Name: In Vivo Zwei-Farben 2-Photon Enzgebung von genetisch markierten Reporterzellen in der Haut (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Lernen Sie die Zwei-Photonen-Bildgebung zur Visualisierung von Fibroblasten-Aktivierung bei Entzündungen in lebenden Mäusen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Beobachtung zellulärer Dynamiken in vivo.

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Diese Arbeit wird durch den Zuschuss NS096030 (MDB) unterstützt. Wir möchten uns auch beim Imaging-Core-Manager Ved Prakash bedanken. Wir danken auch olympus Discovery Center/Imaging Core Facility an der UT Dallas für die Bereitstellung von Ausrüstung und Support

Tierverfahren wurden von der University of Texas am Dallas Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und entsprachen den Richtlinien der National Institutes of Health.  Alle Experimente wurden mit 8-12 Wochen alten männlichen und weiblichen Mäusen durchgeführt, die im eigenen Haus auf einem C57BL/6-Hintergrund gezüchtet wurden. Transgene Mäuse mit Kre-Rekombiinase, angetrieben durch den fibroblastenspezifischen Protein-1-Promoter, wurden kommerziell gekauft (Jackson, 012641) (FSP1cre)+/- und gekreuzt mit tdTomatolox-stop-lox Mäusen, auch kommerziell erworben ( Jackson, 007914) und (FSP1cre)+/- ; tdTomatolox-stop-lox und FSP1cre-/-; tdTomatolox-stop-lox Mäuse wurden im eigenen Haus auf einem C57BL/6 Hintergrund gezüchtet (Abbildung 1A,B,C). Fibroblasten-spezifisches Protein 1 ist ein endogenes Protein, das auf etwa 72% des Fibroblasten exprimiert wird und einen effektiven Krepptreiber im dermalen Gewebe20darstellt. Mäuse wurden in Gruppen untergebracht und ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser erhalten. Die Raumtemperatur wurde bei 21 °C bei 2 °C gehalten. Während wir C57BL/6 gekreuzte männliche und weibliche Mäuse mit 8-12 Wochen verwendet haben, glauben wir nicht, dass alter, geschlechtoder genetischer Hintergrund notwendige Voraussetzungen für Multiphotonenexperimente sind. Mäuse wurden unmittelbar nach dem Experiment tief beästhetisiert und eingeschläfert.
1. Zubereitung von Drogen
<ol><li>Bereiten Sie eine 5-g/20-L-Lösung aus Lipopolysaccharid-FITC (siehe Materialtabelle) in sterilen 1x PBS (pH 7.4) vor. Wirbeln Sie die Stammlösung mit mittlerer Intensität für minimale 30 Sekunden, um eine homogene Mischung für eine gleichmäßige Konzentration in der gesamten Lösung vor dem Pipetieren zu gewährleisten (LPS ist ein glutinöses Molekül). HINWEIS: Legen Sie LPS nicht in einen Glasbehälter, wenn möglich, verwenden Sie silikonisierte Mikrozentrifugenrohre. Auf Eis halten, bis es verwendet wird.</li>
</ol>2. Imaging-Setup
<ol><li>Richten Sie das Multiphotonensystem (siehe Materialtabelle) für die zweifarbige Bildgebung ein. Dies erfordert die Verwendung von zwei separaten Anregungslasern (siehe Materialtabelle),einem GFP/RFP-Filterwürfelsatz (siehe Materialtabelle) und einem 25-fachen (1,05 NA) Wasser-Immersion-Objektiv (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Benutzer können diese Einstellungen ändern, um alternative Setups und Multiphotonenmikroskop-Fähigkeiten besser anzupassen. Dies sind die Parameter, die im experimentellen Protokoll verwendet werden. Siehe Tabelle der Materialien für spezifische Details.</li>
	<li>Stellen Sie ein stereotaxic-Gerät (siehe Materialtabelle) auf die Bühne des Multiphotonenmikroskops. Verbinden Sie diese mit einer Anästhesie-Liefermaschine (siehe Materialtabelle), um sicherzustellen, dass die Tiere für die Dauer des Experiments beästheisiert werden. Legen Sie ein Stück mattes schwarzes Papier auf die Oberfläche des Geräts als Verbindungspunkt für die Mauspfote.</li>
	<li>Wählen Sie den Resonanzscanner mit einer festen Scanfläche von 512 x 512 m aus. HINWEIS: Führen Sie die Experimente in diesem Protokoll nicht mit einem Galvanometer-Scanner durch. Aufgrund der langsameren Abtastrate kommt es in Z-Stack-Zeitraffervideos zu Verzerrungen aufgrund der unvermeidbaren Atmung des Tieres.</li>
