Name: Ubiquitin-Kettenanalyse durch Parallelreaktionsüberwachung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Erfahren Sie die Analyse von Ubiquitin-Ketten durch Parallelreaktionsüberwachung mittels Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht die spezifische Identifizierung und Quantifizierung von Ketten-Topologien in biologischen Proben.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren danken Céline Jeanty für ihre Unterstützung bei der Herstellung von Zellpellets mit DerBehandlung von MG-132, wie in den repräsentativen Ergebnissen beschrieben, und Elise Mommaerts für ihre Bereitstellung von E. coli Pellets, die im Protokoll verwendet werden.

1. Herstellung eines schweren Peptidstandards
<ol><li>Je nach Lieferant und Qualität der gekauften schweren Peptide müssen die schweren Peptide verdünnt werden. Dieses Protokoll verwendete die in Tabelle 1berichteten Peptidsequenzen, wobei die C-terminale Aminosäure zu Lysin (13C615N2-lysin) oder Arginin (13C615N4-arginin) modifiziert wurde.<ol>
<li>Mischen Sie die schweren Peptide, verdünnen Sie die Mischung mit 50% Acetonitril (ACN), um eine Peptidmischung mit jedem Peptid bei 10 M zu erstellen.</li>
		<li>Aliquots des Peptid-Mixes erstellen und bei -80 °C lagern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Probenvorbereitung
<ol><li>Beispiellyse HINWEIS: Die Stabilität von Ubiquitinketten muss bei der Probenvorbereitung berücksichtigt werden. Biologische Proben und Puffer bei 4 °C gekühlt aufbewahren und Proben so schnell wie möglich in den Ubiquitin-Stabilisierungspuffer aufnehmen.<ol>
<li>Bereiten Sie eine Lösung von 1 M NH4HCO3 (Ammoniumbicarbonat) in Wasser vor und stellen Sie den pH-Wert mit 1 M NaOH auf 8 ein.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Lösung von 200 mM N-Ethylmaleimid (NEM) in Wasser vor.</li>
		<li>Bereiten Sie den Ubiquitin-Stabilisierungspuffer mit 8 M Harnstoff in 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM vor. Ubiquitin-Stabilisierungspuffer muss jedes Mal frisch zubereitet werden. HINWEIS: Eine 5 ml Lösung von 8 M Harnstoff benötigt bei der Ausdehnung des Wassers in einer gesättigten Lösung mit Harnstoff deutlich weniger als 5 ml Wasser. VORSICHT: Bereiten Sie den Puffer nicht über 50 °C vor, da Harnstoff bei hohen Temperaturen zu Polyurea neigt.</li>
		<li>Setzen Sie die biologische Probe, die im Ubiquitin-Stabilisierungspuffer untersucht werden soll, mit dem Ziel von 0,5 g/l Protein, und limieren Sie die Zellen mit einer geeigneten Methode für die Probe. Für die Zelllinien in diesem Protokoll wurde eine Beschallungsmethode mit drei 10 s Impulsen mit einem SFX 150 Branson Sonifier mit 70% Intensität und 10 s Brüchen auf Eis zwischen jedem Puls verwendet.</li>
		<li>Zentrifugenprobe bei 18.000 x g für 10 min bei 4 °C in einer Tischzentrifuge.</li>
		<li>Überstand auf ein frisches, proteinarmes Mikrozentrifugenrohr übertragen. Proben können bei Bedarf bei -20 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung von Proben und Kontrollen
	<ol>
<li>Wenn die Proben eingefroren sind, mischen Sie (z.B. mit einem Thermomixer), während sie aufgetaut werden, um den Harnstoff schnell aufzulösen. VORSICHT: Verwenden Sie keine Temperaturen über 50 °C aufgrund der Tendenz von Harnstoff, Bei hohen Temperaturen Polyurea zu bilden.</li>
		<li>Zentrifugenprobe bei 18.000 x g für 10 min bei 4 °C in einer Tischzentrifuge.</li>
		<li>Übertragen Sie 20 g Probe in ein frisches, bindendes Mikrozentrifugenrohr und stellen Sie das Volumen mit dem Ubiquitin-Stabilisierungspuffer auf 50 l ein.</li>
		<li>Erstellen Sie einen negativen Kontrollwert mit einem normalisierten Volumen des Ubiquitin-Stabilisierungspuffers (50 l). In dieser Probe sollte keine leichte Version jedes Peptids vorhanden sein, so dass eine leichte Kontamination durch die spike-in schweren Peptide beobachtet werden kann. Diese negative Kontrolle wurde auch für die Aufbewahrungszeitplanung des in Abschnitt 3.1 beschriebenen PRM verwendet.</li>
		<li>Eine positive Steuerung wurde auch mit dem Ubiquitin-Stabilisierungspuffer und der Zugabe kommerziell erhältlicher Kettentypen zum normalisierten Volumen des Ubiquitin-Stabilisierungspuffers (50 l) geschaffen. Häufig sind K63, K48 und M1 verfügbar. In den repräsentativen Ergebnissen wurden 20 ng von K48, K63 und M1 verwendet.</li>
	</ol></li>
	<li>Reduktion, Alkylierung und Verdauung
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine Lösung von 50 mM Ammoniumbicarbonat (NH4HCO3) in Wasser vor und stellen Sie die Probe mit 1 M NaOH auf pH = 8 ein.</li>
		<li>Eine Kultur von E. coli, die in LB-Brühe angebaut wurde, wurde 5.000 x g für 5 min zentrifugiert, um ein Pellet zu bilden, das dann 2x mit PBS gewaschen wurde, bevor es im Ubiquitin-Stabilisierungspuffer bei 5 g/l wieder aufsuspension wurde.</li>
		<li>Fügen Sie jeder Probe und Kontrolle 1 g E. coli Lysat hinzu. Dieses Protokoll verwendet E. coli (DH10B), aber jedes komplexe Lysat ohne Ubiquitin kann verwendet werden. Beachten Sie, dass Ubiquitin allen Eukaryoten gemeinsam ist. HINWEIS: Die Verwendung einer E. coli Lysat-Matrix reduziert den Verlust von Peptiden aufgrund der unspezifischen Haftung an Kunststoffen. Dies ist besonders auffällig bei der Negativkontrolle oder bei Proben mit begrenztem Proteingehalt und hat einen starken Einfluss auf die Beobachtung von K6312.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Lösung aus 500 mM Tris(2-Carboxyethyl)phosphin (TCEP) in MS-Wasser (DTT kann als Alternative verwendet werden).</li>
		<li>Reduzieren Sie die Proben und Kontrollen durch Zugabe von TCEP auf eine Endkonzentration von 50 mM. Wirbel kurz vor der Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur (RT). Bei Verwendung von DTT muss die Temperatur auf 50 °C erhöht werden. VORSICHT: Verwenden Sie keine Temperaturen über 50 °C aufgrund der Tendenz von Harnstoff, Bei hohen Temperaturen Polyurea zu bilden.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Lösung von 550 mM Chloroacetamide (CAA) in NH4HCO3vor. Im Dunkeln lagern.</li>
