Intratracheale Instillation von Stammzellen bei Term Neonatal Ratten

Described ist ein Protokoll zur Durchführung einer intratrachealen Transplantation von mesenchymalen Stromalzellen (MSCs) durch intratracheale Injektion bei neonatalen Ratten. Diese Technik ist eine klinisch praktikable Option für die Abgabe von Stammzellen und Medikamenten in die Lungen der neonatalen Ratte, um ihre Wirksamkeit zu bewerten.

Intratrachealinstillation ist eine klinische biotechnische zur Bereitstellung von Stammzellen und Medikamenten in eine neonatale Lunge, um die Wirksamkeit von Chilman zu bewerten. Diese Technik kann gutgläubig für die Verwendung mit einer Vielzahl von primären Anwendung bei einer neonatalen Ratte und ist eine relativ einfache und kostengünstige Maßnahme für die Behandlung von Lungenerkrankungen. Am fünften Tag der Postnatale, halten Sie die anästhetisierten Sprague-Dawley Rattenwelpen auf einem 60-Grad-Winkel-Intubationsständer zurück.

Und befestigen Labor-Etikettierband auf allen vier Gliedmaßen jedes Welpen, um sie an Ort und Stelle zu sichern. Tragen Sie Klebeband unter jeder Nase auf, um die Köpfe zu fixieren. Und punktieren Sie den ersten Hals für Punktionstracheotomie.

Verwenden Sie ein 75%Alkohol-Prep-Pad, um den Schnittbereich zu desinfizieren. Und machen Sie einen vertikalen 3 Zentimeter Mittellinienschnitt über der Luftröhre, um eine Beschädigung der Karotisarterien zu vermeiden. Verwenden Sie gekrümmte verjüngte Pinzette ohne Haken, um die Fett- und Muskelschichten zu trennen, um die Luftröhre zu lokalisieren.

Wenn die Luftröhre beobachtet werden kann, verwenden Sie die Pinzette, um die Luftröhre zu greifen und verwenden Sie eine 100-Mikroliter-Spritze mit einer 30-Spur-Nadel, um ein mal zehn der fünften Gfirefly-Luziferase GFP markiert mesenchymal stromal Zellen in 30 Mikroliter Saline in die Luftröhre, während der Inspiratoriumsphase zu injizieren. Wenn alle Zellen injiziert wurden, schließen Sie den Schnitt mit 160 Seidenstich, der den Knoten so fest wie möglich bindet. Und schneiden Sie die Enden der Naht so kurz wie möglich.

Dann lassen Sie den Welpen von der Anästhesie erholen, an einem warmen Ort mit Überwachung, bis es warm, rosa, und in der Lage, spontane Bewegung, bevor sie das Tier in seinen Käfig. Um die transplantierten humanen mesenchymalen Stromalzellen 15 Minuten nach der Erwiderung der Ratten von der Operation zu verfolgen, injizieren sie die reanästhetisierten Welpen mit 125 Milligramm pro Kilogramm Luzifererkaliumsalz in PBS. 10 Minuten nach der Injektion verwenden Sie ein Kleintier-Bildgebungssystem, um sequenzielle Bilder in 5-15 Sekunden Intervallen mit einem mittleren Binning, einem 1 F-Stop und einem 26-Zentimeter-Sichtfeld zu erfassen.

Dann verwenden Sie die Bildgebungssoftware, um die Lumineszenzaktivität aus der Lunge basierend auf den automatischen Regionen von Interesse zu quantifizieren. Ein hohes Maß an GFP-Expression wird in luziferase Firefly markiert menschliche mesenchymale Stammzellen beobachtet. Mesenchymale Stammzellen können weiter durch ihre Zelloberflächenmarkerexpression und ihre Fähigkeit, sich in Osteozyten, Chondrozyten und Adipozyten zu differenzieren, charakterisiert werden.

Die Lumineszenz-Bildgebung der transplantierten humanen mesenchymalen Zellen in VIVO zeigt das Fehlen von lumineszierenden Signalen in den Lungenregionen von Ratten, die mit normaler Saline behandelt werden. Bei Ratten, die mit mesenchymalen Stammzellen behandelt werden, wird Lumineszenz in den Luftröhre- und zentralen Lungenregionen dieser Tiere beobachtet. Tatsächlich ergab die Quantifizierung der Lumineszenzintensität in dieser repräsentativen Analyse, dass Ratten, die mit mesenchymalen Stammzellen behandelt wurden, eine etwa 13-fache Zunahme der Lumineszenzaktivität im Vergleich zu Ratten aufwiesen, die mit normaler Saline behandelt wurden.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Luftröhre zu sezieren und zu isolieren, ohne die umliegenden Arterien einzuschränken. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen der intratrachealen Verabreichung von Zellen und Medikamenten der neonatalen Palmer-Krankheit mit Strahlen mit dem Modus des menschlichen Patienten.