Ubiquitin-Kettenanalyse durch Parallelreaktionsüberwachung

Diese Methode beschreibt die Bewertung globaler Veränderungen in der Ubiquitin-Kettentopologie. Die Bewertung erfolgt durch die Anwendung eines auf Massenspektrometrie basierenden zielgerichteten Proteomik-Ansatzes.

Da unterschiedliche Ubiquitin-Kettentopologien ein breites Spektrum an biologischen Effekten haben, ist das Verständnis von Veränderungen in ihrer Häufigkeit für eine Vielzahl biologischer Zustände relevant. Die Anwendung des parallelen Reaktionsmonitorings auf die Ubiquitinkettenanalyse ermöglicht die spezifische Identifizierung und Quantifizierung der Ubiquitinkettentopologien. Im Gegensatz zu typischen PRM-Experimenten ist die Analyse der Ubiquitinkettentopologie auf spezifische modifizierte Peptide beschränkt, von denen viele nicht ideal für die MS-Analyse sind.

visuelle Demonstration dieser Technik zeigt die Anpassungen und die erwarteten Ergebnisse, die für diese nicht idealen Peptide beobachtet wurden. Beginnen Sie mit der Herstellung einer Ammoniumbicarbonatlösung, einer n-Ethylmaleimidlösung und eines Ubiquitin-Stabilisierungspuffers, wie im Textmanuskript beschrieben. Resuspendieren Sie die biologische Probe im Ubiquitin-Stabilisierungspuffer und lysieren Sie die Zellen mit einer geeigneten Methode.

Nach der Zelllyse zentrifugieren Sie die Probe bei 18.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und überführen den Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung. Falls erforderlich, lagern Sie die Proben bei minus 20 Grad Celsius, bevor Sie fortfahren. Um die Proben aufzutauen, mischen Sie sie schnell mit einem ThermoMixer und verwenden Sie keine Temperaturen über 50 Grad Celsius.

Nach dem Auftauen zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 18.000 G bei vier Grad Celsius und überführen Sie 20 Mikrogramm in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung, dann stellen Sie das Volumen auf 50 Mikroliter mit Ubiquitin-Stabilisierungspuffer ein. Bereiten Sie eine Negativkontrolle mit einem normierten Volumen Ubiquitin-Stabilisierungspuffer und eine Positivkontrolle mit dem Puffer und handelsüblichen Kettentypen vor. Bereiten Sie eine Lösung von 50 millimolaren Ammoniumbicarbonat in Wasser vor und stellen Sie den pH-Wert mit einem molaren Natriumhydroxid auf acht ein.

Pelletieren Sie eine E.coli-Kultur durch Zentrifugation bei 5.000-fachem G für fünf Minuten. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und resuspendieren Sie sie in Ubiquitin-Stabilisierungspuffer bei fünf Mikrogramm pro Milliliter. Geben Sie ein Mikrogramm E.coli-Lysat zu jeder Probe und kontrollieren Sie.

Bereiten Sie dann 500 Millimolar TCEP in MS Grade Wasser vor und fügen Sie es jeder Probe bis zu einer Endkonzentration von 50 Millimolar hinzu. Die Proben kurz vortexen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes wird eine Lösung aus 500 Millimolar Chloracetaldehyd und Ammoniumbicarbonat hergestellt und bis zu einer Endkonzentration von 55 Millimolar zu den Proben und Kontrollen gegeben.

Die Proben kurz vortexen und 20 Minuten im Dunkeln inkubieren. Geben Sie Endopeptidase Lys-C in die Proben und inkubieren Sie sie drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation verdünnen Sie die Proben mit 200 Mikrolitern 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat, fügen Sie Trypsin hinzu und inkubieren Sie sie weitere 12 Stunden lang.

Am nächsten Tag wird jeder Probe 10 %ige Ameisensäurelösung zugegeben und in einem Volumen-Volumen-Verhältnis von 1:10 kontrolliert. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert kleiner als drei ist. Geben Sie dann 0,5 Mikroliter schweren Peptidstandard zu jeder Probe.

Fahren Sie nach der standardmäßigen C18-Probenaufreinigung mit der massenspektrometrischen Analyse der Proben mit einer PRM-basierten Methode fort. Um die Isolationsliste zu exportieren, wählen Sie im Exportmenü die Option Isolationsliste aus, wählen Sie den Gerätetyp aus und stellen Sie die Methode auf Standard ein. Klicken Sie auf OK, um eine Eingabeaufforderung zum Speichern einer CSV-Datei zu öffnen, die zum Erstellen einer PRM-Methode verwendet werden kann.

