In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen
18. Oktober 2018
Wir präsentieren eine in Vivo zwei-Photon imaging-Protokoll für die Belichtung der Hirnrinde des Neugeborenen Mäusen. Diese Methode ist geeignet für die Analyse der Entwicklungs Dynamik der kortikalen Neuronen, die molekularen Mechanismen, die die neuronale Dynamik und die Veränderungen in der neuronalen Dynamik in Krankheitsmodellen steuern.
Diese Methode kann helfen, schlüsselwichtige Fragen in der Neurowissenschaft zu beantworten, vor allem diejenigen im Zusammenhang mit Neuron Encke-Bildung. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass Forscher die morphologischen Veränderungen einzelner Neuronen bei lebenden neonatalen Mäusen analysieren können. Beginnen Sie mit einem anästhesierten postnatalen Tag fünf Welpen und gehen Sie nur in Ermangelung einer Reaktion auf den Schwanz Pinch Test.
Zuerst sterilisieren Sie die Kopfhaut, indem Sie sie mit 70% Ethanol abwischen. Verwenden Sie dann eine mit 70% Ethanol sterilisierte Schere, um etwa 20 Quadratmillimeter der Schädeldecke zu entfernen. Als nächstes verwenden Sie sterile Zangen und einen sauberen Wattestäbchen in Kortexpuffer getränkt, um die Faszien des Schädels zu entfernen.
Verwenden Sie eine Ladespitze, um Gewebekleber auf die eingeschnittene Hautoberfläche aufzutragen, um die Blutung zu stoppen und gleichzeitig den zu bebildernden Bereich zu vermeiden. Legen Sie den Welpen auf ein anderes Heizkissen, das auf 37 Grad Celsius eingestellt ist, und lassen Sie ihn von der Anästhesie erholen. Warten Sie ca. 30 Minuten, bis der Gewebekleber getrocknet und verfestigt ist.
Sobald der Gewebekleber getrocknet ist, beginnen Sie mit der Kranfenstervorbereitung an der neu anästhesierten Maus. Tragen Sie einen Tropfen Kortexpuffer auf den Schädel auf, und verwenden Sie dann eine sterile Rasierklinge, um vorsichtig einen Bereich mit einem Durchmesser von einem Millimeter des Schädels zu öffnen, so dass die Dura intakt bleibt. Tragen Sie den Kortexpuffer auf, um die Gehirnoberfläche feucht zu halten.
Verwenden Sie ein kleines Stück Gelatineschwamm in Kortexpuffer getränkt, um jede Blutung zu stoppen. Verwenden Sie ein frisches Stück, um eine Seite der Kraniotomie zu komprimieren und entleeren Sie jeden Puffer und Blut von der Duraloberfläche, ohne die Dura zu berühren. Dies ist der wichtigste Schritt, um ein klares Fenster vorzubereiten.
Die Dura muss unbeschädigt sein und die Bürste sollte von der freiliegenden Dura entfernt werden. Als Nächstes verwenden Sie eine Pipettenspitze, um eine dünne Schicht von einem Prozent niedriger Schmelzagarose aufzutragen, die im Kortexpuffer gelöst ist. Tragen Sie einen runden, drei Millimeter langen Glasdeckel auf die Agarose-Gelschicht auf.
Entfernen Sie alle Blasen zwischen dem Deckelschlupf und der Agarose-Gelschicht, indem Sie mehr als Agarose-Gel zwischen sie gießen. Verwenden Sie eine Pinzette, um das überschüssige Gel zu entfernen, das unter dem Deckschein hervorragt. Mischen Sie Zementpulver und die Zementflüssigkeit.
Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um die Mischung auf den Schädel aufzutragen, bevor sie verfestigt wird. Dann befestigen Sie eine maßgeschneiderte Titanstange mit Zahnzement am Schädelknochen. Richten Sie den Titanbalken aus, und der Deckelschlupf parallel, um Bilder einfach zu erfassen.
