Name: Y-27632 Bereichert die Ausbeute menschlicher Melanozyten aus erwachsenen Hautgeweben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Erfahren Sie eine Methode zur Isolierung menschlicher Melanozyten aus erwachsenem Hautgewebe mit Y-27632. Diese Technik steigert die Ausbeute um das Fünffache und liefert reine Zellen für Forschung und klinische Anwendungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Key Research and Development Program of China (2017YFA0104604), The General Program of National Natural Science Foundation of China (81772093), Military Logistics Research Project (AWS17J005), the Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD3 6) und das Schlüsselforschungs- und Entwicklungsprogramm der Provinz Shandong (2019GSF108107) an die X.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A1515110833) und die Fundamental Research Funds der Shandong University (2019GN043) an J.M.

Die Verwendung von erwachsenen Vorhautgewebeinteilen in diesem Protokoll wurde von der Human Research Ethics Committee (Nr.2015120401, Datum: 12. Mai 2015) genehmigt.
HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Verfahren in einer sterilen Umgebung durch, um Kontaminationen von Zellen und Kulturen zu verhindern.
1. Vorbereitungen
<ol><li>Sammeln Sie frisches vorhauthaltiges Gewebe aus Beschneidungsoperationen in 15 ml-Röhrchen, die 10 ml Phosphatpuffer-Saline (PBS) enthalten, und lagern Sie es in 4 °C. HINWEIS: Trennen Sie die Gewebe, wie unten beschrieben, innerhalb von 24 h nach ihrer Exzision.</li>
	<li>Bereiten Sie Reagenzien und Kulturmedium.<ol>
<li>Bereiten Sie 3% P/S (Penicillin/Streptomycin) als Waschlösung vor. Mischen Sie 50 ml PBS mit 1,5 ml Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 mg/L) (P/S).</li>
		<li>Bereiten Sie die Terminlösung (Neutralisationslösung) zur Neutralisierung der enzymatischen Verdauung vor. Zuschlag 1% P/S, 10% fetales Rinderserum (FBS) in DMEM medium.</li>
		<li>Bereiten Sie TIVA Medium-zu-Kultur-Melanozyten vor: Ham s F12; 10% FBS; 1x P-S-Glutamin; 50 ng/mL 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetat (TPA); 1 x 10-4 M 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX); 1 M Na3VO4; 1 x 10-3 M N-6,2-O-Dibutyryladenosin-3,5-zyklisches Monophosphat (dbcAMP).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Die konventionelle Methode
<ol><li>Hautgewebe-Vorbehandlung<ol>
<li>Spülen Sie jedes erwachsene Vorhautgewebe einmal mit 10 ml 75% Ethanol (Alkohol) für 30 s, und spülen Sie dann zweimal mit 10 ml Waschlösung (3% P/S), für jeweils 5 min. HINWEIS: Waschen Sie Vorhautgewebe mit 10 ml PBS am Anfang, wenn es viel Blut gibt. Alle Wässer werden in 100 mm Zellkulturschalen zubereitet.</li>
		<li>Zerkleinern Sie jedes Vorhautgewebe mit einer chirurgischen Klinge, um subkutane Fettgewebe und lose Bindegewebe in der Abdeckung einer 100 mm Zellkulturschale zu entfernen. HINWEIS: Verwenden Sie ein Skalpell, um die Fettschichten wegzukratzen, bis nur die dünne Epidermis und die dichte Dermis übrig bleiben.</li>
		<li>Übertragen Sie jede erwachsene Vorhaut in eine weitere 100 mm Kulturschale mit der Dermisseite nach unten. HINWEIS: Schneiden Sie jedes erwachsene Vorhautgewebe in 3-4 mm breite Streifen mit einer Skalpellklinge, damit die Dispase effizienter funktioniert.</li>
		<li>Fügen Sie 2,5 mg/ml Dispase zu jeder 100 mm Kulturschale mit erwachsenen Vorhautgewebe und inkubieren für 16 bis 20 h bei 4 °C. HINWEIS: Jedes Gramm Gewebe wird mit 10 ml Dispase-Lösung verdaut.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trennung der Epidermis vom erwachsenen Vorhautgewebe<ol>
