In Situ-Überwachung von transient gebildeten molekularen Chaperon-Baugruppen in Bakterien, Hefe und menschlichen Zellen

Cognate J-Domain-Proteine arbeiten mit dem Hsp70-Chaperon zusammen, um eine Vielzahl biologischer Prozesse zu unterstützen, die von der Proteinfaltung bis zum Abbau reichen. Hier beschreiben wir einen in situ-Näheligationstest, der die Überwachung dieser vorübergehend gebildeten Chaperon-Maschinen in Bakterien-, Hefe- und menschlichen Zellen ermöglicht.

Diese Methode erfasst transiente Proteinwechselwirkungen in Organismen wie Bakterien und Hefe und in verschiedenen Zelltypen. Hier überwachen wir vorübergehend gebildete spezifische Chaperonkomplexe, die an zellulärer Proteostase beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, Informationen über Dynamik und subzelluläre Lokalisierung von Proteinassemblys in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen zu generieren.

Anpassungen dieser Technik in einzelligen Organismen wie Bakterien und Hefe, ermöglicht es Forschern, es als ein leistungsfähiges Werkzeug zu verwenden, um Krankheiten im Zusammenhang mit mikrobiellen Infektionen zu untersuchen. Diese Technik könnte möglicherweise verwendet werden, um Protein-Wechselwirkungen in fast allen Organismen zu analysieren, indem einfach die Bedingungen in der Probenvorbereitungsphase des Protokolls geändert werden. Es ist wichtig, qualitativ hochwertige Antikörper auszuwählen, die spezifisch sind und entweder in Immunhistochemie, Immunfluoreszenz, ELISA oder Immunpräzipitänglichkeit getestet werden.

Beginnen Sie mit der Vorbehandlung von 10-Well-Diagnosedias mit Poly-L-Lysin. Fügen Sie 100 Mikroliter sterilund gefiltert 0,0001%Poly-L-Lysin zu jedem Brunnen hinzu und bebrüten die Dias 30 Minuten lang in einer sterilen laminaren Durchflusshaube. Dann waschen Sie jeden Brunnen mit 50 Mikroliter sterilem Wasser, um überschüssiges Poly-L-Lysin zu entfernen.

Fügen Sie je nach Zelltyp etwa 15 000 Zellen pro Brunnen hinzu und wachsen Sie die Zellen in einem sterilen Feuchtbrutschrank bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid zu einer Konfluenz von 60 bis 80 %. Nach 24 Stunden entfernen Sie das Wachstumsmedium, indem Sie ein Gewebepapier am Rand jedes Brunnens platzieren, und waschen Sie die Zellen dreimal mit 50 Mikroliter PBS. Dann fixieren Sie die Zellen, indem Sie 50 Mikroliter frisch zubereitetes 4%Paraformaldehyd in PBS zu jedem Brunnen hinzufügen und die Rutsche bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubieren.

Waschen Sie die Folie nach der Fixierung dreimal, indem Sie die Folie in ein Schiebeglasmiten mit PBS eintauchen. Um die Membranen der angeschlossenen Zellen zu durchdringen, tauchen Sie das Dia in 100 Milliliter 0,5%Triton-X100 in PBS ein und inkubieren Sie die Zellen für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Dias dreimal in TBS-T.

Nach der letzten Wäsche den überschüssigen Puffer mit einem Tissuepapier entfernen. S.cerevisiae-Zellen nach Manuskriptanweisungen wachsen und verdünnen, dann drei Minuten lang in ein 50-Milliliter-Zentrifugenrohr und Pellet durch Zentrifugation bei 665-fachm g übertragen. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in fünf Milliliter frischem Medium wieder aus.

Dann 550 Mikroliter 37%Formaldehyd für eine Endkonzentration von 4% hinzufügen und die Kultur bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubieren, um die Zellen zu fixieren. Nach der Inkubation die Zellen pellet, den Überstand entfernen und das Pellet in einem Milliliter frisch zubereitetem 4%Paraformaldehyd im Waschpuffer wieder aufhängen. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 45 Minuten.

Bereiten Sie die Diagnosefolien vor, indem Sie 100 Mikroliter 0,0001%Poly-L-Lysin-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen und die Dias 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann das überschüssige Poly-L-Lysin mit Reinstwasser wegwaschen und die Dias lufttrocknen lassen. Waschen Sie die Zellen nach dem Inkubationsschritt zweimal mit einem Milliliter Waschpuffer durch Zentrifugation.

Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen im Waschpuffer wieder auf. Pellet die Zellen nach der letzten Wäsche, und entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Waschpuffer enthält 1,2 Molaren-Sorbitol. Um die Zellwand zu verdauen, pellet die Zellen wieder und suspendieren sie die Zellen in 250 Mikroliter frisch zubereiteter Lyticase-Lösung.