		<li>Alkyliern Sie die Proben und Kontrollen, indem Sie CAA zu einer Endkonzentration von 55 mM hinzufügen. Wirbel kurz vor der Inkubation für 20 min bei RT im Dunkeln. HINWEIS: CAA wird anstelle von Iodoacetamid als Reduktionsmittel verwendet, um die Wahrscheinlichkeit einer doppelten Carbamidmethylmodifikation (114.0429) an einem Lysinrückstand zu verringern, der mit einer -GG-Modifikation verwechselt wird (114.0429)13.</li>
		<li>Fügen Sie endopeptidase LysC zu den Proben bei 1:25 (w/w) Verhältnis zum Proteingehalt hinzu. 3 h bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Proben und Kontrollen mit 200 l von 50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v).</li>
		<li>Fügen Sie Trypsin den Proben im Verhältnis 1:25 w/w zum Proteingehalt hinzu. 12 h bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie 10% Ameisensäure (FA) Lösung in MS-Grade-Wasser in einem Verhältnis von 1:10 v/v zu jeder Probe und Kontrollprobe hinzu. Überprüfen Sie, ob der pH-Wert <3) vor der C18-Bereinigung ist, und fügen Sie bei Bedarf weitere Ameisensäure hinzu.</li>
		<li>Zu jeder Probe und Kontrolle fügen Sie 0,5 l des schweren Peptidstandards hinzu, der in Abschnitt 1 erstellt wurde.</li>
	</ol></li>
	<li>Peptid-Reinigung
	<ol>
<li>Mehrere Hersteller bieten C18 Reinigungsspitzen oder Platten an. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für das verwendete Produkt und trockene eluierte Peptide in einer Vakuumzentrifuge, die für die MS-Analyse bereit ist.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analyse durch LC-MS/MS
<ol><li>Führen Sie eine erste PRM-Analyse auf den schweren Peptidstandard in einer ungeplanten Weise durch.<ol>
<li>Setzen Sie die getrockneten Proben in 10 l MS-Ladepuffer 2% ACN/0,05% Trifluoressigsäure (TFA) wieder auf.</li>
		<li>Rüsten Sie einen HPLC mit einer Analysesäule der Kehrphase C18 (75 x 15 cm, 2 m 100 c18 Perlen) für Nanofluss MS aus. Bilden Sie lineare Gradienten, die MS-Wasser austauschen, ergänzt mit 0,1% FA mit ACN mit 0,1% FA. Hier wurde eine Opferfalle-Säule (75 x 2 cm, 3 m, 100 c18 Perlen) verwendet, um die Lebensdauer der analytischen Säule zu erhalten, ist aber nicht erforderlich.</li>
		<li>Koppeln Sie die Ausgabe der analytischen Säule mit einer Nano-ESI-Quelle auf einem hochauflösenden Massenspektrometer.</li>
		<li>Verwenden Sie eine geeignete gezielte Proteomik-Methode für das Massenspektrometer. Beispiel: Bei einer Q-Exactive plus einer Zwei-Experiment-Methode zwischen einem Full MS und einem PRM-Experiment. Für das Full MS-Experiment wurde eine Auflösung von 120.000 mit einem AGC-Ziel von 1e6 und 240 ms als Maximale IT verwendet. Für das PRM-Experiment wurde das gleiche AGC-Ziel und die maximale IT mit einer niedrigeren Auflösung von 60.000 und einem Isolationsfenster von 1,2 m/z verwendet.</li>
		<li>Mit dem HPLC-Autosampler 200 ng der Negativkontrolle in die analytische Säule injizieren. Wenden Sie einen linearen Gradienten auf die Probe auf die analytische Spalte an, wodurch die ACN-Konzentration über einen Zeitraum von 45 min von 2–25 % erhöht wird. HINWEIS: Die 25% ACN-Konzentration ist niedriger als üblich für Proteomik aufgrund der geringen hydrophilen Natur der typischen Ubiquitin-Topologie-charakteristischen Peptide. Wenn andere Peptide quantifiziert werden sollen, kann eine höhere ACN-Konzentration gewünscht werden, um eine gute Zieltrennung zu erreichen.</li>
		<li>Analysieren Sie die Ergebnisse des Planungslaufs wie in Abschnitt 4.2 beschrieben, um eine Liste mit geplanter Einschlussaufnahme zu erstellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse der Proben<ol>
<li>Führen Sie die verbleibenden Beispiele, wie für die Planung in 3.1 beschrieben, aus, abgesehen von der Verwendung der in Abschnitt 4.2 erstellten Liste für geplante Einschlusse. HINWEIS: Nach dem Positivsteuerelement muss ein Leerzeichen ausgeführt werden, um sicherzustellen, dass in nachfolgenden Stichproben keine Übertragung vom vorherigen Lauf erkannt wird.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Softwareanalyse
<ol><li>Erstellen Sie eine Einschlussliste mit geeigneten Formatierungen für die verwendete MS. Dieses Protokoll verwendet die Open-Source-Software Skyline (Version 19.1.0.193) (https://skyline.ms), die gut dokumentierte Unterstützung und Hilfe bietet. Mithilfe der Exportisolationslistenfunktion kann eine Einschlussliste für mehrere Massenspektrometer erstellt werden.<ol>
<li>Öffnen Sie ein neues Skyline-Dokument.</li>
		<li>Wählen Sie schwere Isotopenmodifikationen entsprechend schweren Topologie-charakteristischen Peptiden aus. In den Einstellungen| Peptideinstellungen unter der Registerkarte Änderung, klicken Sie auf das Namensfeld, um die mögliche Änderung zu sehen. Die Auswahl basiert auf dem Isotopenzustand der gekauften schweren Peptide. In diesem Beispiel wurden synthetische Peptide verwendet, die entweder ein schweres Lysin (13C615N2-lysin) oder ein schweres Arginin (13C615N4-arginin) am C-Terminus trugen. Geeignete Bezeichnungen wären: "Label:13C(6)15N(2) (C-term K)" und "Label:13C(6)15N(4) (C-term R)".</li>
		<li>Wählen Sie Einstellungen aus| Übergang. Unter der Registerkarte Filter enthalten Precursor Charges 2, 3, 4.</li>
		<li>Peptide einfügen, indem Sie Bearbeiten auswählen| Einfügen| Peptide.</li>
		<li>Füllen Sie die relevanten Felder einschließlich der topologie-charakteristischen Peptidsequenz und eines Proteinnamens (z. B. "Chain–K63") aus.</li>
		<li>Erweitern Sie jedes Peptid, das jetzt im Bedienfeld "Ziele" angezeigt wird. Löschen Sie unerwünschte Ladezustände. Der bevorzugte Ladezustand und die Kollisionsenergie, die je nach verwendetem Massenspektrometer unterschiedlich sein können, ist für jedes topologiecharakteristische Peptid in Tabelle 1dargestellt.</li>