<li>Nach der Verdauung für 16 bis 20 h, trennen Sie die Epidermis von der Dermis mit einer Pinzette. Schnappen Sie sich eine Seite der dermalen Kante des Gewebes mit einer Pinzette und die entsprechende Position des epidermalen Teils mit einer anderen Pinzette und schälen Sie die Epidermis sanft ab.</li>
		<li>Die Epidermis 3x mit Waschlösung (3% P/S) waschen und dann in ein Rohr geben.</li>
		<li>Untertauchen Sie die Epidermis, indem Sie 5 ml 0,05% Trypsin in die Röhre geben und in einem Wasserbad 30 min bei 37 °C inkubieren. HINWEIS: Schütteln Sie das Rohr, um sicherzustellen, dass die Epidermis vor der Inkubation vollständig untergetaucht ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sammlung und Kultur von Primärzellen<ol>
<li>Fügen Sie ein gleiches Volumen der Terminlösung (10% FBS, 1% P/S in DMEM) hinzu, um das Trypsin und die Pipette 10-15 Mal nach oben und unten zu neutralisieren, um die epidermalen Zellen zu trennen.</li>
		<li>Übergeben Sie die Zellsuspension in ein neues 50 ml-Rohr durch einen 100-m-Netzfilter, um Schmutz zu entfernen.</li>
		<li>Zentrifuge bei 200 x g für 5 min.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 10 ml Impf-TIVA-Medium hinzu, um die Zellen wieder auszusetzen.</li>
		<li>Säen Sie die resuspendierten Zellen in eine 100 mm Kulturschale.</li>
		<li>Kultur in einem 37° C Inkubator mit 5%CO2.</li>
		<li>Ändern Sie das Medium alle 2 Tage.</li>
		<li>Durchgangszellen, wenn sie 80% Zusammenfluss erreichen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Die neue Methode
ANMERKUNG: Das Verfahren zur Gewebeaufbereitung und -verdauung in der neuen Methode ist das gleiche wie oben für die herkömmliche Methode beschrieben, wobei der einzige Unterschied darin besteht, dass die isolierten frischen Zellen in 10 ml TIVA-Medium resuspendiert werden, das 10 m Y-27632 enthält.
<ol><li>Ersetzen Sie das Medium zwei Tage nach dem Aussaat durch ein normales TIVA-Medium ohne Y-27632. Danach sind die Kulturbedingungen zwischen den neuen und den konventionellen Methoden gleich.</li>
</ol>4. Zellpassaging
<ol><li>Entfernen Sie das TIVA-Medium und spülen Sie jedes Kulturgericht zweimal mit PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml 0,05% Trypsin pro 100 mm Zellkulturschale hinzu. HINWEIS: Schütteln Sie die Schale, um einen ausreichenden Kontakt zwischen Verdauungsenzymen und dem Boden der Schale zu gewährleisten.</li>
	<li>In einem 37 °C-Inkubator für 2 min verdauen.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Mikroskop, um die Zellen zu überprüfen, und stellen Sie sicher, dass sich die meisten Zellen von der Zellkulturschale getrennt haben. HINWEIS: Tippen Sie vorsichtig auf die Schale, um die Zellen freizugeben, um sich aufzurunden und in der Lösung zu schweben. Verlängern Sie die Verdauungszeit, wenn die meisten Zellen nach dem Tippen nicht aussetzen, aber nicht mehr als 5 min.</li>
	<li>Übertragen Sie die Melanozyten in ein 15 ml Rohr nach der Neutralisierung der Trypsin-Aktivität durch Zugabe von 2 ml Terminlösung. Zentrifuge bei 200 x g für 5 min.</li>
	<li>Setzen Sie jedes Zellpellet mit 10 ml TIVA Medium nach dem langsamen Entfernen des Überstandes aus, und zählen Sie dann die Anzahl der Melanozyten.</li>
	<li>Platte ca. 1 x 106 Melanozyten in 10 ml TIVA medium pro 100 mm Zellkulturschale.</li>
	<li>Erneuern Sie das Zellkulturmedium alle 48 h.</li>
</ol>