	<li>Richten Sie die beiden Anregungslaser auf die Anregungswellenlängen von GFP und RFP, 930 nm bzw. 1100 nm, und richten Sie den Lichtweg beider Anregungslaser mit einem dichroitischen Spiegel von 690-1.050 nm auf das einzelne Objektiv, so dass der 930 nm-tuned Anregungslaser auf den Hauptscanner und den 1.100 nm-abgestimmten Laser reflektiert werden, um direkt in den Hauptscanner zu gelangen (Abbildung 2). HINWEIS: Es ist möglich, diese Anregungswellenlängen abhängig von der Einrichtung des Benutzers zu ändern.</li>
	<li>Stellen Sie die Laserleistung von FITC auf 5% und GFP auf 20% ein. HINWEIS: Dieses Setup bietet ein optimales Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) in diesen Experimenten. Erkennen von Signalen über Multialkali-Photomultiplikatorröhren (PMTs); GaAsP-Detektoren können jedoch stattdessen in sehr hochempfindlichen Experimenten eingesetzt werden.</li>
	<li>Bereiten Sie den Raum für die Bildgebung unter dunklen Bedingungen ohne Streulicht vor.</li>
</ol>3. In-vivo-Bildgebung
<ol><li>Legen Sie die Maus in die Induktionskammer des Anästhesie-Liefersystems und verwenden Sie 5% Isofluran (siehe Materialtabelle) bei einem Sauerstoffdurchfluss von 2 l/min, um die Maus unter tiefe Anästhesie zu stellen. HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, während des Experiments alle geeigneten PSA zu tragen.<ol>
<li>Übertragen Sie die Maus auf das stereotaxic Gerät mit Zugang zu einem Nasenkegel, um anästhesie während des Experiments zu erhalten. Reduzieren Sie das Isofluran auf 1,5%-2% und halten Sie die Durchflussrate konstant.</li>
		<li>
 Befestigen Sie die Hinterpfote fest auf einem Stück schwarzem Papier mit schwarzem Klebeband auf Bereichen, die sowohl proximal als auch distal für den Interessenbereich sind (dies reduziert die Auswirkungen der Mausatmung auf die Bildqualität), um sicherzustellen, dass die Pflanzoberfläche der Pfote ungehindert und nach oben gerichtet ist auf das Ziel hin. Stellen Sie sicher, dass der Mauskopf im Nasenkegel, der am Gerät befestigt ist, stabil ist. HINWEIS: Überwachen Sie die Maus auf Anzeichen von Not oder Dehydrierung während des gesamten Experiments und passen Sie Isofluranentsprechend entsprechend an.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie eine großzügige Menge an sterilem Gleitmittel auf Wasserbasis (Gel, siehe Materialtabelle)auf die Plantaroberfläche der Pfote und berühren Sie das Ziel, um eine Flüssigkeitssäule zwischen der Pfote und dem Objektiv zu erzeugen.</li>
	<li>Verwenden Sie das FITC-Erregungslicht, um sich in die dermale Schicht der Pfote zu fokussieren. Stellen Sie sicher, dass tdTomato-markierte Fibroblasten visualisiert werden, bevor Sie fortfahren (dieser Schritt ist wichtig, um die richtige Fokusebene zum Bild zu bestimmen). HINWEIS: Die dermale Schicht der Pfote beträgt ca. 100-150 m in der Pfote.</li>
	<li>Stellen Sie die Fläche der Zellen, die sich direkt unter der Pflanzfläche der Hinterpfote befindet, mit den 930 nm- und 1100 nm-gestimmten Lasern ab und erfassen Sie einen 15-minütigen Zeitraffer von ca. 5-10 Z-Scheiben bei ca. 1 m pro Scheibe, um eine Darstellung der Umgebung vor Injektion mit LPS-FITC.</li>
	<li>Führen Sie eine intraplantare Injektion von 5 g/20 LPS-FITC auf die Hinterpfote der Maus mit einer 25-L-Glas-Hamilton-Spritze (siehe Materialtabelle)und einer 30G-Nadel (siehe Materialtabelle)durch, wobei darauf geachtet wird, die Position der Pfote nicht zu stören.</li>
	<li>Stellen Sie eine Zellfläche direkt unterhalb der Pflanzfläche der Hinterpfote mit den 930 nm und 1100 nm-gestimmten Lasern auf und erfassen Sie einen 60-120 Minuten dauernden Zeitraffer von etwa 5-10 Z-Scheiben bei ca. 1 m pro Scheibe, um die Aufnahme von LPS-FITC durch Zellen zu identifizieren.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die wohl wichtigsten Schritte der in vivo 2-Photonen-Bildgebung sind: 1) Die Wahl der richtigen genetischen Reportermaus und fluoreszierend getaggtes Protein für den Multi-Photon-Setup und experimentelle Bedürfnisse21,22; 2) Abbildung der richtigen Fokalebene, um eine genaue Darstellung der Population der Zellen im Gewebe23zu haben; 3) Minimierung der Bewegung durch ein unsachgemäß immobilisiertes Tier24; und 4) Aus...

