Name: Vaskuläres Gießen von Erwachsenen und frühpostnatalen Mauslungen für Micro-CT Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Lernen Sie die vaskuläre Gussmethode für adulte und frühpostnatale Mäuselungen zur Visualisierung pulmonaler Gefäßnetzwerke mittels Micro-CT. Diese Technik bewahrt die Weichteilintegrität und ermöglicht präzise Analysen der Gefäßmorphologie.

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Diese Forschung wurde teilweise durch das NHLBI Intramural Research Program (DIR HL-006247) unterstützt. Wir danken der NIH Mouse Imaging Facility für die Anleitung bei der Bildaufnahme und -analyse.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (ACUC) des National Heart Lung and Blood Institute genehmigt.
1. Vorbereitung
<ol><li>Injizieren Sie die Maus intraperitoneal mit Heparin (1 Einheit/g Maus Körpergewicht) und lassen Sie es für 2 min ambulate.</li>
	<li>Euthanisieren Sie das Tier in einerCO2-Kammer.</li>
	<li>Ordnen Sie die Maus in einer Supine-Position auf einem chirurgischen Brett an und sichern Sie alle vier Gliedmaßen mit Klebeband am Brett. Verwenden Sie die Vergrößerung für die feine Sezierung.</li>
</ol>2. Aussetzen von Lungen und Luftröhre
<ol><li>Sprühen Sie die ventrale Seite der Maus mit 70% Ethanol, um Haarstörungen zu minimieren.</li>
	<li>Greifen Sie die Bauchhaut mit Derrpen und machen Sie einen kleinen Schnitt mit der Schere in der Nabelregion. Schieben Sie die Spitzen der Schere in die Faszienschicht zwischen Bauchmuskulatur und Haut und beginnen Sie, die beiden Schichten zu trennen. Arbeiten Sie rostral, entfernen Sie die Haut aus dem Bauch, Dem Brustkorb und dem Hals.</li>
	<li>Öffnen Sie die Bauchmuskulatur mit einer Schere und schneiden Sie seitlich auf beiden Seiten, bis das Zwerchfell freigelegt ist.</li>
	<li>Greifen Sie vorsichtig den xiphoiden Prozess und heben Sie den Brustkorb leicht an, um den Blick auf die kaudale Lunge durch die dünne, halbtransparente Membran zu maximieren. Machen Sie vorsichtig einen kleinen Schnitt in der Membran direkt unter dem xiphoiden Prozess. Die Lunge kollabiert und zieht sich vom Zwerchfell zurück. Sezieren Sie das Zwerchfell weg vom Brustkorb und achten Sie darauf, das Lungenparenchym nicht zu nicken.</li>
	<li>Suchen und trennen Sie die minderwertige Vena cava (IVC) und Speiseröhre, wo sie durch das Zwerchfell passieren. Verwenden Sie Gaze, um alle Pooling-Blut in der Brusthöhle zu reinigen, Kontakt mit der Lunge zu vermeiden.</li>
	<li>Greifen Sie das Xiphoid noch einmal und heben Sie sanft an. Schneiden Sie den Brustkorb bilateral (etwa an der midaxillären Linie) und vermeiden Sie den Kontakt mit der Lunge. Entfernen Sie den vorderen Brustkorb vollständig, so dass der letzte Schnitt entlang des Heckwinkels kurz vor dem Manubrium.</li>
	<li>Mit einer Fertigspritze die Lunge großzügig mit phosphatgepufferter Saline (PBS, pH 7,4) befeuchten, um ein Austrocknen zu verhindern. Setzen Sie diese Routine während des gesamten Verfahrens fort.</li>
	<li>Mit Zangen, greifen Sie das Manubrium und heben Sie sanft weg vom Körper. Mit der Schere 1-2 mm seitlich zum Manubrium schneiden, Dieklalen trennen und entfernen. Dadurch wird der Thymus darunter entblößt.</li>
	<li>Greifen Sie jeden Lappen des Thymus, ziehen Sie sie auseinander und entfernen Sie ihn. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit der submandibulären Drüse. Schließlich entfernen Sie das Muskelgewebe, das die Luftröhre überlagert. HINWEIS: Nach der Zerlegung sollten das Herz, die aufsteigende Aorta (AA), der lungenarterienhafte Stamm (PAT) und die Luftröhre sichtbar sein. Stellen Sie sicher, dass die primären arteriellen Zweige vom Stamm nicht geteilt oder verletzt werden.</li>
</ol>3. PA-Katheterisierung und Blutperfusion
<ol><li>Zur Montage von Einheit 1 1 15 cm PE-10-Schläuche auf die Nabe einer 30 G-Nadel und an einer 1 ml Spritze befestigen, die mit 10-4 M Natriumnitroprussid (SNP) in PBS vorgefüllt ist. Primieren Sie die Schläuche, indem Sie den Kolben voranbringen, bis die gesamte Luft von diesem Gerät gereinigt wird ( Abbildung 1). VORSICHT: SNP ist giftig, wenn es geschluckt wird. Vermeiden Sie den Kontakt mit der Haut und den Augen. Waschen Sie die Haut nach der Handhabung gründlich. Tragen Sie eine geeignete persönliche Schutzausrüstung.<ol>