		<li>Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Sequenz und wählen Sie Ändern. Fügen Sie ein GG als strukturelle Änderung hinzu, indem Sie auf das Namensfeld klicken und <Alle anzeigenauswählen ... > bevor Sie "GlyGly (K)" auswählen.</li>
		<li>Exportieren Sie die Isolationsliste Datei| Export| Isolationsliste, wählen Sie den Instrumententyp aus, und legen Sie den Methodentyp auf Standardfest. Wenn Sie OK auswählen, wird eine Eingabeaufforderung zum Speichern einer *.csv Datei geöffnet, die zum Erstellen einer PRM-Methode verwendet werden kann.</li>
	</ol></li>
	<li>Erstellen Sie eine geplante Inklusionsliste basierend auf einem schweren Peptid-Scheduling-Lauf, der hier mit der Open-Source-Skyline-Software erläutert wird.<ol>
<li>Erstellen Sie eine Zielliste, wie in Abschnitt 4.1 beschrieben.</li>
		<li>Importieren Sie den Planungslauf in 3.1, indem Sie Datei auswählen| Import| Ergebnisse.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Kennungen. Das schwere Signal für jedes Peptid ist beobachtbar, indem man auf die Masse für jeden schweren Peptideintrag klickt. Die korrekte Erkennung der Spitze wird oft automatisch bestimmt, aber die Software kann eine manuelle Kuration erfordern, indem Sie die Spitze per Klick und Ziehen unter der x-Achse auswählen.</li>
		<li>Retentionszeiten, die für die schweren Varianten ausgewählt wurden, werden auch auf die Lichtversionen angewendet, wodurch ein Zeitplan für das PRM erstellt wird. Das Planungsfenster kann unter Einstellungen geändert werden| Peptideinstellungen mithilfe der Registerkarte Vorhersage, indem Sie das Zeitfensterändern.</li>
		<li>Eine geplante Einschlussliste kann nun mit File exportiert werden| Export| Isolationsliste und Auswahl des entsprechenden Instrumententyps und Einstellungsmethodentyps auf Geplant.</li>
	</ol></li>
	<li>Analysieren Sie die Daten.<ol>
<li>Importieren Sie die Stichproben auf die gleiche Weise wie für die Planungslaufanalyse in Abschnitt 4.2.</li>
		<li>Nach dem vollständigen Import aller Proben wird die Kuration der Übergänge empfohlen. Dies ist der Prozess, durch den Übergänge mit Interferenzen oder schlechten Signal-Rausch-Verhältnissen entfernt werden. Ein Beispiel für ein Chromatogramm vor und nach der Kuration ist in Abbildung 4dargestellt.</li>
		<li>Die Daten können nun entweder exportiert werden, indem Sie mit der rechten Maustaste auf relevante Diagramme klicken und Daten kopieren auswählen oder indem Sie Datei auswählen| Export| Ergebnisse.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+post-translational+modification+statistics%3A+frequency+analysis+and+curation+of+the+swiss-prot+database%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database.</a> Scientific Reports. 1, 90(2011).</li>
<li>Goldstein, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+polypeptide+that+has+lymphocyte-differentiating+properties+and+is+probably+represented+universally+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).</li>
<li>Glickman, M. H., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway%3A+Destruction+for+the+sake+of+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction.</a> Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).</li>
<li>Pickart, C. M., Eddins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin%3A+structures%2C+functions%2C+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin: structures, functions, mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1695 (1-3), 55-72 (2004).</li>
<li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li>
<li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ubiquitin+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li>
<li>Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Ubiquitin+Binders+to+Decipher+the+Ubiquitin+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).</li>
<li>Newton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+chain+editing+revealed+by+polyubiquitin+linkage-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies.</a> Cell. 134 (4), 668-678 (2008).</li>
<li>Spence, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-regulated+modification+of+the+ribosome+by+a+variant+multiubiquitin+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain.</a> Cell. 102 (1), 67-76 (2000).</li>
<li>Borràs, E., Sabidó, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+targeted+proteomics%3F+A+concise+revision+of+targeted+acquisition+and+targeted+data+analysis+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry.</a> PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).</li>
<li>Lesur, A., Domon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+high-resolution+accurate+mass+spectrometry+application+to+targeted+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics.</a> PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).</li>
<li>Longworth, J., Dittmar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Ubiquitin+Chain+Topology+by+Targeted+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1977, Clifton, N.J. 25-34 (2019).</li>
<li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li>
<li>Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+the+proteasome+reduce+the+accelerated+proteolysis+in+atrophying+rat+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Collision+Energy+Optimization+on+the+Measurement+of+Peptides+by+Selected+Reaction+Monitoring+%28SRM%29+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Die Analyse des Ubiquitinzustandes innerhalb eines Proteoms gewinnt für eine Vielzahl biologischer Fragen zunehmend an Bedeutung. Die Beschreibung des Ubiquitinationszustands einer Probe muss sich nicht nur auf das Profil der ubiquitinierten Proteine konzentrieren, sondern auch auf die Topologie einer solchen Ubiquitination. Die Bewertung dieser Topologie durch gezielte MS, wie hier beschrieben, spielt eine Rolle in einer Vielzahl biologischer Untersuchungen.
Es sollte verstanden werden, dass ...

