CRISPR-Cas9-Vermittelte Genombearbeitung in der filamentösen Ascomycete Huntiella omanensis

Unser Protokoll ist von Bedeutung, weil es Forschern, die an Nicht-Modellpilzen arbeiten, die Möglichkeit gibt, modernste Genom-Editing-Technologien in ihren Labors zu etablieren. Da es sich nicht auf vorhandene Techniken wie Ausdruckssysteme stützt, hat dieses Protokoll den Vorteil, dass es in Systemen, die nicht modellhaft sind, leichter etabliert werden kann. Diese Methode kann für verschiedene Pilzarten verwendet werden und kann verwendet werden, um Funktionen von Genen zu klären, die an der Signalwegpaarung, Wachstum und Pathogenität beteiligt sind.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens muss man also sicher sein, genügend aufeinanderfolgende Tage zu haben, um das Protokoll zu konkurrieren, da es nur wenige Punkte im Experiment gibt, an denen es angehalten werden kann. Um die Konidien zu ernten, filtern Sie die flüssige Kultur durch eine Schicht steriler Labortücher in 50 Milliliter Zentrifugenrohre für die Zentrifugation. Setzen Sie das Conidia-Pellet in fünf Milliliter Wasser aus und sehen Sie sich ein 10-Mikroliter-Aliquot der Conidia-Lösung unter einem Lichtmikroskop bei einer 40-fachen Vergrößerung an, um zu bestätigen, dass nur Conidia zurückgewonnen wurden.

Als nächstes 200 Milliliter frische 1%Malz-Extraktbrühe zu einem 500-Milliliter-Kolben hinzufügen und das gesamte Volumen von Conidia in den Kolben übertragen. Dann bebrüten Sie die flüssige Kultur für bis zu 12 Stunden in einem 25 Grad Celsius Schütteln Inkubator bei 120 Umdrehungen pro Minute. Um die Keime zu ernten, übertragen Sie die Kultur auf 50 Milliliter Zentrifugenrohre für die Zentrifugation und setzen Sie die Keime in bis zu 10 Milliliter eines Molarensorbitols wieder auf.

Fügen Sie einen Milliliter Keimlösung zu verschiedenen Konzentrationen der Enzymlösung hinzu und inkubieren Sie die Sporenenzymlösung für zwei bis drei Stunden im Schüttelinkubator bei 80 Umdrehungen pro Minute. Um die Protoplaste zu ernten, filtern Sie die Enzymlösung durch eine Schicht steriler Labortücher und sammeln Sie die Protoplaste durch Zentrifugation. Dann setzen Sie das Protoplastpellet in 200 Mikroliter STC-Puffer sorgfältig wieder auf und überprüfen Sie einen 10-Mikroliter-Aliquot der Lösung unter dem Mikroskop, um zu bestätigen, dass nur Protoplasten zurückgewonnen wurden.

Um die Transformation zu beginnen, kombinieren Sie etwa fünf mal 10 zu den sechs Protoplasten mit einem einzigen Volumen Ribonukleoproteinlösung und etwa sechs Mikrogramm des Spender-DNA-Fragments. Als nächstes verwenden Sie eine Pipette, um langsam und gleichmäßig einen Milliliter frisch zubereitete 30%PTC-Lösung auf die Protoplastsuspension zu tropfen, um eine hydrophobe Schicht über den Protoplasten zu erzeugen und die Lösung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur zu inkubieren. Am Ende der Inkubation fünf Milliliter osmotisches Steuermedium in die Protoplastsuspension geben und langsam und schonend pipetieren, um die Lösung gründlich zu mischen.

Nach dem Mischen die Protoplastlösung im Schüttelinkubator bei 80 Umdrehungen pro Minute über Nacht inkubieren. Am nächsten Morgen, teilen Sie die Lösung auf fünf 60-Millimeter-Kulturplatten. Fügen Sie 10 Milliliter osmotische Kontrollmedium Agar ergänzt mit 30 Mikrogramm pro Milliliter Hygromycin B zu jeder Platte und drehen Sie langsam jede Platte zu mischen.

Lassen Sie die erste Schicht agar setzen, bevor Sie 10 Milliliter osmotische kontrollmittel Agar ergänzt mit 40 Mikrogramm pro Milliliter Hygromycin B zwei pro Platte. Nachdem die zweite Agarschicht gesetzt werden kann, bebrüten Sie die Kulturen bei 25 Grad Celsius, bis einzelne Isolate beobachtet werden können, die durch beide Agarschichten wachsen. Um die erfolgreich transformierten Isolate zu bergen, übertragen Sie die einzelnen wachstumsfähigen Isolate auf frische Malzextrakt-Agarplatten, die mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Hygromycin ergänzt werden, B.To die Auswirkungen der gezielten Genstörung auf die heterothallicischen Fähigkeiten des Pilzes bewerten, frisches Malzextrakt-Agarmedium mit einem mutierten Stamm sowie einen Stamm des gegenüberliegenden Paarungstyps mitinokulieren.

Bei der Arbeit mit H.omanensis, decken, aber nicht versiegeln die Platten. Legen Sie die Platten sieben Tage lang bei Raumtemperatur auf. Am Ende der Inkubation, visuell für die Produktion von sexuellen Strukturen bewerten.

Um die homothallic Fähigkeiten des mutierten Stammes zu testen, impfen Sie frischemalsäureextraktagarmedium mit dem mutierten Stamm von Interesse und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für eine Woche, wie gezeigt. Um die Auswirkungen der Störung auf die Wachstumsrate des zu untersuchenden Pilzes zu bewerten, legen Sie die Rückseite einer großen sterilen Pipettenspitze in die aktiv wachsenden Ränder der Kultur jedes mutierten und wilden Interessensstammes ein, um mycelial bedeckte Agar-Stecker zu schaffen und frisches Malzextrakt-Agarmedium zu impfen. Pro Kulturtyp sollten mindestens drei Replikationen durchgeführt werden.

Nach drei Tagen Wachstum bei 20 Grad Celsius, messen Sie das Wachstum in jeder Platte auf zwei senkrechte Durchmesser. Conidia, die als Ausgangsmaterial für das Protokoll verwendet werden, dürfen keimen und wachsen, bis sie zu jungen Keimen werden. Beachten Sie, dass reife Myzelstränge wie diese zu reif für den Abbau sind und nicht verwendet werden sollten.

Wenn die Zellen keine Zellwände mehr haben, werden sie sehr empfindlich gegenüber mechanischen Störungen und lösen runde Protoplasten frei, die für die Transformation geerntet werden können. Der Erfolg des Protokolls kann durch eine phänotypische Analyse der mutierten Stämme bestätigt werden. Bei diesem mutierten MAT 127-Isolat wurde die vegetative radiale Wachstumsrate signifikant reduziert, was auf eine pleiotrope Wirkung für das neuartige Paarungsgen hindeutet.

Darüber hinaus war das mutierte Isolat nicht in der Lage, einen Sexualzyklus zu vollenden, der nur unreife Sexualstrukturen produzierte, die keine sexuellen Sporen produzierten, verglichen mit dem Wildtyp-Isolat, das den gesamten Sexualzyklus innerhalb weniger Tage nach der Inkubation abschloss. RNA ist sehr empfindlich und verschlechtert sich sehr leicht. Daher sind ein sauberes Arbeitsumfeld und schnelles Arbeiten auf Eis für den Erfolg dieses Experiments unerlässlich.

Sobald mutiertes Isolat erfolgreich erzeugt wurde, können sie einer phänotypischen oder RNA-seq-Analyse unterzogen werden, je nach dem gen, das charakterisiert wird.