<li>Alternativ können Sie Einheit 2 zusammenbauen. Für Mäuse postnatalen Tag 7 (P7) und jünger, verwenden Sie ein Hämostat, um eine zusätzliche 30 G Nadel von ihrer Nabe zu lösen und die Nadel auf das offene Ende des Schlauches von Einheit 1 (Abbildung 1) einzufädeln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anstelle einer Nadel verwenden Sie gekrümmte scharfe Zangen, um ein Ende einer 10 cm Langen 7-0 Seide zu erfassen. Durchdringen Sie die Spitze des Herzens von einer Seite eindringen und die Spitzen der Zange durch den Muskel und von der anderen Seite passieren. Greifen Sie die Seide mit einem anderen Satz Zange und ziehen Sie etwa 2 cm Länge durch und binden Sie ab. Nehmen Sie das verbleibende 8 cm Ende der Naht, zerren Sie das Herz kauarisch, und band das Ende auf das chirurgische Brett. HINWEIS: Dies erzeugt Spannung, setzt die großen Gefäße weiter frei und hängt das Herz an Ort und Stelle, was eine einfachere Platzierung des Katheters in der Lungenarterie ermöglicht.</li>
	<li>Haken Sie die Spitzen der gekrümmten Zange unter der AA und PAT. Ziehen Sie eine 3 cm Länge von 7-0 Seide zurück durch die Öffnung und erstellen Sie eine einzelne Wurf lose Naht.</li>
	<li>Mit einer Schere machen Sie einen 1-2 mm Schnitt in Richtung der Spitze des Herzens, durchdringen die dünnwandigen rechten Ventrikel (RV), um das Einführen des Katheters (Einheit 1) zu ermöglichen. Bestätigen Sie vor dem Einsetzen, dass sich keine Luft im System befindet. Führen Sie den grundierten Schlauch in den rechten Ventrikel ein und gelangen Sie vorsichtig in den halbtransparenten dünnwandigen PAT.<ol>
<li>Stellen Sie visuell sicher, dass der Katheter weder in den linken noch in den rechten Lungenzweig vorgerückt ist und nicht an den Zweigpunkt der Lungenarterie anschließt. Mit Klebeband, sichern Sie den distalen Teil des Schlauches auf dem operationschirurgischen Brett. HINWEIS: Um das Wohnmobil zu identifizieren, verwenden Sie Zangen, um die rechte Seite des Herzens zu kneifen. Im Gegensatz zum linken Ventrikel sollte die relativ dünne freie Wand des Wohnmobils leicht zu erfassen sein.</li>
		<li>Bei Mäusen, die jünger als P7 sind, schließen Sie Block 2 an einen Mikromanipulator an und führen Sie das Nadelende der Einheit wie oben beschrieben mit dem Manipulator in das PAT ein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ziehen Sie vorsichtig die lose Naht um beide großen Gefäße und schneiden Sie die 8 cm Länge der Naht in Schritt 3.2 erstellt, um das Herz in eine natürliche Ruheposition zurück. Der Katheter ist nun innerhalb des PAT fest gesichert.</li>
	<li>Clip die linke Ohrmuschel des Herzens, damit Perfusate das System verlassen kann.</li>
	<li>Sichere SNP-haltige Spritze (Einheit 1 oder Einheit 2, größenabhängig) in der Spritzenpumpe und durchdringen Die Lösung mit einer Rate von 0,05 ml/min, um das Blut zu spülen und die Vaskulatur maximal zu erweitern. Blut/Perfusate wird über die abgeschnittene Aurikel verlassen. Setzen Sie die Perfusion fort, bis Perfusate klar verläuft (bei einer erwachsenen Maus 200 ,L, weniger für jüngere Tiere). HINWEIS: Bei der Durchlässigkeit der niedrigen Viskosität PBS/SNP wurde eine relativ höhere Infusionsrate verwendet, um Zeit zu sparen. Die zähflüssigere Polymerverbindung wird langsamer infundiert, um Überfüllung, Bruch und maximierte Kontrolle über distale Endpunkte zu verhindern.</li>
</ol>4. Tracheostomie und Lungeninflation
<ol><li>Konstruieren Sie die Lungeninflationseinheit (Abbildung 2).<ol>
<li>Verbinden Sie einen flexiblen 24 G intravenösen (IV) Katheter (Nadel entfernt)/Schmetterlingsinfusion mit einem Stopphahn, der an einer offenen 50 ml Spritze (kein Kolben) befestigt ist. Hängen Sie die Spritze von einem Ringständer.</li>
		<li>Fügen Sie 10% gepuffertes Formalin in die Spritze. Öffnen Sie den Hahn, so dass Formalin in den Schlauch eindringen und die gesamte Luft aus dem System reinigen kann. Schließen Sie den Hahn und heben Sie die Spritze an, bis der Meniskus 20 cm über der Luftröhre8liegt. VORSICHT: Formalin ist entzündlich, krebserregend, bei der Verunstaltung akut toxisch und verursacht Hautreizungen, schwere Augenschäden, Sensibilisierung der Haut und Mutagenität der Keimzellen. Vermeiden Sie Einnahme und Kontakt mit Haut und Augen. Vermeiden Sie das Einatmen des Dampfes oder Nebels. Von Zündquellen fernhalten. Tragen Sie eine geeignete persönliche Schutzausrüstung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie zwei lose Nähte unter dem Cricoid Knorpel 2-4 mm auseinander.</li>