Die enge Regulierung der Proteinfunktion und -stabilität ist von größter Bedeutung, da sie wichtige Treiber der phätotypischen Kontrolle der Biologie sind. Die Funktion eines Proteins besteht aus zwei Komponenten: seiner intrinsischen Polypeptidsequenz und allen posttranslationalen Modifikationen (PTMs). Verschiedene chemische PTMs wurden identifiziert, einschließlich Glykosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung und Methylierung1. 1975 identifizierten Goldstein et al.2 ein kleines Protein und nannten es aufgrund seiner allgegenwärtigen Natur Ubiquitin. Ubiquitin erwies sich als wichtig für den Proteinabbau3. Seitdem steht jedoch fest, dass die Funktion von Ubiquitin als Signalmolekül weit über die Regulierung der Proteinstabilität hinausgeht. Ubiquitin Signalisierung ist in einer Vielzahl von anderen biologischen Funktionen beteiligt, wie Proteinstabilisierung, Autophagie, Zellzykluskontrolle, und Proteinhandel4.
Während andere PTMs im Allgemeinen binär sind (d. h., das Protein wird modifiziert oder unverändert gelassen) für eine bestimmte Stelle, kann Ubiquitin ein Protein sowohl als Monomer oder als polymere Kette modifizieren, wobei das angefügte Ubiquitin selbst ubiquitiniert ist. Darüber hinaus kann sich diese Polyubiquitinationskette in mehreren Topologien mit der Ubiquitination des vorherigen Ubiquitins entwickeln, das an einer von acht Verknüpfungsstellen5,6anhängt. Ubiquitin wird durch einen mehrstufigen enzymatischen Prozess übertragen (Abbildung 1), bei dem der C-Terminus von Ubiquitin mit einem seiner sieben Lysinrückstände (K06, K11, K27, K29, K33, K48 oder K63) oder dem N-Terminal des vorherigen Ubiquitins (als M1 oder lineare Ubiquitination bezeichnet)5,6verbunden ist. Diese Kettentopologie ist der Schlüssel zum Schicksal des Proteins, das verändert wird. Beispielsweise führt die Modifikation mit einer K48 oder K11-Verbindungskette zum Abbau des modifizierten Proteins am Proteasom, während eine lineare Kette für die Aktivierung der NF-kB-Signalisierung notwendig ist. Daher ist die relative Verteilung dieser Kettentopologien für eine Vielzahl biologischer Fragen relevant.
Die Verwendung der Massenspektrometrie (MS) ist von besonderem Nutzen für die Analyse der Ubiquitin-Kettentopologie, da sie nicht auf antikörperbasierte oder affinitätsbasierte Wechselwirkungen7,8angewiesen ist, von denen viele eine begrenzte Spezifität aufweisen und nicht zwischen den verschiedenen Kettentypen unterscheiden. Eine andere Nachweismöglichkeit besteht darin, genetisch veränderte Ubiquitin-Mutationen zu verwenden. Hier wird ein bestimmtes Lysin gegen Arginin ausgetauscht, das die Modifikation durch Ubiquitin nicht unterstützen kann. Der Mangel an Ubiquitin-Kettenbildung auf dem Substratprotein wird dann als Beweis für eine spezifische Topologieinterpretiert 9.
Die MS-basierte Identifizierung ubiquitinierter Proteine basiert auf der Tatsache, dass der C-Terminus von Ubiquitin einen Argininrückstand in Position 74 enthält, der von Trypsin während der proteolytischen Vorbereitung der Proben für die MS-Analyse erkannt wird und das C-terminale Doppelglycin trennt. Dieses GlyGly (-GG) bleibt an der ε-Amino-Gruppe des Lysinrückstands des Substratproteins befestigt. Für die Ubiquitin-Topologie-Analyse erfolgt die Modifikation an einem der sieben Lysinrückstände von Ubiquitin. Dadurch wird ein Satz von sieben Schlüsselpeptiden erstellt, die einen Lysinrückstand tragen, der durch GG modifiziert wird, spezifisch für jede der Topologien (Abbildung 2). Bei der K06-Topologie wird beispielsweise das Lysin an Position 6 der Aminosäuresequenz mit einer -GG-Modifikation von 114 Da, die diesem Lysin zugesetzt wird, vor tryptischer Verdauung geschützt.
Die Identifizierung spezifischer vorbestimmter Peptide durch MS wird als gezielte Proteomik oder genauer gesagt als gezielte Peptidakquise10bezeichnet. Je nach Leistung des verwendeten Massenspektrometers wurden zwei Methoden entwickelt. Dabei handelt es sich um ausgewählte Reaktionsüberwachung (SRM), auch als Multiple Reaction Monitoring (MRM) und als parallele Reaktionsüberwachung (PRM) bezeichnet. SRM umfasst die Auswahl von Übergängen, die aus dem Vorläufer m/z und dem Produkt ion m/z bestehen. Umgekehrt benötigt PRM nur den Vorläufer m/z. Nach der Auswahl wird ein vollständiger Vermessungscan der Produktionen durchgeführt. Dies hat den Vorteil, dass vor der Messung11keine Auswahl geeigneter Produktionen zur Quantifizierung auf dem spezifischen Massenspektrometer erforderlich ist. Sowohl SRM als auch PRM können je nach Instrument geplant werden. Die Terminplanung ist die Praxis der Zuweisung eines Zeitfensters, in dem ein bestimmtes Ion zur Analyse einbezogen wird, da Peptide zu definierten Retentionszeiten aus dem chromatographischen System eluieren. Die Verringerung der Anzahl der zu einem bestimmten Zeitpunkt verhörten Ionen erhöht die Häufigkeit der Abfrage der zu diesem Zeitpunkt geplanten Ionen und verbessert so die Datengenauigkeit.
Im Allgemeinen ist die Anwendung der gezielten Proteomik für die Ubiquitin-Topologie die gleiche wie bei jedem anderen gezielten Proteomik-Experiment. Zwei wesentliche Unterschiede sind jedoch wichtig: Erstens muss die Stabilität von Ubiquitinketten berücksichtigt werden. Es gibt mehrere potente deubiquitinierende Enzyme (DUBs), die Ketten bei der Zelllyse schnell abbauen. Die ubiquitinspezifischen Proteasen lassen sich in zwei Kategorien einteilen: die Thioesterasen und die Metalloproteasen. Die meisten Der Ubiquitin-Hydrolasen sind Thioesterasen und tragen einen Cystein-Rückstand in ihrem aktiven Zentrum. Durch Alkylierung dieses Cysteinrückstandes können sie inaktiviert werden. Daher ist die Verwendung von Ubiquitin-Stabilisierungspuffern, die Alkylierungsmittel wie N-Ethylmaleimid (NEM) und hochdenaturierende Chemikalien enthalten, und die Kühlung von Proben von entscheidender Bedeutung für eine erfolgreiche Analyse. Zweitens ist die Peptidauswahl im Gegensatz zu anderen gezielten Experimenten fixiert. In einem typischen gezielten Experiment kann ein proteotypisches Peptid für eine gute chromatographische und ionisationsleistung ausgewählt werden. Für einige Topologie-charakteristische Peptide wie K48 sind diese Eigenschaften gut, während sie für andere weniger wünschenswert sind. Beispielsweise ist die K33-Chromatographie in einem typischen Reverse-Phase-Setup aufgrund der Bildung eines gestreckten Elutionsprofils schlecht, und die schlechten Ionisationseigenschaften des K27-Peptids reduzieren seine Sichtbarkeit um MS12.
In diesem Protokoll beschreiben wir, wie die Ubiquitin-Topologie-Bewertung einer biologischen Probe durch PRM durchgeführt wird. Beispieldaten für das Verfahren werden mit einer Störung des Proteasommittels mittels MG-132-Inhibitorbehandlung in verschiedenen Zelltypen dargestellt.