Inkubieren Sie die Zellen bei 30 Grad Celsius für 15 Minuten mit sanftem Schütteln. Nach dem Verdauungsschritt die Zellen dreimal im Waschpuffer waschen und die Zellen in 250 Mikroliter Waschpuffer mit 1,2 Molarensorbitol wieder aufhängen. Fügen Sie jedem poly-L-Lysin-beschichteten Brunnen 20 Mikroliter re-suspended-Zellen hinzu und lassen Sie die festen und permeabilisierten Zellen 30 Minuten lang anheften.

Waschen Sie die Brunnen dreimal mit 50 Mikroliter Waschpuffer, um nicht-haftende Zellen zu entfernen, und gehen Sie mit der Nähe Ligation Assay. Initiieren Sie den Proximity Ligation Assay oder PLA-Protokoll, indem Sie jedem Bohrloch einen Tropfen des Sperrpuffers hinzufügen und die Rutsche in einer feuchten Kammer 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Entfernen Sie den Sperrpuffer, indem Sie ein Tissuepapier am Rand jedes Brunnens platzieren, und waschen Sie die Zellen zweimal in 100 Milliliter Waschpuffer A. Nächster, fügen Sie 40 Mikroliter der primären Antikörperlösung zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Rutsche für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Kammer.

Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie die Dias zweimal im Waschpuffer A. Nach dem Waschen 40 Mikroliter der sekundären Antikörperlösung zu jedem Brunnen hinzufügen und das Dia 60 Minuten bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Kammer bebrüten. Dann entfernen Sie die Lösung und waschen Sie die Dias zweimal in Waschpuffer A.Dann fügen Sie 40 Mikroliter der DNA-Ligationsmischung, die den Stecker Oligonukleotide und DNA-Ligase enthält, zu jedem Brunnen, und inkubieren Sie die Rutsche in der feuchten Kammer bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Nach der Inkubation die Ligationsmischung entfernen und die Dias zweimal mit Waschpuffer A.Add 40 Mikroliter DNA-Verstärkungsmischung waschen, die die DNA-Polymerase und die fluoreszierend markierten Oligonukleotide zu jedem Brunnen enthält, und 100 Minuten in der feuchten Kammer bei 37 Grad Celsius brüten.

Entfernen Sie die Amplifikationsmischung und waschen Sie die Dias in 100 Milliliter Waschpuffer B für 10 Minuten pro Waschgang. Dann waschen Sie die Dias in 100 Milliliter Waschpuffer B verdünnt ein bis 100 in Reinstwasser. Fügen Sie 20 Mikroliter DAPI-haltiges Montagemedium pro Bohrgut hinzu.

Bedecken Sie die Brunnen der Rutsche mit einem Deckelschlupf und Versiegelung mit Nagellack. Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um transiente Chaperon-Assemblys zu überwachen, die zwischen verschiedenen J-Domänenproteinen und Hsp70-Chaperon- und J-Domänenproteinen in HeLa-, S.cerevisiae- und E.coli-Zellen gebildet wurden. Menschliche Proteine der Klasse A und der Klasse B J-Domain wurden mit hochspezifischen Primärantikörpern ins Visier genommen.

Jeder der roten fluoreszierenden Puncti stellt einen Proteinkomplex dar, der zwischen zwei unterschiedlichen J-Domänenproteinen in HeLa-Zellen gebildet wird. Ähnliche gemischte J-Domain-Proteinkomplexe werden auch in der einzelligen Eukaryote S.cerevisiae, oder Bäckerhefe beobachtet. Einige der von PLA erzeugten fluoreszierenden Puncti waren aufgrund der geringen Zellgröße schwieriger als einzelne Brennpunkte zu lösen.

Komplexe Bildung zwischen Klasse A und B J-Domänenproteinen wurde in E.coli-Zellen nicht beobachtet, was mit biochemischen Studien mit gereinigten Proteinen übereinstimmt. Aber andere Chaperon-Assemblys mit J-Domain-Proteinen und dem Hsp70-Chaperon wurden mit dem PLA-Protokoll erfasst. Technische Kontrollen ohne primärer Antikörper gegen eines der interagierenden J-Domänenproteine oder Chaperone in den ansonsten vollständigen PLA-Reaktionen zeigten in den Zellen wenig oder keine Fluoreszenz-Punkti-Bildung, was auf einen Mangel an falsch positiver Signalverstärkung hindeutet.

Um zuverlässige Ergebnisse mit dem Näherungsligationstest zu erhalten, überprüfen Sie vorab, ob die verwendeten Antikörper von ausreichender Qualität sind. Darüber hinaus vorsichtshalber, um eine Überverdauung von Zellen zu vermeiden, die eine Zellwand enthalten.