	<li>Mit der Schere, machen Sie einen kleinen Schnitt in der Cricothyroid Band überlegen, die Nähte.</li>
	<li>Setzen Sie den IV-Katheter in die Öffnung ein und bringen Sie die Spitze über die beiden lockeren Nähte hinaus.</li>
	<li>Ziehen Sie die Nähte um die Luftröhre und öffnen Sie den Hahn. Lassen Sie das Formalin durch Schwerkraft in die Lunge eindringen und warten Sie 5 min, bis sich die Lunge vollständig aufbläht. Wenn die Lunge während der Inflation am Brustkorb haftet, greifen Sie die Außenseite des Brustkorbs mit stumpf gekippten Zangen und bewegen Sie sich in alle Richtungen, um bei der Befreiung der Lappen zu helfen. Nehmen Sie keinen direkten Kontakt mit der Lunge auf.</li>
	<li>Nach 5 min, zurück der IV Katheter über die erste Naht und Ligate. Wiederholen Sie dies für die zweite Naht. Die Lunge ist nun in einem geschlossenen, unter Druck stehenden Zustand aufgeblasen.</li>
</ol>5. Gießen der Vaskulatur
<ol><li>In einem 1,5 ml Rohr 1 ml einer 8:1:1-Lösung8 polymer:verdünnt:härtungsmittel vorbereiten und mehrmals sanft invertieren, um eine gute Mischung zu gewährleisten.</li>
	<li>Entfernen Sie den Kolben von einer 1-c-Ccs-Spritze, bedecken Sie das gegenüberliegende Ende mit einem gehandicapten Finger und gießen Sie die Polymerverbindung in die Spritze. Setzen Sie den Kolben vorsichtig wieder ein, invertieren Sie ihn und bringen Sie den Kolben voran, um die luftige Luft zu entfernen und an der Spitze der Spritze einen Meniskus zu bilden.</li>
	<li>Entfernen Sie die SNP/PBS-Spritze von der Nabe der Nadel und tropfen Sie zusätzliche PBS in die Nabe, um einen Meniskus zu erzeugen. Überprüfen Sie die Drehscheibe sorgfältig auf eingeschlossene Luft, lösen Sie sie bei Bedarf und reformieren Sie den Meniskus. Verbinden Sie die Nabe mit der spritze, die mit der Polymerverbindung gefüllt ist. HINWEIS: Das Erstellen eines Meniskus an beiden Enden verringert die Wahrscheinlichkeit, dass Luft in das System gelangt.</li>
	<li>Befestigen Sie die gefüllte Polymerverbindung an der Spritzenpumpe und infundieren Sie sie bei 0,02 ml/min. HINWEIS: Bei kleineren Lungen kann eine langsamere Rate hilfreich sein, um eine Überfüllung zu verhindern, ist aber nicht unbedingt erforderlich.</li>
	<li>Überwachen Sie die Verbindung, während sie sich frei nach unten bewegt die PE-Schläuche und notieren Sie das Spritzenvolumen, wenn es in den PAT eintritt. Füllen Sie weiter, bis alle Lappen vollständig bis zur Kapillarebene gefüllt sind und stoppen Sie die Spritzenpumpe. Überprüfen Sie das Spritzenvolumen erneut. HINWEIS: Nach mehreren Durchläufen kann ein geschätztes Volumen verwendet werden, um einen ungefähren Endpunkt zu messen (35 L für eine erwachsene Maus und 5 L für einen P1-Welpen). Nach dem Anhalten der Pumpe wird der Restdruck im System die Polymerverbindung weiterhin in die Lungenarterien schieben. Alle Lungenlappen sollten mit einer ähnlichen Rate füllen.</li>
	<li>Bedecken Sie die Lunge mit einem Glasfaser-Reinigungstuch, wenden Sie PBS freimütig an und lassen Sie den Kadaver 30-40 min bei Raumtemperatur ungestört sitzen. Während dieser Zeit wird die Polymerverbindung aushärten und aushärten.</li>
	<li>Entfernen Sie den Katheter, trennen Sie die Arme/untere Hälfte der Maus, und legen Sie den Kopf/Thorax in eine 50 ml konische gefüllt mit 10% gepufferten Formalin über Nacht gefüllt.</li>
	<li>Nach der Fixierung die Luftröhre greifen und die Herz-Lungen-Einheit sanft vom restlichen Rippenkäfig und Thorax trennen. Legen Sie den Herz-Lungen-Block in eine formal in gefüllte Szintillationsflasche. Verwerfen Sie den Rest.</li>
</ol>6. Alternative Gefäßbetten zum Gießen (Tabelle 1)
HINWEIS: Jedes Zielgefäßbett kann unterschiedliche Katheterplatzierungen, Infusionsraten und optimale Füllzeiten erfordern. Daher werden mehrere Tiere notwendig sein, um mehrere Organe zu werfen.