<ol><li>Costin, G. E., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+pigmentation%3A+melanocytes+modulate+skin+color+in+response+to+stress%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress.</a> FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).</li>
<li>Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosinase+gene+expression+in+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tyrosinase gene expression in human tissues.</a> Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).</li>
<li>Michaloglou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAFE600-associated+senescence-like+cell+cycle+arrest+of+human+naevi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi.</a> Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).</li>
<li>Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+melanocytes+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Human melanocytes in tissue culture.</a> Journal of Investigative Dermatology. 28 (1), 15-32 (1957).</li>
<li>Eisinger, M., Marko, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+proliferation+of+normal+human+melanocytes+in+vitro+in+the+presence+of+phorbol+ester+and+cholera+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).</li>
<li>Hirobe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+keratinocyte-derived+factors+involved+in+regulating+the+proliferation+and+differentiation+of+mammalian+epidermal+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes.</a> Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).</li>
<li>Halaban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+from+human+keratinocytes+is+a+natural+mitogen+for+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes.</a> Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).</li>
<li>Kunisada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte+expression+of+transgenic+hepatocyte+growth+factor+affects+melanocyte+development%2C+leading+to+dermal+melanocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis.</a> Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).</li>
<li>Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+cycle+of+human+melanocytes+is+regulated+by+endothelin-1+and+stem+cell+factor+in+synergy+with+cyclic+AMP+and+basic+fibroblast+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor.</a> Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).</li>
<li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e7862(2018).</li>
<li>Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+procurement+of+epithelial+stem+cells+from+human+tissue+specimens+using+a+Rho-associated+protein+kinase+inhibitor+Y-27632%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).</li>
<li>Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfollicular+epidermal+stem+cells%3A+boosting+and+rescuing+from+adult+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin.</a> Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+Y-27632+increases+the+cloning+efficiency+of+limbal+stem%2Fprogenitor+cells+by+improving+their+adherence+and+ROS-scavenging+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity.</a> Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).</li>
<li>Yokoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+suppression+of+MITF+expression+via+HDAC+inhibitors+in+the+melanocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+%26+Melanoma+Rresearch%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage.</a> Pigment Cell & Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).</li>
<li>Mi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+promotes+keratinocyte+survival+and+paracrine+secretion%2C+enhancing+establishment+of+primary+human+melanocytes+and+melanocyte-keratinocyte+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+%26+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures.</a> Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).</li>
</ol>

Alle Autoren erklären kein Konfliktinteresse.

Das hier beschriebene Protokoll basiert auf einer kürzlichveröffentlichten 16. Den folgenden kritischen Schritten sollte einige Aufmerksamkeit geschenkt werden, um mit der neuen Methode die besten Ergebnisse zu erzielen. Erstens ist eine erfolgreiche Trennung der Epidermis und der Dermis entscheidend. Schneiden Sie das erwachsene Vorhautgewebe mit einer Skalpellklinge in 3-4 mm breite Streifen, damit die Dispase gründlicher und einfacher wirken, um die Epidermis von der Dermis zu trennen. Zweitens...