<table><tbody><tr><td>Acetonitril (ACN)</td><td>Merck</td><td>100029</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat (ABC)</td><td>Fluka</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Mikrofuge 16</td><td></td></tr><tr><td>Chloracetamid (CAA)</td><td>Sigma</td><td>22790</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure (FA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85178</td><td></td></tr><tr><td>Schwere Peptide</td><td>JPT Peptide Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Dionex</td><td>Ulitimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>LC Säule</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160321</td><td></td></tr><tr><td>Lys C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>Massenspektrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q-Exactive Plus</td><td></td></tr><tr><td>N-Ethylmaleimid (NEM)</td><td>ACROS Organics</td><td>156100050</td><td></td></tr><tr><td>Positive Kontrollkette K48</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-240</td><td></td></tr><tr><td>Positive Kontrollkette K63</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-340-100</td><td></td></tr><tr><td>Positive Kontrollkette M1</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-710B-025</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sonifikator</td><td>Branson Sonifikator</td><td>SFX 150</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure (TFA)</td><td>Sigam</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V1511A</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Sigma</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Wasser & mu; Elution C18 Platten</td><td>Wasser</td><td>186002318</td><td></td></tr></tbody></table>

ubiquitin-kettenanalyse durch parallelreaktionsüberwachung

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Die Bewertung des globalen Profils von Ubiquitin-Kettentopologien innerhalb eines Proteoms ist von Interesse, um eine Vielzahl biologischer Fragen zu beantworten. Das hier skizzierte Protokoll nutzt die Di-Glylyin-Modifikation (-GG), die nach der tryptischen Verdauung von Ubiquitin in einer Kette zurückgelassen wurde. Durch quantifizieren diese topologie-charakteristischen Peptide kann die relative Häufigkeit jeder Ubiquitin-Kettentopologie bestimmt werden. Die Schritte, die erforderlich sind, um diese Peptide durch ein paralleles Reaktionsüberwachungsexperiment zu quantifizieren, werden unter Berücksichtigung der Stabilisierung von Ubiquitinketten berichtet. Die Vorbereitung von schweren Kontrollen, Zelllyse und Verdauung werden zusammen mit dem entsprechenden Massenspektrometer-Setup und Datenanalyse-Workflow beschrieben. Ein Beispieldatensatz mit Störungen in der Ubiquitin-Topologie wird vorgestellt, begleitet von Beispielen, wie sich die Optimierung des Protokolls auf die Ergebnisse auswirken kann. Durch Befolgen der beschriebenen Schritte kann ein Benutzer eine globale Bewertung der Ubiquitin-Topologie-Landschaft in seinem biologischen Kontext durchführen.

Um die Verwendung einer Ubiquitin-Kettenanalyse durch PRM zu demonstrieren, wurden drei Zelllinien ausgewählt: eine Mausmelanom-Zelllinie B16 und die beiden gemeinsamen menschlichen Zelllinien A549 (adenokarcinomische alveolische Alveolar-Basthelialzellen) und HeLa (Gebärmutterhalskrebszellen). Diese Kulturen wuchsen bis zur midexponentiellen Phase in geeigneten Medien, bevor sie mit 0, 10 oder 100 mM MG-132 für 4 h vor der Ernte behandelt wurden. MG-132 ist ein Proteasomen-Inhibitor, der den Abbau von ubiquitinkonjugier...

Diese Methode beschreibt die Bewertung globaler Veränderungen in der Ubiquitin-Kettentopologie. Die Bewertung erfolgt durch die Anwendung eines auf Massenspektrometrie basierenden zielgerichteten Proteomik-Ansatzes.