Lipopolysaccharid (LPS) ist ein Endotoxin, das in der äußeren Membran von gramnegativen Bakterien gefunden wird1. LPS hat eine hohe Bindungsaffinität für den gebührenähnlichen Rezeptor 4 (TLR4)/CD14/MD2-Rezeptorkomplex2. TLR4 ist ein Mustererkennungsrezeptor, der häufig auf der äußeren Membran einer vielzahl von Immunzellen, mesenchymalen Zellen und einer Teilmenge sensorischer Neuronen3,4,5gefunden wird. Die Aktivierung von TLR4, ausgedrückt auf Immunzellen, führt zu MyD88-abhängigen und unabhängigen zweiten Botensystemen, die mit der Translokation des Kernfaktors kappa beta (NF-B) in den Zellkern enden. Dies bewirkt, dass die prototypische Immunzelle pro-inflammatorische Zytokine wie Interleukin (IL)-1, IL-6 und TNF-6 produziert und freisetzt. Wie andere Zelltypen auf die TLR4-Stimulation reagieren, ist jedoch nicht so klar. Fibroblasten wurden in eine Breite von Pathologien wie Krebs und Mukoviszidose verwickelt und haben vor kurzem gezeigt, dass eine Rolle Monozyten-Chemo-Attraktion und Förderung der Entzündung7,8,9.  Unser Labor interessiert sich für die Rolle von Fibroblasten bei der Entwicklung akuter und chronischer Schmerzen, da erste Hinweise darauf hindeuten, dass Faktoren, die durch Fibroblasten freigesetzt werden (Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), Gewebeinhibitor von Metalloproteinasen (TIMPs) und Fibroblasten, Wachstumsfaktoren (FGFs)) sind an neuropathische Schmerzen beteiligt10.
Aktivierungszustände von Zellen können durch eine Vielzahl von Faktoren bestimmt werden, die folgendes umfassen: Induktion von sofort-frühen Genen, veränderte Proteinexpression, Zellproliferation und morphologische Veränderungen11,12,13. Es gibt viele Techniken, die existieren, um Fragen zu beantworten, die wir haben können, wie die Aktivierung von Zellen zu Pathologien beiträgt, aber sie alle haben ihre Grenzen. Die prototypische Immunhistochemie verwendet fluoreszierend markierte Antikörper, um Proteine von Interesse in festem Gewebe zu kennzeichnen, die unspezifisch sein können und oft eine signifikante Fehlerbehebung erfordern, bevor sie fruchtbare Ergebnisse liefert14. Western Blotting ist eine nützliche Technik beim Vergleich der Proteinexpression im post-mortem Gewebe; jedoch fehlt die histologische Komponente in dieser Technik und Forscher sind nicht in der Lage, Veränderungen in der Morphologie zu identifizieren15. RNA-Seq ermöglicht es uns, das Vorhandensein von Messenger-RNA in einer Probe zu quantifizieren, die in vielen Fällen aufschlussreiche Daten liefert; die Lücke zwischen Transkription und Übersetzung macht es jedoch schwierig, eine zeitliche Auflösung nach einem Stimulus16zu haben. Konfokale Bildgebung ist nützlich bei der Bestimmung der Expression und Kolokalisierung von Proteinen, die in einem Querschnitt von Geweben existieren17. Oft ist dies nicht repräsentativ für die Gesamtheit der Gewebeprobe. Im Gegensatz dazu ermöglichen Multiphotonenmikroskope dem Anwender, etwa 1 mm tief in eine Probe einzutauchen, wodurch eine umfassende dreidimensionale Darstellung18entsteht. Daher konzentrieren wir uns auf in vivo, 2-Photon Imaging Preps, da die aus diesen Experimenten gesammelten Daten direkter mit der hochplastischen und vernetzten Mikroumgebung von lebendem Gewebe in Verbindung stehen.