Ziel dieser Studie war es, ein einfaches und effektives Protokoll zur Isolierung von Melanozyten aus der Epidermis der erwachsenen Haut für biologische Forschung und klinische Anwendungen zu entwickeln. Melanozyten, die sich in der Basalepidermis der Haut und in Haarfollikel befinden, spielen eine wichtige Rolle bei der Pigmentierung von Haut und Haaren durch die Produktion von Melanin1. Die daraus resultierende Hautpigmentierung aus epidermalen Melanozyten wirkt als ultravioletter Strahlungsfilter, der DNA-Schäden an darunter liegenden Zellen in der Haut reduziert/verhindert2. Die abnorme Proliferation von Melanozyten in der Haut ist durchaus üblich, wie bei der Bildung von gutartigen Nevi (Molen), bei denen Melanozyten potenziell zu onkogenem Wachstum transformieren können, gefolgt von zellulärer Seneszenz3.
Seit 1957 ist die Isolation und nachfolgende Kultur menschlicher Primärmelanozyten möglich4, aber erst seit 1982 gibt es eine effiziente Methode, die Reproduzierbar Kulturen menschlicher Melanozyten aus der Epidermisetablierenkann 5 . Die herkömmliche Methode, primäre Melanozyten von der Epidermis zu isolieren, beinhaltet eine zweistufige enzymatische Verdauung. Kurz gesagt, die Haut wird zunächst mit Dispase verdaut, um die Epidermis von der Dermis zu trennen, danach wird die Epidermis mit Trypsin verdaut, um Suspensionen zu produzieren, die Melanozyten und Keratinozyten enthalten, die dann selektiv in verschiedenen Medien angebaut werden können. Derzeit dauert die Anfangskultur in der Regel etwa 3 bis 4 Wochen für Melanozyten, um die Konfluenz mit der herkömmlichen Methode zu erreichen, die wahrscheinlich auf die geringe Effizienz ihrer Isolierung zurückzuführen ist. Daher wäre die Erhöhung der erstmaligen Produktion von Melanozyten aus erwachsenen Hautgeweben sowohl für die Laborforschung als auch für klinische Anwendungen sehr hilfreich.
Viele Wachstumsfaktoren, von denen die meisten nachweislich durch Keratinozyten abgesondert werden (z.B. S-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF und SCF)5-8, regulieren die Differenzierung und Proliferation von Säugetiermelanozyten. In Ermangelung von Feederschichten führt das Fehlen dieser Wachstumsfaktoren zu einer verminderten Proliferation von Melanozyten und ihrer erhöhten Apoptose9. Die Kokultur der Keratinozyten als Feederzellen und Melanozyten könnte zu einer beschleunigten Melanozytenproliferation und reduzierter Apoptose führen. Die Co-Kultur-Methode verlangt jedoch nicht nur mehr Hautgewebe, um Keratinozyten zuzubereiten, was nicht praktikabel ist, sondern konnte auch nicht effizient arbeiten, weil die von Melanozyten geforderten Kulturbedingungen das Keratinozytenwachstum nicht begünstigen und umgekehrt.
Frühere Studien haben berichtet, dass die Zugabe von Y-27632, einem ROCK-Hemmer, in das Wachstumsmedium die Ausbeute menschlicher primärer epidermaler Zellen aus Hautgeweben10-14verbessern kann. Daher wäre es interessant zu testen, ob die Isolierung menschlicher Primärmelanozyten von der Anwesenheit von Y-27632 profitieren würde. Tatsächlich erhöhte die Zugabe von Y-27632 in das Inokulations-TIVA-Medium15, das TPA, IBMX, Na3VO4 und dbcAMP enthält, die Ausbeute von primären Melanozyten, die aus Vorhautgeweben in den Ausgangskulturen isoliert sind, signifikant16. Im Vergleich zum herkömmlichen Protokoll ist dieses neue Protokoll deutlich effizienter bei der Erhöhung der Ausbeute an Melanozyten16. Daher beschreibt dieses Protokoll die neue Methode im Detail unter Verwendung von erwachsenen Hautgeweben auf der Grundlage einer früheren Studie16, um ihre Anwendung in der Grundlagen- und angewandten biologischen Forschung zu fördern.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor-594 Esel Anti-Maus IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21203</td><td>Für Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-594 Esel Anti-Kaninchen IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37119</td><td>Für Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>Zellkulturschale</td><td>Eppendorf</td><td>30702115</td><td>Für Zellkultur</td></tr><tr><td>Zellsieb</td><td>Corning integriert</td><td>431792</td><td>Zellfiltration</td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>KIRGEN</td><td>171003</td><td>Für Zellzentrifuge</td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>KIRGEN</td><td>171003</td><td>Für Zellzentrifuge</td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026333</td><td>Für die Zellinkubation Konstante</td></tr><tr><td>Temperatur Shaker</td><td>Shanghai Boxun</td><td>150036</td><td>Für Wasserbad</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abcam</td><td>ab104139</td><td>Für </td></tr><tr><td>Immunfluoreszenz-Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>Für die Melanozytenisolierung</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific C11995500</td><td></td><td>Bestandteil des Neutralisationsmediums</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Biologische Industrie</td><td>04-001-1AC5</td><td>Bestandteil des Neutralisationsmediums</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td>5E44316</td><td>Für Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>MCE</td><td>HY-15371</td><td>Pigmentierung induzieren</td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>Melanozyten-Kulturmedium</td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Thermo Scientific</td><td>11330032</td><td>Melanozyten-Kulturmedium</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>5C42258</td><td>Für zellmikroskopische Betrachtung</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>17018</td><td>Melanozyten-Kulturmedium</td></tr><tr><td>Maus Anti-Human-MITF</td><td>Abcam</td><td>ab12039</td><td>Für Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td>Melanozyten-Kulturmedium</td></tr><tr><td>N6,2'-O-Dibutyryladeno-sin 3',5'-cyclisches Monophosphat (dbcAMP)</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>Melanozyten-Kulturmedium</td></tr><tr><td>12-O-Tetradecanoyl phorbol-13-acetat (TPA)</td><td>Sigma</td><td>79346</td><td>Melanozyten-Kulturmedium</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>Antibiotika</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Human-Ki-67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>Für Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Lösung</td><td>Solarbio Life Science</td><td>P1020-500</td><td>Waschlösung</td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004380</td><td>Zellzentrifugation</td></tr><tr><td>TC20TM automatisierter Zellzähler</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>Automatische Zellzählung</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>25300-062</td><td>Für die Dissoziation von Melanozyten</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>Für die Isolierung von Melanozyten</td></tr></tbody></table>