Bedecken Sie den freiliegenden Schädel mit Zahnzement. Dann, subkutan injizieren ein Schmerzmittel. Legen Sie den Welpen in einem Erholungskäfig auf einem 37 Grad Celsius Heizkissen für eine Stunde, bis der Zahnzement erstarrt ist.
Um mit der Bildgebung zu beginnen, legen Sie zunächst die Wellenlänge des Zweiphotonenlasers fest. Verwenden Sie für die RFP-Erregung eine Wellenlänge von 1000 Nanometern. Wischen Sie die Oberfläche des Deckelschlupfes mit 70% Ethanol ab.
Befestigen Sie den anästhesierten Welpen mit der Titanstange an der Titanplatte auf der Bildstufe. Verwenden Sie die Goniometer-Stufe, um den Kopf so einzustellen, dass der Deckschein parallel zur Objektivlinse ist. Halten Sie die Körpertemperatur des Welpen während der Bildgebung mit einem Auf 37 Grad Celsius eingestellten Heizpad aufrecht und reduzieren Sie die Isoflurankonzentration auf 0,7% bis 1%Stellen Sie die Bildstufe unter die 20-fache Objektivlinse der beiden Photonenmikroskop.
Tragen Sie einen Tropfen Wasser auf den Deckelzettel auf. Stellen Sie die Software so ein, dass Z-Stack-Bilder in 1,4-Mikron-Intervallen erfasst werden. Für Die Neuronenbildgebung der Schicht 4 stellen Sie die Z-Breite auf 150 bis 300 Mikrometer fest, um die gesamte dendritische Morphologie abzubilden.
Verwenden Sie langsames Scannen und Mittelung, um klare Bilder zu erhalten, die die neuronale Morphologie zeigen. Es dauert in der Regel mehr als 20 Minuten, um die gesamte dendritische Morphologie zu erwerben. Dieses Bild zeigt ein repräsentatives Z-Stack-Bild der Schicht vier kortikale Neuronen von P5 Welpen.
Der Pfeil zeigt das zu analysierende Neuron an. Neuronen mit verschwommenen Dendriten sollten aus der Analyse entfernt werden. Dieses Bild zeigt ein höheres Vergrößerungsbild des angezeigten Neurons im vorherigen Bild.
Blaue Pfeilspitzen zeigen dendritische Spitzen an, die beim nächsten Zeitpunkt zurückgezogen werden, und die kleinen weißen Pfeilspitzen zeigen das Axon einer benachbarten Zelle an. Nach 4,5 Stunden werden die dendritischen Spitzen mit blauen Pfeilspitzen zurückgezogen und die dendritischen Spitzen mit gelben Pfeilspitzen gestreckt. Hier wird eine repräsentative dendritische Morphologierekonstruktion gezeigt, Neuronen, die getrennte Dendriten zeigen, wie hier zu sehen, sollten von den Analysen ausgeschlossen werden.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Dura während des Prozesses intakt zu halten. Mit diesem Verfahren können andere Methoden wie in der Antriebsbildgebung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen im Zusammenhang mit dem Neuronenaktivitätsmuster im neonatalen Gehirn zu beantworten.
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Überblick
Diese Studie präsentiert ein in vivo Zwei-Photonen-Bildgebungsprotokoll zur Untersuchung der Großhirnrinde neugeborener Mäuse. Die Methode ermöglicht es Forschern, die Dynamik kortikaler Neuronen, ihre molekularen Mechanismen und Veränderungen im Zusammenhang mit Krankheitsmodellen zu analysieren.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Bildgebungstechniken
Hintergrund
- Fokus auf die Entwicklungsdynamik kortikaler Neuronen.
- In-vivo-Bildgebung lebender neugeborener Mäuse ermöglicht Echtzeit-Analyse.
- Behandelt Fragen zur Bildung von Neuronen-Steckdosen und allgemeinen neuronalen Dynamiken.