Ein Vorteil der Untersuchung von Protein-Rezeptor-Wechselwirkungen in vivo ist, dass wir klar erfassen können, wie Zellen in Echtzeit auf einen Stimulus in ihrer heimischen Umgebung reagieren, ohne den schädlichen und unvorhersehbaren Einfluss der postmortalen Gewebeextraktion19. Darüber hinaus können Längsschnittstudien durchgeführt werden, um die zelluläre Plastizität und Grundierung zu bewerten, die aufgrund der Aktivierung auftreten können.  Mit 2-Photon-Bildgebung bewahren wir die Integrität der Mikroumgebung, die bei der Anwendung eines externen Stimulus vorhanden ist. Dieses Protokoll bietet eine Möglichkeit, die Aufnahme von Molekülen in Fibroblasten nach der peripheren Injektion von fluoreszierend markiertem LPS im Laufe von mehreren Stunden in vivo und die Rolle von TLR4 bei der Fibroblastenaktivierung zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>10x PBS, 4 L</td><td>Fisherbrand</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>700 Serie MICROLITER Spritzen, Hamilton, Modell 705 LT</td><td>Spritze Hamilton</td><td>80501</td><td></td></tr><tr><td>BD Precision Glide Nadel 30G</td><td>VWR</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Blau</td><td>Pad Fisherbrand</td><td>1420665</td><td></td></tr><tr><td>Filter Würfel: Grün/Rot (BP 495-540 DM570 BP 575-645)</td><td>Olympus</td><td>FV30-FGR</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran, USP 250 mL</td><td>Vedco</td><td>50989-150-15</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide aus Escherichia Coli O111:B4 - FITC-Konjugat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3665-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Hauptlaser des Scanners: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL gepulster IR-LASER, abstimmbar von 680 nm bis 1300 nm, 120 fs Pulsbreite in der Probenebene</td><td>Spectra Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen, 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td></td></tr><tr><td>Multiphotonenmikroskop: Olympus MPE-RS TWIN</td><td>Olympus</td><td>MPE-RS TWIN</td><td></td></tr><tr><td>Objektiv: Ultra 25x MPE Wasserimmersionsobjektiv 1,05 NA, 2 mm WD</td><td>Olympus XLPLN25XWMP2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Personal Lubricant Jelly (Gel)</td><td>equate</td><td>ZH727 2E F1</td><td></td></tr><tr><td>SGM-4 Stereotaktisches Gerät</td><td>Narishige</td><td>16030</td><td></td></tr><tr><td>SomnoSuite Low-Flow-Anästhesie System</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SS-01</td><td></td></tr><tr><td>Stimulationslaser: Olympus-spezifischer SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL gepulster IR-LASER, abstimmbar von 690 nm bis 1040 nm, 100 fs Pulsbreite in der Probenebene</td><td>Spectra Physics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo zwei-farben 2-photon enzgebung von genetisch markierten reporterzellen in der haut