y-27632 bereichert die ausbeute menschlicher melanozyten aus erwachsenen hautgeweben

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Die Isolierung und Kultur von primären Melanozyten aus Hautgeweben ist sehr wichtig für die biologische Forschung und wurde häufig für klinische Anwendungen verwendet. Die Isolierung von primären Melanozyten aus Hautgewebe nach der herkömmlichen Methode dauert in der Regel etwa 3 bis 4 Wochen, um ausreichend zu durchgehen. Noch wichtiger ist, dass die verwendeten Gewebe in der Regel neugeborene Vorhaut sind und es ist immer noch eine Herausforderung, primäre Melanozyten effizient aus erwachsenen Geweben zu isolieren. Wir haben vor kurzem eine neue Isolationsmethode für Melanozyten entwickelt, die Y-27632, einen Rho-Kinase-Inhibitor, zum ursprünglichen Kulturmedium für 48 h hinzufügt. Im Vergleich zum herkömmlichen Protokoll erhöht diese neue Methode dramatisch die Ausbeute von Melanozyten und verkürzt die Zeit, die erforderlich ist, um Melanozyten aus Vorhautgeweben zu isolieren. Wir beschreiben diese neue Methode nun ausführlicher mit Erwachsenenepidermis, um primäre Melanozyten effizient zu kulturieren. Wichtig ist, dass wir zeigen, dass Melanozyten aus erwachsenen Geweben, die mit dieser neuen Methode hergestellt werden, normal funktionieren können. Dieses neue Protokoll wird Studien zu Pigmentdefekten und Melanomen mit primären Melanozyten, die aus leicht zugänglichen erwachsenen Hautgeweben hergestellt werden, erheblich zugute kommen.

