Lentivirale Vektor-vermittelte Gentherapie von Hepatozyten Ex Vivo für autologe Transplantation bei Schweinen

Dieses Protokoll soll porcinen Hepatozyten Isolierung und ex-Vivo gen Lieferung um Modelle der metabolischen Krankheiten durch autologe Stammzelltransplantation heilen zu beschreiben. Obwohl dieses Modell einzigartige Vorteile, die erfolgreichen Therapie bevorzugen genießt, ist die Anwendung eine relevante Grundlage um weitere Krankheiten und Indikationen.

Die Ex-vivo-Gentherapie und autologe Zelltransplantation zur Behandlung von angeborenen Stoffwechselfehlern in der Leber ist eine wichtige Alternative zur Therapie für diese Erkrankungen. Und ermöglicht es uns, diese Störungen nicht nur zu behandeln, sondern auch die Biomasse zu finden, die notwendig ist, um ein therapeutisches Ergebnis zu erzielen. Dieser Ansatz vermeidet auch die signifikanten Folgen der Immunsuppression und andere Folgen bei verschiedenen Arten von Therapien.

Im aktuellen Kontext verwenden wir diesen Ansatz, um erbliche Tyrosinämie Typ 1 zu behandeln. Die Idee ist jedoch, dass dies ein Plattformansatz sein wird, um eine Vielzahl von verschiedenen Lebererkrankungen mit minimaler Veränderung zu behandeln. Es ist wichtig, diese Technik visualisieren zu können, da es eine gewisse Variabilität gibt, wenn es darum geht, die Effizienz der Perfusion zu visualisieren, die wichtig ist, um lebensfähige Hepatozyten für die Transplantation zu erhalten.

Chirurgische Eingriffe von Robert Kaiser und Joseph Lillegard. Zellisolierung durchgeführt von Zeji Du, Bruce Amiot. Die UAU-Zellreinigung und Ex-vivo-Transduktion der Zellen erfolgte durch Caitlin VanLith.

Die Vorbereitung der Tiere und die OR-Vorbereitung wurden von Kari Allen und Laurie Hillin durchgeführt. Um den ersten Port-Site-Eingang durchzuführen, führen Sie eine offene Hasson-Technik cephalad auf den Nabel eines anästhesisierten, bis zu drei Monate alten, großen, weißen Farmschwein. Einführung eines 12-Millimeter-Trokars in die Bauchhöhle, wo das Peritoneum sichtbar ist.

Wenn der Trokar an Ort und Stelle ist, passieren Sie einen 5-Millimeter-30-Grad-Bereich durch den Eingangshafen und insuffieren Sie den Bauch mit Kohlendioxid auf 15 Millimeter Quecksilber. Unter direkter Visualisierung mit der laparoskopischen Kamera, platzieren Sie 2 zusätzliche 5-Millimeter-Anschlüsse, triangulieren deiner linken Seitenlappen der Leber. Und legen Sie das Laparoskop in einem der neuen Häfen.

Identifizieren Sie das linke seitliche Segment der Leber an der Stelle der hauptspalterung des linken Lappens, der die medialen und linken Seitensegmente trennt. Und verwenden Sie einen chirurgischen Hefter, um die Gefäßstrukturen und die Lebervene entlang dieser Spalte zu sichern. Transect das Parenchym durch diese Spalte mit sequentiellen Feuern und 60, 45 oder 30 Millimeter langen Gefäßlasten.

Wenn die Resektion abgeschlossen ist, bewerten Sie die Restleber, um eine ausreichende Hämostase zu gewährleisten und verwenden Sie endoskopische Greifer und einen endoskopischen Geweberückziehsack, um den Leberabschnitt abzurufen. Entfernen Sie nun die Ports, und verwenden Sie eine unterbrochene Naht der Größe Null für die Mittellinienfaszie. Eine laufende 2-0-Naht für die tiefe Dermalschicht.

Und eine laufende 4-0 Naht für die subgeschnittene Schicht, um den 12-Millimeter-Portschnitt in den drei Schichten zu schließen. Schließen Sie dann die Fünf-Millimeter-Ports in einer Schicht mit 2-0 Nähten. Und legen Sie ein steriles Dressing auf die Schnitte.

Für die Hepatozytenisolierung, verbinden Sie zuerst eine peristaltische Pumpe, um die Dispersionslösungen zu liefern, die in einem 43 Grad Celsius Wasserbad gehalten werden, an die Katheter, die in die großen, exponierten Gefäße des Leberabschnitts gelegt werden sollen. Prime die Pumpe und Schläuche mit der Perfusion zwei Lösung, bis zu einem Stop-Hahn Position zwischen der Perfusion eine und Perfusion zwei Lösung Lieferung an das Gewebe zu wechseln. Und schalten Sie den Stop-Hahn auf die Perfusion eine Position.

Dann den Rest des Schlauchsets grundieren. Vollständige Füllung einer Inline-Blasenfalle, um das Einbringen von Luftblasen in das Gewebe zu verhindern. Als nächstes machen Sie einen sauberen Querschnitt, senkrecht zur Leberzirkulation, um Querschnitte der Portalvenenzweige und der Lebervenen für die Katheterisierung zu offenbaren.

Und verwenden Sie einen eng anliegenden Katheter, um die verfügbaren, exponierten Venen zu katheterisieren. Wenn die Katheter an Ort und Stelle sind, durchdringen Sie das resezierte Lebergewebe mit warmer Perfusion eine Lösung mit einer Durchflussrate von 100 Millimetern pro Minute. Das Auslaufrohr alle 30 bis 60 Sekunden von Vene zu Vene bewegen.