<ol><li>Befolgen Sie bei systemischen Gefäßbetten, die der Membran überlegen oder unterlegen sind, die Schritte 1.1-2.5 wie oben. Weitere Hinweise zum Portalsystem und zur Membran (Tabelle 1).</li>
	<li>Greifen Sie den xiphoiden Prozess mit einem Hämostat und schneiden Sie den Brustkorb bilateral (etwa in der midaxillären Linie) kurz vor den inneren Brustarterien.</li>
	<li>Falten Sie den noch verbundenen Brustkorb so, dass er auf dem Hals/Kopf des Tieres ruht und die Brusthöhle vollständig freilegt.</li>
	<li>Folgen Sie Schritt 3.1 oben, und entfernen Sie dann die Lunge. Sobald die Thoraxaorta (TA) sichtbar ist, haken Sie die Spitzen der gekrümmten Zangen darunter, 10 mm höher als die Membran. Greifen Sie eine 3 cm Lange von 7-0 Seide, ziehen Sie zurück durch die Öffnung unter der TA, und erstellen Sie eine einzelne Wurf lose Naht. Wiederholen Sie diesen Vorgang um 8 mm über der Membran.</li>
	<li>Verwenden Sie für Strukturen, die der Membran überlegen sind, eine Federschere, um ein kleines Loch (30 % des Gesamtumfangs) auf dem ventralen Teil der TA zu erzeugen, 2 mm niedriger als die losen Nähte, die in Schritt 6.4 platziert sind.<ol>
<li>Für Strukturen, die der Membran unterlegen sind, erstellen Sie stattdessen ein kleines Loch von 2 mm, das den losen Nähten überlegen ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Je nach Tiergröße Einheit 1 oder 2 in das Gefäß einführen, über lose Nähte hinausgehen und das Gefäß sanft auflegen.</li>
	<li>Folgen Sie Schritt 3.7, stellen Sie die Spritzenpumpe auf eine Rate von 1,0 ml/min ein und durchdringen Sie mindestens 5 ml. Perfusate wird über das IVC verlassen.</li>
	<li>Befolgen Sie die Schritte 5.1 - 5.4, um die Infusionsrate auf 0,05 ml/min anzupassen und das Zielgewebe in Echtzeit visuell zu überwachen. HINWEIS: Das Infusionsvolumen wird organ- und tieraltersspezifisch sein. Das Volumen kann weiter begrenzt werden, indem arterielle Zweige, die zu nicht zielorientierten Gefäßbetten (d. h. Gehirn, Leber, Niere, Darm) führen.</li>
	<li>Folgen Sie 5.6 dann entfernen Zielgewebe und platzen in formalin.</li>
</ol>7. Probenmontage, Scan und Rekonstruktion für Micro-CT
<ol><li>Erstellen Sie mit Paraffinfolie eine flache Oberfläche auf dem Scanbett und zentrieren Sie die nasse Probe auf dieser Oberfläche (Abbildung 3A). HINWEIS: Wenn Bewegungsartefakt erkannt wird, kann die Probe eine weitere Stabilisierung erfordern.</li>
	<li>Leicht Zelt-/Abdeckungsprobe mit zusätzlicher Paraffinfolie zur Vermeidung von Austrocknung. Achten Sie besonders darauf, den Paraffinfilm nicht auf der Probe zu ruhen, was zu einer Verformung des Gewebes führt (Abbildung 3B).</li>
	<li>Scannen Sie das Beispiel anhand der in Tabelle 2 beschriebenen Einstellungen, und standardisieren Sie diese Parameter innerhalb eines bestimmten Experiments. HINWEIS: Dies ist experiment/endpunktabhängig. Standardisieren Sie die ausgewählten Parameter für die einfache Vergleich zwischen Stichproben.</li>
	<li>Übertragen Sie die rekonstruierten Scans für die Nachbearbeitung und Analyse.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten

Diese Methode, die richtig ausgeführt wird, liefert eindrucksvolle Bilder von pulmonalen arteriellen Netzwerken, die Vergleich und Experimente in Nagetiermodellen ermöglichen. Mehrere kritische Schritte auf dem Weg sorgen für den Erfolg. Zunächst müssen die Ermittler das Tier in der Vorbereitungsphase heparinisieren, um zu verhindern, dass sich Blutgerinnsel in der Lungenvaskulatur und den Kammern des Herzens bilden. Dies ermöglicht den vollständigen arteriellen Transit von Polymerverbindungen. Zweitens, wenn Sie das Zwe...

