protokolls entworfen und speziell für den Einsatz in dieser Analyse erstellt.

Stoffwechselanalyse von Drosophila Melanogaster Schildzecken und erwachsenen Gehirn

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über den Gehirnstoffwechsel von Drosophila zu beantworten und darüber, wie sich eine übermäßige Proliferation von Gliazellen auf die metabolische Reprogrammierung auswirkt, unabhängig davon, ob die Ernährung oder das Verhalten den Stoffwechsel verändert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Fliegengehirne metabolisch als ein ganzes intaktes Gewebe analysiert werden können, wobei reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden, wenn jeweils nur ein Gehirn gemessen wird. Obwohl diese Methode Einblicke in den Stoffwechsel des Fliegengehirns geben kann, kann sie auch auf andere Gewebe und Modellsysteme wie Imaginalscheiben bzw. C.elegans angewendet werden.Um die Mikrogewebefesseln vorzubereiten, wählen Sie aus dem Vorratsbehälter eine Mikrogewebefessel pro Gehirn aus, das gemessen wird, plus mindestens drei für die Verwendung als reine Fixierungskontrollen. Spülen Sie die Fesseln mit einem Netzkorb und einer Sechs-Well-Platte mit siebzigprozentigem Ethanol und waschen Sie sie dreimal jeweils zwei Minuten lang mit entionisiertem Wasser. Führen Sie zusätzliche Wasserwäschen durch, wenn die Fesseln immer noch einen Alkoholgeruch abgeben.Waschen Sie die Mikrogewebe-Fesseln in Assay-Medien und lassen Sie sie in der Lösung, bis sie gebrauchsfertig sind. Um das Gehirn der Drosophila melanogaster-Larve zu sezieren, wählen Sie die Larven des späten dritten Stadiums aus einem Fläschchen mit kultivierten Organ-R-Fliegen aus. Legen Sie die Larve in die Vertiefung einer sauberen Präparierfleckplatte, die 500 Mikroliter 1x PBS enthält.Waschen Sie anschließend die Larve, indem Sie sie in der Vertiefung vorsichtig schütteln und in eine andere saubere Vertiefung umfüllen. Legen Sie dann die Spotplatte unter das Präpariermikroskop. Fassen Sie die Larve mit einer Pinzette an ihrem Mittelteil, während Sie die Ösenhaken mit einer zweiten Pinzette greifen.Ziehen Sie die Larve vorsichtig und gleichmäßig mit den beiden Pinzetten in entgegengesetzte Richtungen. Stellen Sie sich das Gehirn vor, das normalerweise an den Ösenhaken befestigt bleibt und an dem häufig Augenantennenscheiben befestigt sind. Verwenden Sie die Augenhaken, um das Gehirn an Ort und Stelle zu halten, und entfernen Sie vorsichtig zusätzliches Gewebe.Trennen Sie zum Schluss die Ösenhaken vom Gehirn. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um das präparierte Gehirn in eine neue Vertiefung zu übertragen, die 1x PBS enthält. Um die präparierten Gehirne zu einer 96-Well-Stoffwechsel-Assay-Platte hinzuzufügen, fügen Sie zunächst 50 Mikroliter Assay-Medium zu allen Vertiefungen hinzu, einschließlich der Versuchs-, Kontroll-, Nur-Rückhalte- und Hintergrund-Wells.Platzieren Sie dann vorsichtig ein Gehirn in jeder Vertiefung. Verwenden Sie unter dem Präpariermikroskop eine Mikrosonde mit gebogener Nadel, um das Gehirn auf den Boden der Vertiefung zu drücken. Positionieren Sie das Gehirn vorsichtig mit der Sonde in der Mitte der drei erhabenen Kugeln.Um der 96-Well-Stoffwechsel-Assay-Platte eine Mikrogewebefixierung hinzuzufügen, legen Sie sie zuerst auf den Rand. Richten Sie es unter einem Mikroskop so aus, dass der Kunststoffring nach unten und das Netz nach oben zeigt. Nehmen Sie anschließend die Platte aus dem Mikroskop.Fassen Sie die Fessel mit der Pinzette auf beiden Seiten an und lassen Sie sie vorsichtig in die Vertiefung fallen. Verwenden Sie eine Mikrosonde mit gebogener Nadel, um die Rückhaltevorrichtung in die Vertiefung zu drücken. Die Mikrogewebefesseln müssen in jeder Vertiefung richtig über dem zentrierten Gehirn positioniert werden, damit diese Technik aussagekräftige Ergebnisse liefert.Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob das präparierte Gehirn durch die Gewebefessel gesehen werden kann und dass es in der Vertiefung zentriert ist, und wiederholen Sie den Vorgang für alle Vertiefungen, die im Assay verwendet werden. Geben Sie vorsichtig 130 Mikroliter Assay-Medium in jede der Versuchs-, Kontroll- und Nur-Rückhalte-Wells. Vergewissern Sie sich, dass sich das Gehirn und die Mikrogewebefesseln beim Hinzufügen des Mediums nicht bewegt haben.Geben Sie dann 180 Mikroliter Assay-Medium in die vier Eck-Wells, um sie als Hintergrundkontrolle zu verwenden. Entfernen Sie bei diesem Verfahren die Gebrauchsplatte und geben Sie die Zellplatte ohne Deckel in der gleichen Ausrichtung in den Stoffwechselanalysator. Wählen Sie "Wägezellenplatte", damit das Gerät die Zellplatte aufnimmt, das Fach schließt und dann mit dem Assay beginnt.Wenn der Assay abgeschlossen ist, entfernen Sie die ausgestoßene Zellplatte und die Patrone. Überprüfen Sie mit einem Präpariermikroskop, ob das Gehirn und die Mikrogewebefesseln nach Abschluss des Assays noch richtig in der Vertiefung positioniert sind, und schließen Sie alle Vertiefungen mit Anomalien von der Analyse aus. Wenn die optimierten Bedingungen befolgt werden, führen die Assays mit dem Larven- und dem adulten Gehirn zu OCR-Messwerten von leicht über 150 Pikomol pro Minute zum stabilisierten sechsten Zeitpunkt, etwa 25 Minuten nach Beginn des Assays.Dieser Tarif wird für mindestens 30 Minuten und bis zu zwei Stunden beibehalten. Die ECAR ist zum sechsten Zeitpunkt in erwachsenen Gehirnen etwas niedriger als in Larvengehirnen und wird mindestens 30 Minuten lang aufrechterhalten. Dieser Befund entspricht einer Zunahme der Glykolyse während der Larvenstadien zur Unterstützung des Wachstums.Eine Injektion mit einem mitochondrialen Inhibitor wie Oligomycin senkt die OCR-Messwerte, um die ATP-abhängige Atmung aufzudecken, und eine weitere Behandlung mit Rotenon und Antimycin A senkt die OCR, um einen nicht-mitochondrialen Sauerstoffverbrauch aufzudecken. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, das Gehirn zu zentrieren und sicherzustellen, dass die Mikrogewebefessel an Ort und Stelle ist, bevor der Assay und während der Analyse durchgeführt werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie quantitative PCR und Western-Blot-Analyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen darüber zu beantworten, wie die Genexpression zum beobachteten metabolischen Phänotyp beiträgt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video beschreibt, wie man das erwachsene Drosophila-Gehirn präpariert und isoliert – ein Verfahren, das notwendig ist, um das Organ sichtbar zu machen, das sonst von der Nagelhaut, dem Auge und dem Luftröhrengewebe verdeckt wird. Das Beispielprotokoll zeigt eine detaillierte Demonstration, die zu hochwertigen Präparaten führt, die für Immunfärbungen und bildgebende Verfahren in der Neurobiologie von Drosophila verwendet werden können.