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasten sind mesenchymale Zellen, die ihre Morphologie nach Aktivierung verändern und letztlich die Mikroumgebung des Gewebes beeinflussen, in dem sie sich befinden. Obwohl herkömmliche bildgebende Verfahren nützlich sind, um Proteininteraktionen und Morphologie in festem Gewebe zu identifizieren, sind sie nicht in der Lage, Einen Einblick zu geben, wie schnell Zellen in der Lage sind, Proteine zu binden und aufzunehmen, und sobald sie aktiviert sind, wie sich ihre Morphologie in Vivo. In der vorliegenden Studie stellen wir 2 hauptgestellte Fragen: 1) Wie ist der Zeitverlauf der Fibroblastenaktivierung über mautähnliche Rezeptor-4 (TLR4) und Lipopolysaccharid (LPS) Interaktion und 2) wie verhalten sich diese Zellen, sobald sie aktiviert wurden? Mit 2-Photon-Bildgebung haben wir eine neuartige Technik entwickelt, um die Fähigkeit von LPS-FITC zu bewerten, sich an seinen Kognanrezeptor TLR4 zu binden, der auf peripheren Fibroblasten in der genetischen Reporter-Mauslinie ausgedrückt wird; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox in vivo. Dieser einzigartige Ansatz ermöglicht es Forschern, tiefgehende, zeitraffende Videos und/oder Bilder von Proteinen zu erstellen, die mit lebenden Zellen interagieren, was es einem ermöglicht, eine erhöhte Granularität zu haben, um zu verstehen, wie Proteine das zelluläre Verhalten verändern können.