Der Schwerpunkt dieser Technik liegt auf der Visualisierung der pulmonalen arteriellen Architektur mit einer polymerbasierten Verbindung bei Mäusen. Während umfangreiche Arbeiten an systemischen Gefäßbetten wie Gehirn, Herz und Niere1,2,3,4,5durchgeführt wurden, stehen weniger Informationen über die Vorbereitung und Füllung des lungenarterienartigen Netzwerks zur Verfügung. Das Ziel dieser Studie ist es daher, auf frühere Arbeiten6,7,8 zu erweitern und eine detaillierte schriftliche und visuelle Referenz zu liefern, die die Forscher leicht folgen können, um hochauflösende Bilder des Lungenarterienbaums zu erzeugen.
Während es zahlreiche Methoden zur Kennzeichnung und bildgebenden Lungenvaskulatur gibt, wie Magnetresonanztomographie, Echokardiographie oder CT-Angiographie9,10, können viele dieser Modalitäten die kleinen Gefäße nicht ausreichend füllen und/oder erfassen, was den Umfang dessen, was untersucht werden kann, begrenzt. Methoden wie serielle Schnitte und Rekonstruktionen bieten eine hohe Auflösung, sind aber zeit-/arbeitsintensiv11,12,13. Die umgebende Weichteilintegrität wird in traditionellen Korrosionsguss10,13,14,15,16kompromittiert. Auch Tieralter und -größe werden zu Faktoren, wenn man versucht, einen Katheter einzuführen, oder die Auflösung fehlt. Die Polymerinjektionstechnik hingegen füllt die Arterien auf kapillarer Ebene und ermöglicht in Kombination mit dem CT eine unvergleichliche Auflösung5. Proben aus der Mauslunge, die noch jung sind, wurden bis zum 14. Tag erfolgreichgegossen und innerhalb weniger Stunden verarbeitet. Diese können auf unbestimmte Zeit erneut gescannt oder sogar zur histologischen Präparat-/Elektronenmikroskopie (EM) geschickt werden, ohne das vorhandene Weichgewebe17zu beeinträchtigen. Die Haupteinschränkungen dieser Methode sind die Vorabkosten von CT-Geräten/-software, Herausforderungen bei der genauen Überwachung des intravaskulären Drucks und die Unfähigkeit, Daten längs im selben Tier zu erfassen.
Dieses Papier baut auf bestehenden Arbeiten auf, um die Pulmonale-Arterieninjektionstechnik weiter zu optimieren und alters-/größenbezogene Grenzen auf den postnatalen Tag 1 (P1) zu verschieben, um markante Ergebnisse zu erzielen. Es ist am nützlichsten für Teams, die arterielle Gefäßnetzwerke studieren möchten. Dementsprechend bieten wir neue Anleitungen für die Katheterplatzierung/-stabilisierung, eine erhöhte Kontrolle über Füllrate/Volumen und weisen auf bemerkenswerte Fallstricke für einen erhöhten Gusserfolg hin. Die resultierenden Gussteile können dann für zukünftige Charakterisierungen und morphologische Analysen verwendet werden. Vielleicht noch wichtiger ist, dass dies die erste visuelle Demonstration ist, nach unserem Wissen, die den Benutzer durch dieses komplizierte Verfahren führt.

