In Vivo Zwei-Farben 2-Photon Enzgebung von genetisch markierten Reporterzellen in der Haut

Morphologische Veränderungen treten in immunreagierenden Fibroblastenzellen nach aktivierung auf und fördern Veränderungen bei der Zellrekrutierung. Verwendung von 2-Photonen-Bildgebung in Verbindung mit einem gentechnisch veränderten Fibroblasten-spezifischen Protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed ^(TB/TB) Mauslinie und grün fluoreszierend markiert Lipopolysaccharid-FITC, können wir hochspezifische Aufnahme von Lipopolysaccharid in dermalen Fibroblasten und morphologischen Veränderungen in vivo veranschaulichen.

Unser Protokoll ermöglicht es uns, zu visualisieren, wie fluoreszierend markierte Zellen auf einen entzündlichen peripheren Reiz bei einem lebenden Tier in Echtzeit reagieren. Die 2-Photonen-Bildgebung ermöglicht die Visualisierung tief in das Gewebe einer lebenden Probe, bewahrt die Integrität ihrer Zellen und ihrer Mikroumgebung und liefert eine genaue Darstellung des biologischen Systems. Atmen bewegt die Pfote im Laufe der Zeit, was zu Unschärfe und einem Verlust der Brennebene führt.

Achten Sie darauf, die Pfote fest mit Klebeband auf einer stabilen Oberfläche vor der Bildgebung zu befestigen. Dabei müssen Sie in der Lage sein, eine geeignete Ebene von Interesse zu finden, stellen Sie sicher, dass objektiv in der Nähe der Pfote ohne Berührung und ist direkt über Injektionsstelle. Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, schalten Sie das Multi-Photon-System ein und wählen Sie das 25X subjektive.

Legen Sie ein stereotaxic-Gerät auf die Bühne des Multiphotonenmikroskops und schließen Sie das Gerät an eine Anästhesie-Zulagemaschine an. Legen Sie ein Stück mattes schwarzes Papier auf die Oberfläche des Geräts als Verbindungspunkt für die Mauspfote. Stellen Sie den Resonanzscanner mit einer festen Scanfläche von 512 mal 512 Mikrometern ein.

Stellen Sie die Anregungslaser auf die Anregungswellenlängen 930 bzw. 1, 100 Nanometer für grüne bzw. rote fluoreszierende Proteinsignale ein. Verwenden Sie einen dichroitischen Spiegel von 690 bis 1 050 Nanometern, um den Lichtweg beider Anregungslaser auf das einzelne Ziel zu lenken, sodass der 930 Nanometer große anregte Anregungslaser auf den Hauptscanner und den 1, 100 Nanometer abgestimmten Laser direkt in den Hauptscanner reflektiert werden kann. Stellen Sie dann die Laserleistung von FITC auf 5% und grünes fluoreszierendes Protein auf 20% und schalten Sie die Oberlichter aus.

Für die In-vivo-Bildgebung die Maus anästhesieren und im Textprotokoll umrissen. Bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen in der anästhesierten Maus und legen Sie die Maus in das stereotaxic Gerät mit Zugang zu einem Nasenkegel. Verwenden Sie schwarzes Klebeband, um die Hinterpfote fest auf dem Stück schwarzem Papier auf Bereichen sowohl proximal als auch distal auf den Bereich des Interesses zu befestigen, um sicherzustellen, dass die Plantaroberfläche der Pfote ist ungehindert und nach oben zum Ziel.

Legen Sie eine großzügige Menge an Gleitmittel auf Wasserbasis auf die Plantaroberfläche der Pfote. Berühren Sie das Ziel auf das Schmiermittel, um eine Flüssigkeitssäule zwischen der Pfote und dem Objektiv zu erstellen. Verwenden Sie das FITC-Erregungslicht, um sich in die dermale Schicht der Pfote zu fokussieren, was bestätigt, dass die Tandem-Dimer-Tomaten-Getagt-Fibroblasten visualisiert werden können.

Stellen Sie sich den Zellbereich direkt unter der Plantaroberfläche der Hinterpfote mit beiden Lasern vor. Erfassen Sie einen Zeitraffer von etwa fünf bis zehn Z-Scheiben bei etwa einem Mikrometer pro Scheibe, um eine Grunddarstellung der Umgebung zu erstellen. Wenn die Basisbildgebung erhalten ist, laden Sie eine 25 Mikroliter Glas Hamilton Spritze mit fünf Mikrogramm FITC konjugiertes Lipopolysaccharid, oder LPS, pro 20 Mikroliter PBS.

Die Lösung durch intraplantare Injektion in die experimentelle Hinterpfote verabreichen, ohne die Pfotenposition zu stören. Dann stellen Sie einen Zellbereich direkt unter der Plantaroberfläche der Hinterpfote mit beiden Lasern ab. Erwerben Sie einen Zeitraffer von 60 bis 120 Minuten von etwa fünf bis zehn Z-Scheiben bei etwa einem Mikrometer pro Scheibe, um die zellvermittelte intraplantare Aufnahme von LPS FITC zu identifizieren.

Da es keine inhärente Fluoreszenz durch die Zellen innerhalb der dermalen Schicht gibt, kann eine Vielzahl von Zellen in der dermalen Schicht der Hinterpfote beobachtet werden, indem fluoreszierend LPS nach intraplantarer Injektion in einer Wild-Typ-Maus einnimmt. Nach der LPS-FITC-Injektion bindet nur Fibroblasten-spezifisches Protein ein positives Protein wie Rezeptor vier bindet und nimmt das injizierte Protein mit einem hohen Maß an Kolokalisierung mit einem Tandem-Dimer-Tomaten-Tag auf, das von diesen Zellen ausgedrückt wird. Im Gegensatz dazu binden und nehmen Mäuse, die wie Rezeptor vier aus dem ganzen Körper geschlagen haben, LPS nach der Injektion nicht an und nehmen es auf.

Tatsächlich sind Zellsilhouetten nach der LPS-FITC-Injektion sichtbar, was darauf hinweist, dass sich das Medikament in der interstitiellen Flüssigkeit um Zellen dispergiert, aber nicht tatsächlich durch einen Rezeptor gebunden ist. Das Wichtigste, was in diesem Protokoll zu erinnern ist, sicherzustellen, dass die Pfote immobilisiert, so dass es keine Verzerrungen im Video aufgrund von Bewegung oder Atmung. Mit diesem Verfahren können die Rekrutierung von fluoreszierend markierten Zellen in einen Bereich nach der Verletzung und die morphologischen Veränderungen in der Reaktion einer Zelle auf einen Stimulus im Laufe der Zeit nachverfolgt werden.

So ermöglicht 2-Photon Bildgebung Forschergenetische Reporter Mäuse und fluoreszierend getaggte Verbindungen zu kombinieren, um zu beurteilen, was in einem lebenden Tier nach einer Injektion passiert.