Abbildung 1 zeigt ein schematisches Diagramm, in dem die herkömmlichen und die neuen Methoden verglichen werden. Das Verfahren zur Gewebeaufbereitung und -verdauung mit der neuen Methode ist das gleiche wie das Verfahren für die herkömmliche Methode, wobei der einzige Unterschied darin besteht, dass die isolierten Zellen in 10 ml TIVA-Medium in Gegenwart von 10 M Y-27632 resuspendiert werden. Ersetzen Sie das Medium zwei Tage nach dem Aussaat durch ein normales TIVA-Medium ohne Y-27632. Die ...

Dieses Papier berichtet, dass die Zugabe von Y-27632 zu TIVA Medium kann die Ausbeute von Melanozyten aus erwachsenen Hautgewebe deutlich erhöhen.

Y-27632 Bereichert die Ausbeute menschlicher Melanozyten aus erwachsenen Hautgeweben

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Das allgemeine Ziel des zellbasierten Protokolls ist es, menschliche Melanozytenzellen zu isolieren und zu kulturieren, um die Unzulänglichkeiten konventioneller Methoden zu verbessern. Aus der neuen Methode können wir größere Mengen an primären Melanozytenzellen in relativ kurzer Zeit erhalten, basierend auf Materialien und Ausrüstungen. Menschliches Gewebe, das in diesem Protokoll verwendet wird, sind frische Erwachsene für Hautgewebe, die aus der Beschneidungschirurgie im Krankenhaus entsorgt und gemäß den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung 2015120401, Datum 12. Mai 2015, behandelt werden.Dies ist eine Anzeige aller erforderlichen Reagenzien. Bereiten Sie sterile Instrumente und Materialien im Voraus vor und stellen Sie das Gewebe in eine Schüssel, waschen Sie das Gewebe mit 75% Ethanol für 30 Sekunden und mit Waschen Lösung bindet fünf Minuten jeweils schneidet das Gewebe in bequeme Stücke und schrottet das Gewebe mit chirurgischen Klinge, um die Fettschicht zu entfernen. Abflachen Sie das Gewebe mit der Dermis-Seite nach unten fügen Sie 2,5 Milligramm pro Milliliter die Raumlösung zu den Hautgeweben.Die Stücke über Nacht bei vier Grad Celsius abdecken und lagern. Am zweiten Tag die Epidermis von der Dermis abziehen und die Epidermis sofort in weitere drei Schüsseln mit Waschlösung übertragen, die wiederum 0,05% Trypsin in die Tube tauchen, die für 30 Minuten in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius inkubiert wird. Fügen Sie ein gleiches Volumen der Neutralisationslösung hinzu.Pipetten die Lösung nach oben und unten für 10 bis 15 Mal. Übergeben Sie die Lösung durch einen 100-Mikrometer-Maischefilter. Zentrifuge bei 200 mal g für fünf Minuten entfernen Sie den Überstand re-suspend die Zellpalette in 10 Milliliter Tiva Medium.Fügen Sie 10 Mikrometer Y-27632 hinzu. Markieren Sie die Information, dies ist das Sichtfeld unter dem Mikroskop. Es zeigt Zellen, die in der mittleren Inkubation in einem 37 Grad Celsius Inkubator schwimmen.Diese Ansicht zeigt die Ansicht am zweiten Tag, in der die Zellen begonnen haben, den Boden der Schale zu befestigen. Und der Blick auf Tag neun zeigt offensichtliche Ablagerungen von