<table><tbody><tr><td>1cc Spritze</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>20ml Glas Szintillation Fläschchen</td><td>Fisher</td><td>03-340-25P</td><td></td></tr><tr><td>30G Nadel</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>50mL konische Röhrchen</td><td>Cornin</td><td>352098</td><td>Zum Aufbewahren und Scannen von Proben</td></tr><tr><td>60cc Spritze</td><td>Becton Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>7-0 Seide Naht</td><td>Teleflex</td><td>103-S</td><td></td></tr><tr><td>Analyze 12.0 Software</td><td>AnalyzeDirect Inc.</td><td>N/A</td><td>Primärsoftware</td></tr><tr><td>Amira 6.7 Software</td><td>Thermo Scientific</td><td>N/A</td><td>Alternative Software</td></tr><tr><td>CeramaCut Schere 9cm</td><td>Fine Science Werkzeuge</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>Keramikbeschichtete gebogene Pinzette</td><td>Fine Science Werkzeuge</td><td>11272-50</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Tank</td><td>Robert's Oxygen Co.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Spritzenpumpe</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-74900-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Mini-Pinzette</td><td>Fine Science Werkzeuge</td><td>11200-14</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma - Life Sciences</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Gaze</td><td>Covidien</td><td>441215</td><td></td></tr><tr><td>Hämostat</td><td>Fine Science Werkzeuge</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Heparin (1000USP Einheiten/ml)</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2720-01</td><td></td></tr><tr><td>Horos Software</td><td>Horos Project</td><td>N/A</td><td>Alternative Sofware</td></tr><tr><td>Induktionskammer</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td>faseroptisches Reinigungstuch</td></tr><tr><td>Beschriftungsband</td><td>Fisher</td><td>15966</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische Basis</td><td>Kanetec</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT System</td><td>PerkinElmer</td><td>Quantum GX</td><td></td></tr><tr><td>Microfil (Polymer Compound)</td><td>Flowech Inc.</td><td>Kit B - MV-122</td><td>8 Unzen MV-Verbindung; 8 Unzen Verdünnungsmittel; MV-Curing Agent</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Stoelting</td><td>56131</td><td></td></tr><tr><td>Monoject 1/2 ml Insulinspritze</td><td>Covidien</td><td>1188528012</td><td></td></tr><tr><td>Octagon Pinzette Gerade Zähne</td><td>Fine Science Werkzeuge</td><td>11042-08</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis company, Inc.</td><td></td><td></td>#PM999</tr><tr><td>PE-10 Schlauch</td><td>Instech</td><td>BTPE-10</td><td></td></tr><tr><td>Phospahte gepuffert Kochsalzlösung</td><td>BioRad</td><td>#161-0780</td><td></td></tr><tr><td>Ringständer</td><td>Fisher</td><td>S13747</td><td>Höhe 24in.</td></tr><tr><td>Natriumnitroprussid</td><td>sigma</td><td>71778-25G</td><td></td></tr><tr><td>Stahlplatte</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>16 x 16 Zoll Fläche, 1/16 Zoll dick</td></tr><tr><td>Gerade Federschere</td><td>Fine Science Werkzeuge</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>SURFLO 24G Teflon IV Katheter</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>360103</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisches Brett</td><td>Fisher</td><td>12-587-20</td><td>Dies ist ein umgebauter Objektträgerhalter</td></tr><tr><td>Universal 3-Zacken Klemme</td><td>Fisher</td><td>S24280</td><td></td></tr><tr><td>Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Schlauch</td><td>Nipro</td><td>PR25G19</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Stemi-508 Dissektions-Zielfernrohr</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

vaskuläres gießen von erwachsenen und frühpostnatalen mauslungen für micro-ct imaging

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blutgefäße bilden komplizierte Netzwerke im dreidimensionalen Raum. Daher ist es schwierig, visuell zu schätzen, wie vaskuläre Netzwerke interagieren und sich verhalten, indem sie die Oberfläche eines Gewebes beobachten. Diese Methode bietet eine Möglichkeit, die komplexe dreidimensionale Gefäßarchitektur der Lunge zu visualisieren.
Um dies zu erreichen, wird ein Katheter in die Lungenarterie eingeführt und die Vaskulatur wird gleichzeitig von Blut gespült und chemisch erweitert, um den Widerstand zu begrenzen. Die Lunge wird dann bei einem Standarddruck durch die Luftröhre aufgeblasen und die Polymerverbindung wird bei einer Standarddurchflussrate in das Gefäßbett infundiert. Sobald das gesamte arterielle Netzwerk gefüllt ist und geheilt werden kann, kann die Lungenvaskulatur direkt visualisiert oder auf einem Mikro-CT-Scanner abgebildet werden.
Wenn erfolgreich durchgeführt, kann man das lungenarteriende Netzwerk bei Mäusen vom frühen postnatalen Alter bis zu Erwachsenen zu schätzen wissen. Darüber hinaus kann diese Methode, während sie im pulmonalen Arterienbett demonstriert wird, auf jedes Gefäßbett mit optimierter Katheterplatzierung und Endpunkten angewendet werden.

Eine erfolgreiche Besetzung wird eine gleichmäßige Befüllung des gesamten Lungenarteriennetzes aufweisen. Wir zeigen dies in C57Bl/6J-Mäusen im Alter: Postnataler Tag P90 (Abbildung 4A), P30 (Abbildung 4B), P7 (Abbildung 4C) und P1 (Abbildung 4D). Durch die Steuerung der Durchflussrate und die visuelle Überwachung der Füllung in Echtzeit wurden zuverlässige Endpunkte der...

Das Ziel dieser Technik ist die ex vivo Visualisierung von pulmonalen arteriellen Netzwerken von frühpostnatalen und erwachsenen Mäusen durch Lungeninflation und Injektion einer radio-opaque polymerbasierten Verbindung über die Lungenarterie. Mögliche Anwendungen für gegossenes Gewebe werden ebenfalls diskutiert.