Ubiquitin-Kettenanalyse durch Parallelreaktionsüberwachung

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Da unterschiedliche Ubiquitin-Kettentopologien ein breites Spektrum an biologischen Effekten haben, ist das Verständnis von Veränderungen in ihrer Häufigkeit für eine Vielzahl biologischer Zustände relevant. Die Anwendung des parallelen Reaktionsmonitorings auf die Ubiquitinkettenanalyse ermöglicht die spezifische Identifizierung und Quantifizierung der Ubiquitinkettentopologien. Im Gegensatz zu typischen PRM-Experimenten ist die Analyse der Ubiquitinkettentopologie auf spezifische modifizierte Peptide beschränkt, von denen viele nicht ideal für die MS-Analyse sind.Die visuelle Demonstration dieser Technik zeigt die Anpassungen und die erwarteten Ergebnisse, die für diese nicht idealen Peptide beobachtet wurden. Beginnen Sie mit der Herstellung einer Ammoniumbicarbonatlösung, einer n-Ethylmaleimidlösung und eines Ubiquitin-Stabilisierungspuffers, wie im Textmanuskript beschrieben. Resuspendieren Sie die biologische Probe im Ubiquitin-Stabilisierungspuffer und lysieren Sie die Zellen mit einer geeigneten Methode.Nach der Zelllyse zentrifugieren Sie die Probe bei 18.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und überführen den Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung. Falls erforderlich, lagern Sie die Proben bei minus 20 Grad Celsius, bevor Sie fortfahren. Um die Proben aufzutauen, mischen Sie sie schnell mit einem ThermoMixer und verwenden Sie keine Temperaturen über 50 Grad Celsius.Nach dem Auftauen zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 18.000 G bei vier Grad Celsius und überführen Sie 20 Mikrogramm in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung, dann stellen Sie das Volumen auf 50 Mikroliter mit Ubiquitin-Stabilisierungspuffer ein. Bereiten Sie eine Negativkontrolle mit einem normierten Volumen Ubiquitin-Stabilisierungspuffer und eine Positivkontrolle mit dem Puffer und handelsüblichen Kettentypen vor. Bereiten Sie eine Lösung von 50 millimolaren Ammoniumbicarbonat in Wasser vor und stellen Sie den pH-Wert mit einem molaren Natriumhydroxid auf acht ein.Pelletieren Sie eine E.coli-Kultur durch Zentrifugation bei 5.000-fachem G für fünf Minuten. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und resuspendieren Sie sie in Ubiquitin-Stabilisierungspuffer bei fünf Mikrogramm pro Milliliter. Geben Sie ein Mikrogramm E.coli-Lysat zu jeder Probe und kontrollieren Sie.Bereiten Sie dann 500 Millimolar TCEP in MS Grade Wasser vor und fügen Sie es jeder Probe bis zu einer Endkonzentration von 50 Millimolar hinzu. Die Proben kurz vortexen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes wird eine Lösung aus 500 Millimolar Chloracetaldehyd und Ammoniumbicarbonat hergestellt und bis zu einer Endkonzentration von 55 Millimolar zu den Proben und Kontrollen gegeben.Die Proben kurz vortexen und 20 Minuten im Dunkeln inkubieren. Geben Sie Endopeptidase Lys-C in die Proben und inkubieren Sie sie drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation verdünnen Sie die Proben mit 200 Mikrolitern 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat, fügen Sie Trypsin hinzu und inkubieren Sie sie weitere 12 Stunden lang.Am nächsten Tag wird jeder Probe 10 %ige Ameisensäurelösung zugegeben und in einem Volumen-Volumen-Verhältnis von 1:10 kontrolliert. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert kleiner als drei ist. Geben Sie dann 0,5 Mikroliter schweren Peptidstandard zu jeder Probe.Fahren Sie nach der standardmäßigen C18-Probenaufreinigung mit der massenspektrometrischen Analyse der Proben mit einer PRM-basierten Methode fort. Um die Isolationsliste zu exportieren, wählen Sie im Exportmenü die Option Isolationsliste aus, wählen Sie den Gerätetyp aus und stellen Sie die Methode auf Standard ein. Klicken Sie auf OK, um eine Eingabeaufforderung zum Speichern einer CSV-Datei zu öffnen, die zum Erstellen einer PRM-Methode verwendet werden kann.Importieren Sie als Nächstes den Planungslauf, indem Sie Datei, Importieren