Melanozyten existieren. Entfernen Sie den Überstand waschen die Zellen mit PBS hinzufügen zwei Millimeter von 0,05%Trypsin inkubieren die Zellen für zwei Minuten fügen Sie zwei Milliliter der Neutralisationslösung.Zentrifuge bei 200 mal g für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand langsam wieder aufhängen die Zellpalette mit 10 Millimeter Tiva Medium. Ändern Sie das Medium alle zwei Tage.Diese Bilder zeigen die Ansichten von Passage ein schematisches Diagramm, so dass die neue Methode und die herkömmliche Methode in dieser Abbildung dargestellt werden. Das Verfahren zur Gewebeaufbereitung und zur Verdauung neuer Methoden ist das gleiche wie bei der herkömmlichen Methode. Der einzige Unterschied ist, dass die isolierten Fettzellen in 10 Minuten in ihrem Tiva-Medium mit der Anwesenheit von 10 Mikrometer Y-27632 geimpft.Nach zwei Tagen ersetzen Sie das Medium mit Tiva Medium ohne Ergänzungen bei Y-27632. Dieses Panel zeigt repräsentative Bilder von Melanozyten, die mit der konventionellen Methode in der oberen Reihe hergestellt wurden, und durch die neue Methode untere Reihe am dritten Tag, Tag sechs und Tag acht nach der ersten Impfung nennen wir die Anzahl der Melanozyten am dritten Tag, Tag sechs und acht, wir fanden heraus, dass die neue Methode die Melanozytenausbeute um etwa das Fünffache erhöhte. Nach acht Tagen Konter haben wir Dutzende und zählen die Anzahl der Melanozyten in jedem einzelnen Gericht.Die Ergebnisse zeigten, dass die Anzahl der durch eine neue Methode isolierten Melanozyten viel größer ist als die herkömmliche Methode. Ki67 stehend bestätigen, dass Melanozyten, die durch eine neue Methode isoliert werden, sich normalerweise noch wichtiger vermehren können, dass wir mit der neuen Methode eine normale Funktion von Melanozyten erhalten haben. Wir überprüften die Reinheit der Melanozyten nach dem ersten Durchgang aus der Isolation.Die Passage ein melanocytes für stehen für MITF Ausdruck, die nur in Melanozyten ausgedrückt. Und wir fanden heraus, dass fast 100%zellen positiv für MITF waren, was auf reine Melanozyten hindeutet, die nach dem ersten Durchgang erhalten wurden. Um Melanozyten zu testen, die von den neuen Methoden isoliert sind, kann normal funktionieren.Wir behandelten Melanozyten mit Kraftkühlung für über 90 in vitro und beobachten, dass Kraftkühlung die Pigmentierung von Melanozyten induzieren kann. Wenn man diese Daten zusammennimmt, deutet dies darauf hin, dass die von der neuen Methode isolierten Melanozyten normalerweise Pigmentierung erzeugen können. Primäre Melanozyten, wie oben angegeben und in der Kultur erweitert wurden leicht für die Laborforschung und die klinischen Anwendungen verwendet.Nachdem berichtet, dass ID Y-27632 in die ursprüngliche Kultur Medium vor zwei Tagen kann dramatisch erhöhen die aus Melanozyten. Zusammenfassend haben wir erfolgreich eine neue einfache und hocheffiziente Methode etabliert, um reine primäre Melanozyten aus erwachsenen Geweben zu isolieren.