Vaskuläres Gießen von Erwachsenen und frühpostnatalen Mauslungen für Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Dieses Protokoll gibt eine präzise, schrittweise Anleitung für das Gießen der pulmonalen arteriellen Vaskulatur sowohl bei erwachsenen als auch bei frühen postnatalen Mäusen. Diese Technik ermöglicht es Benutzern, das gesamte Gefäßnetzwerk vollständig für die Visualisierung durch eine Vielzahl von Methoden, einschließlich Mikro-CT, zu gießen und gleichzeitig die Integrität des Weichgewebes zu erhalten. Diese Technik ist besonders nützlich für die Betrachtung der pulmonalen vaskulären Morphologie und Architektur, kann aber leicht für das Targeting anderer Gefäßbetten angepasst werden.Wie viele Operationen und Sezierungen gibt es keinen Ersatz für die Visualisierung eines Verfahrens, und die Zuschauer können davon profitieren, einige der anspruchsvolleren Manöver durchzuführen. Sobald der xiphoide Prozess freigelegt ist, greifen sie den Rippenkäfig vorsichtig und heben. Machen Sie vorsichtig einen Schnitt in der jetzt exponierten, halbtransparenten Membran.Die Lunge bricht sichtbar zusammen und zieht sich vom Zwerchfell zurück. Nach der Exposition der Lunge und Luftröhre, Faden 15 Zentimeter PE10 Schläuche auf die Nabe einer 30-Spur-Nadel. Und befestigen Sie dieses Gerät an einer Ein-Milliliter-Spritze, die 10 an den 4 Mol Natriumnitroprussid in PBS enthält.Steigen Sie in den Kolben, um die Schläuche zu grundieren, bis die gesamte Luft gereinigt ist. Als effektive Alternative zum Text, durchdringen Sie die Spitze des Herzens auf der einen Seite, und passieren Sie die Spitzen der gekrümmten Zange durch den Muskel, und aus der anderen Seite des Gewebes. Greifen Sie ein Ende einer 10-Zentimeter-Länge von 7-0 Seide, und ziehen Sie etwa zwei Zentimeter durch das Gewebe.Nachdem Sie die Naht abbanden, verwenden Sie die restlichen acht Zentimeter Naht, um das Herz kauarisch zu ziehen. Und klebe das Ende der Naht auf das Operationsbrett. Haken Sie die Spitzen der gekrümmten Zange sowohl unter der aufsteigenden Aorta und Lungenarterie Stamm.Und ziehen Sie eine Drei-Zentimeter-Länge von 7-0 Seide zurück durch die Öffnung, um eine einzelne Wurf lose Naht zu schaffen. Verwenden Sie eine Schere, um einen Ein- bis zwei Millimeter Schnitt in Richtung der Spitze des Herzens zu machen, durchdringen sie die dünnwandige rechte Herzkammer. Und führen Sie den grundierten Schlauch in den rechten Ventrikel ein und leiten Sie den Katheter sanft in den halbtransparenten, dünnwandigen Lungenarterienstamm.Stellen Sie visuell sicher, dass der Katheter weder in den linken noch in den rechten Lungenzweig vorgerückt ist und nicht an den Zweigpunkt der Lungenarterie anschließt. Kleben Sie den distalen Teil des Schlauches an das Operationsbrett, und ziehen Sie die lose Naht um die beiden großen Gefäße sanft fest. Schneiden Sie das acht Zentimeter große Stück Naht, um das Herz in eine natürliche Ruheposition zurückzuversetzen.Und clip das linke Orakel des Herzens, damit der Perfusate die Vaskulatur verlassen kann. Verwenden Sie dann eine Spritzenpumpe, um das Natriumnitroprussid mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min zu gießen, um sowohl das Blut zu spülen, als auch die Vaskulatur maximal zu erweitern, bis das Perfusat klar verläuft. Um die Lungenaufblaseinheit zu konstruieren, schneiden Sie den flexiblen 24-Spur-Intravenus-Katheter aus einer Wanne und verbinden Sie sich mit der Nadel eines Schmetterlingsinfusionssets.Befestigen Sie dieses Gerät am Hahn und befestigen Sie den Hahn an einer offenen 50-Milliliter-Spritze. Nach dem Beladen der Spritze mit Formalin und Grundierung des Katheters, mit dem Stopcock geschlossen, positionieren Sie die Spritze in einem Ringständer, bis zu dem Punkt, an dem der Meniskus 20 Zentimeter über der Luftröhre ist. Legen Sie zwei lose Nähte, zwei bis vier Millimeter voneinander entfernt, schlechter als der cricoid Knorpel, und verwenden Sie eine Schere, um einen kleinen Schnitt in der Cricothyroid-Band zu machen, besser als die Nähte.Setzen Sie den Katheter in die Öffnung ein und bringen Sie die Spitze über die beiden lockeren Nähte hinaus. Ziehen Sie die