und Ergebnisse auswählen. Wählen Sie mehrere Dateien aus, die gleichzeitig importiert werden sollen, und klicken Sie auf OK, wählen Sie dann die Dateien aus und warten Sie, bis der Import abgeschlossen ist. Wenn Sie fertig sind, überprüfen Sie die Identifikationen, indem Sie auf die Masse für jeden schweren Peptideintrag klicken.Die korrekte Erkennung des Peaks wird oft automatisch ermittelt, aber es kann eine manuelle Kuration erforderlich sein. Die für die schweren Varianten ausgewählten Aufbewahrungszeiten werden auch auf die leichten Versionen angewendet, wodurch ein Zeitplan für das PRM erstellt wird. Um das Planungsfenster zu ändern, wählen Sie den Peak aus und klicken Sie auf Einstellungen und Peptideinstellungen.Ändern Sie dann das Zeitfenster auf der Registerkarte Vorhersage. Die Einschlussliste des Zeitplans kann dann mit Datei, Exportieren und Isolationsliste exportiert werden. Wählen Sie den geeigneten Gerätetyp aus, stellen Sie den Methodentyp auf geplant ein und klicken Sie auf OK.To die Daten zu analysieren, alle Proben zu importieren und eine Kuration durchzuführen, Übergänge mit Interferenzen oder schlechten Signal-Rausch-Verhältnissen zu entfernen, und exportieren Sie dann die Daten, indem Sie entweder mit der rechten Maustaste auf die entsprechenden Diagramme klicken und Daten kopieren auswählen oder auf Datei, Exportieren und Bericht klicken.Die Behandlung mit dem Proteasom-Inhibitor MG-132 verhindert den Abbau von Ubiquitin-konjugierten Proteinen, was zu einer Erhöhung der K48-Kette in der Maus-Melanomzelllinie B16 sowie in den beiden humanen Zelllinien A549 und HeLa führt. Die parallele Reaktionsüberwachung (PRM) führt nach der Auswahl des Vorläuferions einen vollständigen Produktionenscan durch, was bedeutet, dass die Produktionen nach dem Lauf kuratiert werden sollten. Das Chromatogramm für K48 wird vor und nach der Kuration gezeigt.Produktionen, die ein Signal mit einem inkonsistenten Elutionsprofil und geringer Intensität aufweisen, wurden entfernt. Der während der Kuration ausgewählte Übergang sollte zwischen den Experimenten konsistent sein, kann jedoch je nach chromatographischen Bedingungen, Analyseeinstellungen und dem biologischen Hintergrund der Probe unterschiedlich sein. Hier sind typische Produktionenchromatogramme für jede der in diesem Experiment identifizierten Ubiquitinkettentopologien zu sehen.Bei der Planung eines PRM-Experiments kann die Kollisionsenergie optimiert werden, um das Signal zu verbessern. Bei Anwendung von Kollisionsenergien von 14 bis 28 zeigte sich, dass eine höhere Kollisionsenergie von 26 für K63 optimal war, während eine niedrigere Energie von 18 ideal für M1 war. In diesem Experiment wurden günstige Kollisionsenergien für die topologiecharakteristischen Peptide und eine Auswahl unmodifizierter Ubiquitin-Fragmente gefunden, die jedoch möglicherweise auf der Grundlage des verwendeten Massenspektrometers und der verwendeten Fragmentierungsmethode optimiert werden müssen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass für die Analyse der Ubiquitin-Kette ein Gleichgewicht der Bedingungen geschaffen werden muss, um sicherzustellen, dass die Ubiquitin-Kettenbindungen erhalten bleiben und gleichzeitig ihre Verdauung in Peptide gefördert wird.Diese Methode ist für das Verständnis der Ubiquitin-Signalgebung von entscheidender Bedeutung, da sie eine genaue Quantifizierung der Ubiquitin-Kettentopologie ermöglicht. Sie könnte mit einem Pull-down- oder einer Organellenfraktionierung kombiniert werden, um zu ermitteln, welche Ubiquitin-Kettentopologie mit der Zielproteinprobe assoziiert ist.

ubiquitin-chain-analysis-by-parallel-reaction-monitoring

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Ubiquitinierung ist ein wichtiger posttranslationale Modifikation durch eine Gruppe von drei Enzymen durchgeführt. Mutationen von Genen in dieser Modifikation beteiligt sind mit vielen verschiedenen menschlichen Krankheiten assoziiert. Hier beschreiben wir Protokolle, um Protein-Ubiquitinierung in kultivierten Zellen...