y-27632-enriches-yield-human-melanocytes-from-adult-skin

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Bericht beschreiben wir die dreidimensionale Rekonstruktion der Haut Modell, das die menschliche Haut imitiert in der Architektur und Komposition. Melanozyten Physiologie, Melanom Progression und das Schicksal der dermalen Stammzellen untersucht worden mit der Haut zu rekonstruieren Modell. Das Modell ist auch nützlich als Werkzeug für die präklinische Arzneimittel Beurteilung.

Die dreidimensionalen humanen Haut Rekonstruieren Modell: ein Tool für normale Haut und Melanom Progression Study

Dieses Video beschreibt die schnelle Methode, die Melanozyten und Fibroblasten gleichzeitig aus der Haut des postnatalen Mauswelpen zu isolieren und zu kultivieren. Diese Zellen können in vitro erhalten und manipuliert werden, um die Zellbiologie der Haut, die Wundheilung und das Melanom zu untersuchen.

Schnelle Kultivierung primärer melanischer Melanozyten und Fibroblasten: Isolierung von Melanozyten und Fibroblasten aus einer ganzen Maushautprobe

Die Karzinogenese ist ein Prozess, der Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der Krebs Mikroumgebung. Um die molekularen Ereignisse sezieren, muss man verschiedenen Zellpopulationen in verschiedenen Stadien während der Entwicklung von Krebs zu isolieren. Mit einem Maus-Modell für Basalzellkarzinom, beschreiben wir ein Protokoll für die Zell-Analysen bei der Krebsentstehung.

Handy Bevölkerung Analysen Während Hautcarcinogenese

Epidermal Melanin wird durch die topische Anwendung von Forskolin in einem murinen Modell der hellhäutigen UV-empfindliche Menschen verursachte. Pharmakologische Manipulation von cAMP-Konzentrationen in der Haut und Epidermis stark verdunkelt Schutz gegen UV-vermittelte Entzündungen (Sonnenbrand), wie durch die minimale erythematöse Dosis (MED)-Assay gemessen.

Pharmakologische Induktion der epidermalen Melanin und Schutz vor Sonnenbrand in einem humanisierten Mausmodell

Diese Arbeit beschreibt ein in vitro Differenzierung Protokoll pigmentiert, reife Melanozyten von menschlichen pluripotenten Stammzellen über einen Neuralleiste und Melanoblasten Zwischenstufe mit einem Zubringer frei, 25 Tage - Protokoll zu erzeugen.

Feeder freie Ableitung von Melanozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe effizient zu isolieren. Diese Methode vereinfacht das konventionelle Verfahren mithilfe der ROCK-Inhibitor Y-27632 Mittel-und Impfung spontan Epidermiszellen von dermalen Zellen zu trennen.

Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren

Dieses Protokoll skizziert eine schnelle Methode, um gleichzeitig Melanozyten- und Fibroblastenkulturen aus der Haut von 0-4 Tage alten Mäusen zu erzeugen. Diese Primärkulturen können in vitro gepflegt und manipuliert werden, um eine Vielzahl physiologisch relevanter Prozesse zu untersuchen, einschließlich Hautzellbiologie, Pigmentierung, Wundheilung und Melanom.

Schnelle Generierung von primären Melanozyten- und Fibroblastenkulturen

Das folgende Verfahren beschreibt eine Methode zur räumlichen und zeitlichen Kontrolle der melanozytischen Tumorinitiation in der Murin-Sdorsal-Haut mit Hilfe eines gentechnisch veränderten Mausmodells. Dieses Protokoll beschreibt sowohl die makroskopische als auch die mikroskopische kutane Melanom-Annenentzündung.

Räumliche und zeitweilige Kontrolle der Murine Melanom-Initiation aus Mutant Melanocyte Stammzellen

Hier beschreiben wir ein optimiertes Direktreprogrammierungssystem für Melanozyten und ein hocheffizientes, konzentriertes Virusverpackungssystem, das eine reibungslose direkte Reprogrammierung gewährleistet.

Direkte Reprogrammierung von Mausfibroblasten in Melanozyten

Ein standardisiertes Protokoll zur Induzierung vorzeitiger Alterung bei HNM mittels tBHP, standardisierte Protokolle zur Analyse wichtiger Senezenzmarker, einschließlich Wachstumsstillstand, SA-β-Galaktosidase-Aktivität und SASP-Faktoren.

Ein standardisiertes Protokoll zur Induzierung stressbedingter vorzeitiger Seneszenz in primären menschlichen Melanozyten mittels Tert-Butylhydroperoxid

Erfahren Sie eine Methode zur Isolierung menschlicher Melanozyten aus erwachsenem Hautgewebe mit Y-27632. Diese Technik steigert die Ausbeute um das Fünffache und liefert reine Zellen für Forschung und klinische Anwendungen.

Y-27632 Bereichert die Ausbeute menschlicher Melanozyten aus erwachsenen Hautgeweben

Weitere Videos entdecken