Nähte um die Luftröhre, und öffnen Sie den Stopphahn, damit das Formalin durch die Schwerkraft in die Lunge gelangen kann. Warten Sie fünf Minuten, bis sich die Lunge vollständig aufbläht.Wenn die Lunge während der Inflation am Rippenkäfig haftet, verwenden Sie stumpfe Zangen, um die Außenseite des Rippenkäfigs zu erfassen, und bewegen Sie die Rippen in alle Richtungen, um bei der Befreiung der Lappen zu helfen, ohne direkten Kontakt mit der Lunge zu nehmen. Nach fünf Minuten, ziehen Sie den Katheter hinter der ersten Naht und Ligate. Dann ziehen Sie den Katheter hinter der zweiten Naht und Ligate.Die Lunge sollte nun in einem geschlossenen, unter Druck stehenden Zustand aufgeblasen werden. Um die Vaskulatur zu gießen, laden Sie einen Milliliter einer 8-1-1 Lösung des Polymerverdünnungsmittels in eine Ein-Milliliter-Spritze. Und legen Sie den Kolben vorsichtig ein.Wenn die Spritze invertiert ist, drücken Sie den Kolben, um die Luft zu entfernen, und um die Bildung eines Meniskus an der Spitze der Spritze zu ermöglichen. Entfernen Sie die Natrium-Nitroprussid-Spritze von der Nabe der Nadel und tropfen Sie die Zugabe PBS in die Nabe, um einen Meniskus zu erzeugen. Verbinden Sie die Polymer-Compound-Spritze mit der Nabe, und starten Sie die Infusion mit 0,02 Millimetern pro Minute.Überwachen Sie die Verbindung, während sie sich frei durch den Schlauch bewegt, und notieren Sie das Spritzenvolumen, während es in den Rumpf der Lungenarterie eintritt. Setzen Sie die Fülle fort, bis alle Lappen vollständig gefüllt sind, bis zum kleinsten Gefäß. Stoppen Sie die Pumpe, und notieren Sie noch einmal das Spritzenvolumen.Bedecken Sie die Lunge mit einem faseroptischen Reinigungstuch, und wenden Sie PBS freimütig an. Lassen Sie das Exemplar 30 bis 40 Minuten ungestört bei Raumtemperatur sitzen. Sobald die Polymerverbindung ausgehärtet und gehärtet ist, trennen Sie die Gliedmaßen und die untere Hälfte der Maus.Und legen Sie den Kopf und Thorax in eine 50-Milliliter konisch gefüllt 10%gepuffert Formalin, über Nacht. Greifen Sie am nächsten Morgen die Luftröhre, um Herz und Lunge sanft vom verbleibenden Rippenkäfig und Thorax zu trennen. Legen Sie den geernteten Gewebeblock in eine formal gefüllte Szintillationsdurchstechflasche.Eine erfolgreiche Besetzung führt zu einer gleichmäßigen Befüllung des gesamten Lungenarteriennetzes. Wenn die Lungen- oder Lungenwege beschädigt werden, verhindern kleine Lecks, dass die Lunge Druck hält. Eine patchy oder unvollständige Füllung kann durch eine Luftschleuse entstehen, da Luft über den Katheter in das Gefäßsystem eingebracht wird, wodurch der nachgeschaltete Fluss der Verbindung blockiert wird.Unterfüllung tritt auf, wenn zu wenig Verbindung in die Vaskulatur eingeführt wird. Alternativ kann eine Überfüllung oder zu schnelle Einführung zu viel Polymerverbindung zu arteriellen Bruch oder, häufiger, venöser Transit führen. Das Vorrücken des Katheters zu weit nach unten den Lungenstamm kann dazu führen, dass sich die Spitze in einen Lungenarterienzweig verkeilt, wodurch ein Ungleichgewicht im Durchfluss entsteht und eine Seite schneller als die andere füllt.Sorgfältige Leistung der Technik, wie gezeigt, mit der entsprechenden direkten Überwachung der distalen Vaskulatur Endpunkte, und Standard-Infusionsraten können zu einer optimalen Füllung der Lungenvaskulatur führen. Darüber hinaus kann die Anpassung dieser Technik an die systemische Vaskulatur in anderen Gefäßbetten gleichermaßen günstige Ergebnisse liefern. Nach dem Gießen können Proben für mikrocomputerische Tomographie-Scans verarbeitet werden.Für die Nachbearbeitung kann ein kommerzielles Softwarepaket verwendet werden, um eine 3D-Volumenwiedergabe des Lungen-Gefäßbaums zu erzeugen. Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal versuchen, seien Sie besonders vorsichtig um die zerbrechliche Lunge und die Lungenarterie. Am wichtigsten ist, vermeiden Sie das Einbringen von Luft in den Gefäßkreislauf.Nach einer erfolgreichen Besetzung kann eine Probe mit micro-CT gescannt werden, und Fragen der vaskulären Morphometrie und Architektur können untersucht werden.

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