Importieren Sie als Nächstes den Planungslauf, indem Sie Datei, Importieren und Ergebnisse auswählen. Wählen Sie mehrere Dateien aus, die gleichzeitig importiert werden sollen, und klicken Sie auf OK, wählen Sie dann die Dateien aus und warten Sie, bis der Import abgeschlossen ist. Wenn Sie fertig sind, überprüfen Sie die Identifikationen, indem Sie auf die Masse für jeden schweren Peptideintrag klicken.

Die korrekte Erkennung des Peaks wird oft automatisch ermittelt, aber es kann eine manuelle Kuration erforderlich sein. Die für die schweren Varianten ausgewählten Aufbewahrungszeiten werden auch auf die leichten Versionen angewendet, wodurch ein Zeitplan für das PRM erstellt wird. Um das Planungsfenster zu ändern, wählen Sie den Peak aus und klicken Sie auf Einstellungen und Peptideinstellungen.

Ändern Sie dann das Zeitfenster auf der Registerkarte Vorhersage. Die Einschlussliste des Zeitplans kann dann mit Datei, Exportieren und Isolationsliste exportiert werden. Wählen Sie den geeigneten Gerätetyp aus, stellen Sie den Methodentyp auf geplant ein und klicken Sie auf OK.To die Daten zu analysieren, alle Proben zu importieren und eine Kuration durchzuführen, Übergänge mit Interferenzen oder schlechten Signal-Rausch-Verhältnissen zu entfernen, und exportieren Sie dann die Daten, indem Sie entweder mit der rechten Maustaste auf die entsprechenden Diagramme klicken und Daten kopieren auswählen oder auf Datei, Exportieren und Bericht klicken.

Die Behandlung mit dem Proteasom-Inhibitor MG-132 verhindert den Abbau von Ubiquitin-konjugierten Proteinen, was zu einer Erhöhung der K48-Kette in der Maus-Melanomzelllinie B16 sowie in den beiden humanen Zelllinien A549 und HeLa führt. Die parallele Reaktionsüberwachung (PRM) führt nach der Auswahl des Vorläuferions einen vollständigen Produktionenscan durch, was bedeutet, dass die Produktionen nach dem Lauf kuratiert werden sollten. Das Chromatogramm für K48 wird vor und nach der Kuration gezeigt.

Produktionen, die ein Signal mit einem inkonsistenten Elutionsprofil und geringer Intensität aufweisen, wurden entfernt. Der während der Kuration ausgewählte Übergang sollte zwischen den Experimenten konsistent sein, kann jedoch je nach chromatographischen Bedingungen, Analyseeinstellungen und dem biologischen Hintergrund der Probe unterschiedlich sein. Hier sind typische Produktionenchromatogramme für jede der in diesem Experiment identifizierten Ubiquitinkettentopologien zu sehen.

Bei der Planung eines PRM-Experiments kann die Kollisionsenergie optimiert werden, um das Signal zu verbessern. Bei Anwendung von Kollisionsenergien von 14 bis 28 zeigte sich, dass eine höhere Kollisionsenergie von 26 für K63 optimal war, während eine niedrigere Energie von 18 ideal für M1 war. In diesem Experiment wurden günstige Kollisionsenergien für die topologiecharakteristischen Peptide und eine Auswahl unmodifizierter Ubiquitin-Fragmente gefunden, die jedoch möglicherweise auf der Grundlage des verwendeten Massenspektrometers und der verwendeten Fragmentierungsmethode optimiert werden müssen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass für die Analyse der Ubiquitin-Kette ein Gleichgewicht der Bedingungen geschaffen werden muss, um sicherzustellen, dass die Ubiquitin-Kettenbindungen erhalten bleiben und gleichzeitig ihre Verdauung in Peptide gefördert wird.

Diese Methode ist für das Verständnis der Ubiquitin-Signalgebung von entscheidender Bedeutung, da sie eine genaue Quantifizierung der Ubiquitin-Kettentopologie ermöglicht. Sie könnte mit einem Pull-down- oder einer Organellenfraktionierung kombiniert werden, um zu ermitteln, welche Ubiquitin-Kettentopologie mit der Zielproteinprobe assoziiert ist.