Zweck der Studie
- Um die Mechanismen zu verstehen, die die neuronale Dynamik in gesunden und krankhaften Zuständen steuern.
- Um Einblicke in morphologische Veränderungen von Neuronen im Laufe der Zeit zu gewinnen.
Verwendete Methoden
- Die Plattform umfasst in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie.
- Neugeborene Mäuse, speziell fünf Tage alte Junge, werden als biologisches Modell verwendet.
- Schlüsselschritte umfassen die Vorbereitung der Kraniotomie und die Anwendung eines Schädelfensters für die Bildgebung.
- Die Bildgebung umfasst das Erfassen von Z-Stack-Bildern in festgelegten Intervallen.
Hauptergebnisse
- Es wurden klare Bilder der dendritischen Morphologie erhalten, die dynamische Veränderungen über die Zeit offenbaren.
- Neuronale Reaktionen, wie die Rückbildung und Verlängerung von dendritischen Spitzen, wurden innerhalb von Stunden dokumentiert.
- Die Ergebnisse veranschaulichen die Bedeutung der Intakthaltung der Dura während der Eingriffe.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll ermöglicht detaillierte Einblicke in die Prozesse, die die neuronale Entwicklung und Dynamik steuern.
- Es hebt das Potenzial hervor, Krankheitsmodelle durch morphologische Analyse lebender Neuronen zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables real-time visualization of neuronal dynamics in living neonatal mice, supporting target validation in neurodevelopmental and neurodegenerative disease research. By capturing morphological changes in individual cortical neurons with high signal-to-noise ratio, it provides mechanistic insights that can de-risk early-stage target hypotheses. The approach bridges discovery neuroscience with translational applications in CNS drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by observing dendritic morphology changes in response to genetic or pharmacological perturbations.
- Operational Value: Supports functional target validation through sparse and bright labeling of cortical neurons using the Supernova system.
- Predictive Value: Facilitates phenotypic screening of gene editing or RNAi effects on neuronal structure in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative Z-stack imaging data at 1.4 micron intervals to measure dendritic retraction and elongation over time.
- Operational Value: Establishes a reproducible surgical and imaging workflow for consistent neuronal morphology assessment across experimental conditions.
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream evaluation of compound effects on neuronal dynamics in neonatal brain.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables analysis of developmental dynamics and molecular mechanisms controlling neuronal dynamics in disease models via CRISPR/Cas9 or RNAi integration.
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical validation by linking structural changes to functional neuronal outcomes.
- Risk Mitigation: Provides morphological readouts that help assess target engagement and mechanism-based effects prior to in vivo functional testing.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven target validation and lead identification through structural phenotyping of neurons in a neonatal disease-relevant system.
- Discovery Biology: Enables direct observation of neuronal morphological changes to clarify pathway involvement and de-risk mechanistic assumptions.
- Screening: Delivers standardized, quantitative imaging outputs that allow comparison of neuronal dynamics across genetic or drug-treated conditions.
- Analytics: Produces time-lapse Z-stack data enabling measurement of dendritic tip retraction and elongation as phenotypic endpoints.
- Translational Research: Connects structural changes in cortical neurons to potential biomarker alignment in neurodevelopmental disorder models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for longitudinal studies of neuronal development and degeneration across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by linking molecular interventions to observable structural changes in living neurons.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized cranial window preparation and imaging parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early structural phenotypes that predict functional neuronal outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on neuronal morphology validation in a physiologically relevant neonatal model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal mouse handling, stereotaxic surgery, and two-photon microscopy.
- Depends on specialized instrumentation including a two-photon laser system, goniometer stage, and titanium head bar.
- Necessitates cross-team standardization of surgical protocols and image analysis pipelines for consistent results.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different neuronal layers or brain regions beyond layer four cortex.
- Limited by the technical challenge of maintaining dura integrity and preventing brain motion during longitudinal imaging sessions.