Drosophila Dissektion des Gehirns von Erwachsenen: Eine Methode der Fliegenneurobiologie

Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion und Immunostaining von Erwachsenen Drosophila Melanogaster Gewebe des Gehirns. Insbesondere unterstreicht dieses Protokoll die Verwendung von Drosophila Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen als Beispiel neuronale Teilmengen, die genau verwendet werden, um die allgemeinen Grundsätze für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung aufzudecken.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Dieses Protokoll beschreibt die Drosophila Larven für GC-MS-basierte Metabolomic Analyse vorzubereiten.

Vorbereitung von Drosophila Larven Proben für Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)-basierte Metabolomik

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Aufzeichnen der absteigenden elektrische Aktivität von Drosophila Melanogaster Zentralnervensystems ermöglichen kostengünstige und praktische Erprobung von pharmakologischen Wirkstoffen, Genmutationen neuronaler Proteine, und/oder die Rolle der unerforschten physiologischen Wege.

Elektrophysiologische Aufnahme der zentralen Nervensystems Tätigkeit der dritte Instar Drosophila Melanogaster

Beschrieben hier ist ein Protokoll, das die kolorimetrische Quantifizierung der Menge der Nahrung ermöglicht, die innerhalb eines definierten Zeitintervalls von Drosophila melanogaster Larven gegessen wird, die Diäten unterschiedlicher Makronährstoffqualität ausgesetzt sind. Diese Assays werden im Rahmen eines neuronalen thermogenetischen Bildschirms durchgeführt.

Quantifizierung der Zufuhr von Makronährstoffen in einem thermogenetischen neuronalen Bildschirm mit Drosophila Larven

Wir präsentieren eine Methode, die speziell auf das Bild des gesamten Gehirns von erwachsenen Drosophila während des Verhaltens und als Reaktion auf Reize zugeschnitten ist. Der Kopf ist positioniert, um den optischen Zugang zum gesamten Gehirn zu ermöglichen, während die Fliege ihre Beine und die Antennen, die Spitze des Proboscis bewegen kann, und die Augen sensorische Reize empfangen können.

Vorbereitung von Adult Drosophila melanogaster für die Bildgebung des gesamten Gehirns während des Verhaltens und der Stimuli-Reaktionen

Dieser Artikel enthält detaillierte Protokolle zur Zufügung einer penetrierenden traumatischen Hirnverletzung (PTBI) bei erwachsenen Drosophila und zur Untersuchung der daraus resultierenden Neurogenese.

Stimulation und Analyse der adulten Neurogenese im zentralen Gehirn von Drosophila

Ziel dieses Protokolls ist es, detaillierte Anleitungen zur richtigen Probenvorbereitung für die Lipid- und Metabolitenanalyse in kleinen Geweben wie dem Drosophila-Gehirn unter Verwendung der matrixgestützten Laserdesorption / Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie bereitzustellen.

Probenvorbereitung für die schnelle Lipidanalyse im Drosophila-Gehirn mittels matrixgestützter Laserdesorption/Ionisations-Massenspektrometrie-Bildgebung

Hier diskutieren wir einen Arbeitsablauf zur Präparation, Sektion, Montage und Bildgebung von lebenden Explantatgehirnen aus Drosophila melanogaster-Larven des dritten Stadiums, um die zelluläre und subzelluläre Dynamik unter physiologischen Bedingungen zu beobachten.

Lebendzell-Bildgebung von Drosophila melanogaster im dritten Stadium des Larvengehirns

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um den Transport von Monocarboxylaten, Glukose und ATP in Gliazellen und Neuronen unter Verwendung genetisch kodierter Förster-Resonanzenergietransfer-basierter Sensoren in einer ex-vivo-Drosophila-Larvenhirnpräparation zu visualisieren.

Visualisierung von Monocarboxylaten und anderen relevanten Metaboliten im ex vivo Drosophila-Larvengehirn mit genetisch kodierten Sensoren

Hier stellen wir einen schnellen, kostengünstigen Workflow für die hochauflösende Bildgebung von erwachsenen Drosophila-Augen vor, um Musterbildung und Wachstumsdefekte zu quantifizieren. Wir beschreiben unser Protokoll für die Probenvorbereitung durch Punktmontage, hochauflösende Bildaufnahme und Bildanalyse.

Ein schneller, einfacher Workflow zur Quantifizierung externer adulter Drosophila-Strukturen

Lernen Sie die Stoffwechselanalyse von Drosophila melanogaster Gehirnen mit einem metabolischen Analyzer. Diese Methode misst Sauerstoffverbrauch und extrazelluläre Azidifizierung in intakten Geweben.

Stoffwechselanalyse von Drosophila Melanogaster Schildzecken und erwachsenen Gehirn

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