Detektion von Protein Ubiquitination

Dieses Video beschreibt eine Methode zur Extraktion und Reinigung von ubiquitinylierten Peptiden, die Reste von Diglycin-Peptiden aus einer komplexen Peptidmischung enthalten. Das vorgestellte Verfahren kann dabei helfen, ursprüngliche Ubiquitinierungsstellen im Protein zu identifizieren.

Immunaffinitätsbasierte Extraktion von ubiquitinylierten Peptiden: Eine Technik zur selektiven Extraktion von Ubiquitin-markierten Peptiden aus gereinigten Peptidfraktionen

Auf den aktuellen Protokollinformationen ein Verfahren zur Messung der Aktivität der funktionell homolog Deubiquitinierungsenzyme. Specialized-Sonden, die das Enzym kovalent modifizieren und lassen für die Erkennung. Dieses Verfahren hält das Potenzial, neue therapeutische Targets zu identifizieren.

Verfahren zur Messung der Aktivität von Deubiquitinierungsenzyme in Zelllinien und Gewebeproben

Wir präsentieren eine Methode zur Reinigung, Detektion und Identifizierung von diGly Peptiden, die aus ubiquitinierten Proteinen aus komplexen biologischen Proben stammen. Die vorgestellte Methode ist reproduzierbar, robust und übertrifft die veröffentlichten Methoden in Bezug auf den Grad der Tiefe der Ubiquitinom-Analyse.

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Aktivität des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) in verschiedenen zellulären Kompartimenten des Nagetierhirns effizient zu quantifizieren. Anwender sind in der Lage, die USB-Funktion in nuklearen, zytoplasmatischen und synaptischen Fraktionen bei demselben Tier zu untersuchen, wodurch die Zeit und Anzahl der Tiere, die für die Durchführung dieser komplexen Analysen benötigt werden, reduziert wird.

Quantifizierung subzellulärer Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Nagetierhirn

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Ubiquitin (Ub) und Ubiquitin-Likes (Ubls) spezifische Proteome zu etablieren, um Änderungen dieser Art von post-translationalen Modifikationen (PTMs) zu identifizieren, die mit einer bestimmten Erkrankung wie einer Behandlung oder einem Phänotyp verbunden sind.

Profilierung von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen abhängigen posttranslationalen Änderungen und Identifizierung signifikanter Änderungen

Die vorliegende Studie liefert detaillierte In-vitro-Ubiquitylierungs-Assay-Protokolle für die Analyse der katalytischen Aktivität der E3-Ubiquitin-Ligase.  Rekombinante Proteine wurden mit prokaryotischen Systemen wie der Escherichia coli-Kultur exprimiert.

In vitro Analyse der E3-Ubiquitin-Ligase-Funktion

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für einen Ubiquitylierungsassay eines spezifischen Substrats und einer E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzellen. HEK293T-Zelllinien wurden zur Proteinüberexpression verwendet, das polyubiquitylierte Substrat wurde durch Immunpräzipitation von Zelllysaten gereinigt und in SDS-PAGE aufgelöst. Immunoblotting wurde verwendet, um diese posttranslationale Modifikation zu visualisieren.

Evaluierung der Substratubiquitylierung mittels E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzelllysaten

In diesem Protokoll wird erläutert, wie die Wirkung genetischer Variation, die mit neurologischen Entwicklungsstörungen verbunden ist, auf die deubiquitylierende Enzymaktivität gemessen werden kann, indem die rekombinante Proteinreinigung mit Ubiquitin-Kettenspaltungsassays kombiniert wird.

Messung der enzymatischen Aktivität von Enzymen, die mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziiert sind, mittels eines in vitro Ubiquitin-Kettenspaltungsassays

Das hier verwendete Experiment zeigt eine Methode des molekularen Andockens in Kombination mit Sondentechnologien, um die Interaktion zwischen kleinen Molekülen der traditionellen chinesischen Medizin und Proteinzielen vorherzusagen und zu validieren.

Screening von Wirkstoffen der traditionellen chinesischen Medizin zur Hemmung der UCHL3-Aktivität basierend auf molekularer Docking- und Deubiquitinierungsenzymsondentechnologie

Ubiquitination ist ein entscheidender Regulator der intrazellulären Proteinfunktionen. Hier beschreiben wir zwei Zelllysemethoden zur Erkennung der Substratprotein-Ubiquitinationswerte in Säugetierzellen und vergleichen deren Wirksamkeit bei der Analyse von Ubiquitinationsniveaus. Die Proteinüberexpression in HEK293T Zellen wurde durch vorübergehende Transfektion induziert, und ubiquitinierte Proteine wurden durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen.

Vergleichende Strategien zur Nachweisung der Uquitination in Säugetierzelllysaten unter Verwendung von SMAD2/SMURF2 als Modell

Erfahren Sie die Analyse von Ubiquitin-Ketten durch Parallelreaktionsüberwachung mittels Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht die spezifische Identifizierung und Quantifizierung von Ketten-Topologien in biologischen Proben.

Ubiquitin-Kettenanalyse durch Parallelreaktionsüberwachung

Weitere Videos entdecken