Zunächst injizierten wir LPS-FITC in die Hinterpfote von Wild-Typ-Mäusen, um die Aufnahme von LPS-FITC in allen Zelltypen zu visualisieren, die in der dermalen Schicht der Pfote vorhanden sind. Nachdem wir eine Vielzahl von Zellen in der dermalen Schicht der Hinterpfotenaufnahme fluoreszierend LPS in einer Wild-Typ-Maus beobachtet hatten (Videoabbildung 1, 2), versuchten wir, speziell Auf Fibroblasten zu zielen, da sie ein Primärfokus in unserer Forschung sind. Bevor wir die Pfoten von Tieren, die mit LP...

Morphologische Veränderungen treten in immunreagierenden Fibroblastenzellen nach aktivierung auf und fördern Veränderungen bei der Zellrekrutierung. Verwendung von 2-Photonen-Bildgebung in Verbindung mit einem gentechnisch veränderten Fibroblasten-spezifischen Protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) Mauslinie und grün fluoreszierend markiert Lipopolysaccharid-FITC, können wir hochspezifische Aufnahme von Lipopolysaccharid in dermalen Fibroblasten und morphologischen Veränderungen in vivo veranschaulichen.

In Vivo Zwei-Farben 2-Photon Enzgebung von genetisch markierten Reporterzellen in der Haut

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Unser Protokoll ermöglicht es uns, zu visualisieren, wie fluoreszierend markierte Zellen auf einen entzündlichen peripheren Reiz bei einem lebenden Tier in Echtzeit reagieren. Die 2-Photonen-Bildgebung ermöglicht die Visualisierung tief in das Gewebe einer lebenden Probe, bewahrt die Integrität ihrer Zellen und ihrer Mikroumgebung und liefert eine genaue Darstellung des biologischen Systems. Atmen bewegt die Pfote im Laufe der Zeit, was zu Unschärfe und einem Verlust der Brennebene führt.Achten Sie darauf, die Pfote fest mit Klebeband auf einer stabilen Oberfläche vor der Bildgebung zu befestigen. Dabei müssen Sie in der Lage sein, eine geeignete Ebene von Interesse zu finden, stellen Sie sicher, dass objektiv in der Nähe der Pfote ohne Berührung und ist direkt über Injektionsstelle. Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, schalten Sie das Multi-Photon-System ein und wählen Sie das 25X subjektive.Legen Sie ein stereotaxic-Gerät auf die Bühne des Multiphotonenmikroskops und schließen Sie das Gerät an eine Anästhesie-Zulagemaschine an. Legen Sie ein Stück mattes schwarzes Papier auf die Oberfläche des Geräts als Verbindungspunkt für die Mauspfote. Stellen Sie den Resonanzscanner mit einer festen Scanfläche von 512 mal 512 Mikrometern ein.Stellen Sie die Anregungslaser auf die Anregungswellenlängen 930 bzw. 1, 100 Nanometer für grüne bzw. rote fluoreszierende Proteinsignale ein. Verwenden Sie einen dichroitischen Spiegel von 690 bis 1 050 Nanometern, um den Lichtweg beider Anregungslaser auf das einzelne Ziel zu lenken, sodass der 930 Nanometer große anregte Anregungslaser auf den Hauptscanner und den 1, 100 Nanometer abgestimmten Laser direkt in den Hauptscanner reflektiert werden kann. Stellen Sie dann die Laserleistung von FITC auf 5% und grünes fluoreszierendes Protein auf 20% und schalten Sie die Oberlichter aus.Für die In-vivo-Bildgebung die Maus anästhesieren und im Textprotokoll umrissen. Bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen in der anästhesierten Maus und legen Sie die Maus in das stereotaxic Gerät mit Zugang zu einem Nasenkegel. Verwenden Sie schwarzes Klebeband, um die Hinterpfote fest auf dem Stück schwarzem Papier auf Bereichen sowohl proximal als auch distal auf den Bereich des Interesses zu befestigen, um sicherzustellen, dass die Plantaroberfläche der Pfote ist ungehindert und nach oben zum Ziel.Legen Sie eine großzügige Menge an Gleitmittel auf Wasserbasis auf die Plantaroberfläche der Pfote. Berühren Sie das Ziel auf das Schmiermittel, um eine Flüssigkeitssäule zwischen der Pfote und dem Objektiv zu erstellen. Verwenden Sie das FITC-Erregungslicht, um sich in die dermale Schicht der Pfote zu fokussieren, was bestätigt, dass die Tandem-Dimer-Tomaten-Getagt-Fibroblasten visualisiert werden können.Stellen Sie sich den Zellbereich direkt unter der Plantaroberfläche der Hinterpfote mit beiden Lasern vor. Erfassen Sie einen Zeitraffer von etwa fünf bis zehn Z-Scheiben