Und mit einem Evakuierungsrohr, um überschüssigen Puffer aus dem Gewebetablett zu entfernen. Nach dem Radfahren durch alle verfügbaren Venen für 15 bis 20 Minuten, wechseln Sie zu Perfusion zwei Lösung unter den gleichen Bedingungen. Mit einer Rücklaufpumpe, um die Perfusion zwei Lösung zurück in das Reservoir zu recyceln, mit einer langsameren Durchflussrate, für die Wiederverabreichung in das Gewebe.

Überprüfen Sie die Oberflächentemperatur der Blasenfalle und, oder die Leber etwa alle fünf Minuten, um zu bestätigen, dass die Hepatozyten nicht kalt werden. Wenn die Leber nach etwa 30 Minuten Perfusion blanchiert, das Gewebe in einen sterilen Behälter geben, mit einem sterilen Drap umwickelt, und legen Sie den Behälter in eine Zellkulturhaube, um die Sterilität während der Hepatozytenverarbeitung aufrechtzuerhalten. Die Kollagenase-Isolation der Hepatozyten und zelllösende Assoziation muss vollständig durchgeführt werden, damit Sie keine Verklumpung der Zellen erhalten, was die Lebensfähigkeit der Zellen und die Transduktionsfrequenz verringert.

Untertauchen Sie die Leber mit Hepatozyten Waschmedium und ziehen Sie Schere über die Oberseite des Gewebes, um die Leberkapsel zu stören. Mit sterilen Handschuhen, sanft massieren Sie die Leber, um die Hepatozyten in das Medium freizugeben. Und filtern Sie den Gewebeüberstand durch sterile Gaze in 200 Milliliter Zentrifugenflaschen.

Sammeln Sie die gefilterten Hepatozyten durch Zentrifugation. Bündelung der Zellen in 150 Milliliter frischem Hepatozyten-Waschmedium in einer einzigen 200-Milliliter-Flasche für 2 zusätzliche Waschungen. Und zählen die Zellen nach der dritten Zentrifugation.

Verdünnen Sie dann die Zellen auf 1 mal 10 bis zu den neunten Hepatozyten pro Milliliter-Saline-Konzentration. Für die Autotransplantation der isolierten Hepatozyten verwenden Sie einen Zwei-Fünf-Megahertz-Wandler, um die Portalvene per Ultraschall zu identifizieren und eine Fünf-Zoll-Nadel mit 18-Spur in Richtung der Hauptportalvene zu lenken, die ungefähr ihrer Bifurkation entspricht. Laden Sie die Zellen in eine 60-Milliliter-Spritze, je nach dem gesamten Zellvolumen und befestigen Sie die Spritze an der Nadel, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen eingeführt werden.

Als nächstes drücken Sie den Spritzenkolben langsam, um manuell bis zu 1 mal 10 bis zu den neunten Hepatozyten durch die Portalvene zu gießen, indem Sie einen Infusionskatheter verwenden, um den Poraldruck während der Transplantation zu überwachen. Wenn alle Zellen geliefert wurden, entfernen Sie den Katheter und überwachen Sie die Portalvene auf das Vorhandensein von thrombotischen Ereignissen und den Vorwärtsfluss durch Ultraschall. In einer repräsentativen Kohorte von fünf Schweinen, die einer Leberresektion unterzogen wurden, hatten die meisten Erträge von mehr als 10 bis zu den neunten Hepatozyten mit einer Lebensfähigkeit von etwa 80 %.

Bereitstellung einer ausreichenden Anzahl von Zellen für jede Art von gewünschter Manipulation, einschließlich Der Gentherapie. Die nachfolgende Kultur des nicht transplantierten Teils dieser präparierten Hepatozyten zeigte 46 Stunden nach ihrer Transduktion und Erstbeschichtung eine gute Lebensfähigkeit und Haftung mit einer typischen Hepatozytenmorphologie. Eine anfängliche Transplantation variiert je nach Anzahl der Zellen, die während der Transplantation wieder eingeführt werden.

Diese repräsentativen Biopsien zeigen eine Zeitleiste der genkorrigierten Zellexpansion. Einzigartig bei Krankheiten, wie erbliche Tyrosinämie Typ 1, die einen positiven gewählten Druck für gesunde Zellen genießen. Diese Erweiterung ist in der Regel 12 Monate nach der Transplantation abgeschlossen.

Sobald ein transplantiertes Fumarylacetoacetat-Hydrolase-Knockout-Tier etwa 20% der korrigierten Hepatozyten in der Leber erreicht hat, normalisieren sich die Tyrosinspiegel im Vergleich zu Wildtieren. Während unkorrigierte Tiere sowohl bei alkalischer Phosphatase als auch bei Aspartattransaminase im Vergleich zu Wildtieren eine signifikante Erhöhung aufweisen, kehrt die Ex-vivo-Gentherapie diese Serumenzyme wieder auf normal. Darüber hinaus wird die allgemeine metabolische Gesundheit der Leber bei unbehandelten Knockout-Schweinen gestört, wie durch Erhöhungen im zirkulierenden Ammoniak angezeigt wird, die nach der Wiederbesiedlung mit den behandelten Hepatozyten korrigiert werden.

Es ist wichtig, sich mit dieser Technik daran zu erinnern, das Gewebe sorgfältig und so wenig wie möglich zu handhaben und zu manipulieren. Erhöhte Handhabung oder Manipulation des Gewebes, führt zu einer Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen und Abnahme der Ausbeute. Dieser Ansatz kann auch für Personen gelten, die daran interessiert sind, die Bogenverteilung und Graphenineffizienzen in Etikettierungstechniken zu untersuchen, und andere Techniken außerhalb der viralen Transduktionsprotokolle verwenden.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit viralen Vektoren gefährlich sein kann, so dass die Einhaltung der richtigen Bio-Sicherheitsverfahren, sowie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung ist notwendig, wenn Sie diese Techniken verwenden.