bei etwa einem Mikrometer pro Scheibe, um eine Grunddarstellung der Umgebung zu erstellen. Wenn die Basisbildgebung erhalten ist, laden Sie eine 25 Mikroliter Glas Hamilton Spritze mit fünf Mikrogramm FITC konjugiertes Lipopolysaccharid, oder LPS, pro 20 Mikroliter PBS.Die Lösung durch intraplantare Injektion in die experimentelle Hinterpfote verabreichen, ohne die Pfotenposition zu stören. Dann stellen Sie einen Zellbereich direkt unter der Plantaroberfläche der Hinterpfote mit beiden Lasern ab. Erwerben Sie einen Zeitraffer von 60 bis 120 Minuten von etwa fünf bis zehn Z-Scheiben bei etwa einem Mikrometer pro Scheibe, um die zellvermittelte intraplantare Aufnahme von LPS FITC zu identifizieren.Da es keine inhärente Fluoreszenz durch die Zellen innerhalb der dermalen Schicht gibt, kann eine Vielzahl von Zellen in der dermalen Schicht der Hinterpfote beobachtet werden, indem fluoreszierend LPS nach intraplantarer Injektion in einer Wild-Typ-Maus einnimmt. Nach der LPS-FITC-Injektion bindet nur Fibroblasten-spezifisches Protein ein positives Protein wie Rezeptor vier bindet und nimmt das injizierte Protein mit einem hohen Maß an Kolokalisierung mit einem Tandem-Dimer-Tomaten-Tag auf, das von diesen Zellen ausgedrückt wird. Im Gegensatz dazu binden und nehmen Mäuse, die wie Rezeptor vier aus dem ganzen Körper geschlagen haben, LPS nach der Injektion nicht an und nehmen es auf.Tatsächlich sind Zellsilhouetten nach der LPS-FITC-Injektion sichtbar, was darauf hinweist, dass sich das Medikament in der interstitiellen Flüssigkeit um Zellen dispergiert, aber nicht tatsächlich durch einen Rezeptor gebunden ist. Das Wichtigste, was in diesem Protokoll zu erinnern ist, sicherzustellen, dass die Pfote immobilisiert, so dass es keine Verzerrungen im Video aufgrund von Bewegung oder Atmung. Mit diesem Verfahren können die Rekrutierung von fluoreszierend markierten Zellen in einen Bereich nach der Verletzung und die morphologischen Veränderungen in der Reaktion einer Zelle auf einen Stimulus im Laufe der Zeit nachverfolgt werden.So ermöglicht 2-Photon Bildgebung Forschergenetische Reporter Mäuse und fluoreszierend getaggte Verbindungen zu kombinieren, um zu beurteilen, was in einem lebenden Tier nach einer Injektion passiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Um zu verstehen, Netzwerk-Dynamik Mikroschaltungen in den Neocortex, ist es wichtig, gleichzeitig aufzeichnen die Aktivität einer großen Anzahl von Neuronen. In-vivo Zwei-Photonen-Kalzium-Imaging ist die einzige Methode, dass man, um die Aktivität eines dichten neuronalen Population mit Single-Cell-Auflösung aufzeichnen können.

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2 / 3 der Mäuse

Quelle: Wang, Z., et al. Transpupilläre Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus.  J. Vis. Exp. (2021). Dieses Video zeigt eine Technik für die in vivo Netzhautbildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie. Anästhesierte Mäuse werden auf die Bildgebung vorbereitet, indem sie ihren Kopf sichern, Augenschmiermittel auftragen und ein Deckglas über das Auge legen. Retinale Ganglienzellen (RGCs), die fluoreszierende Proteine exprimieren, werden zunächst mittels Epifluoreszenz zur...

Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in Nervenzellen sind essentiell für die Fähigkeit des Gehirns, in Reaktion auf Verhaltensstörungen Herausforderungen anzupassen.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

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Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

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In-vivo-Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der Biologie in Gesundheit und Krankheit. Dieses Protokoll beschreibt die transpupille Bildgebung der Netzhaut der Maus mit einem Standard-Zwei-Photonen-Mikroskop. Es zeigt auch verschiedene In-vivoimaging-Methoden, um mehrere zelluläre Kohorten der Netzhaut fluoreszierend zu markieren.

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In Vivo Zwei-Farben 2-Photon Enzgebung von genetisch markierten Reporterzellen in der Haut

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