Graphengehäuse chemisch fixierter Säugetierzellen für die Flüssigphasenelektronenmikroskopie

Diese Methode hält biologische Proben in einer nativen Umgebung und reduziert Elektronenstrahl-induzierte Artefakte. Der Hauptvorteil ist, dass diese Technik auf ganze Zellen anwendbar ist. So müssen Zellen vor der Elektronenmikroskopie nicht dehydriert, gebeizt oder geschnitten werden.

Die Fähigkeit, Rezeptoren auf Krebszellen im Kontext der gesamten intakten Plasmamembran abzubilden, ist ein wichtiger Aspekt, der zu neuen Therapieansätzen und der Entwicklung neuer Krebsmedikamente führen kann. Ich werde die Arbeit mit Zellen, Graphenbeschichtung und Mikroskopie zeigen, und Sercan Keskin wird zeigen, wie man das Graphen zubereitet. Zunächst fügen Sie 100 Mikroliter Zellsuspension in zwei Brunnen einer 96-Well-Platte mit PLL- und FLP-beschichteten Mikrochips mit nach oben gerichteter Siliziumnitridmembran und 50 Mikroliter serumfreiem Medium hinzu.

Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für fünf Minuten, damit Zellen sich an den Mikrochip anheften können. Überprüfen Sie die Dichte der Zellen auf dem Mikrochip mit einem invertierten Mikroskop und stellen Sie sicher, dass die Zellen das Fenster mit genügend Platz zum Abflachen und Haften bedecken. Um HER2 in den Zellen zu beschriften, legen Sie die Mikrochips in die Brunnen der ersten Reihe der Etikettierplatte.

Dann waschen Sie die Mikrochips mit PBS BSA. Um eine unspezifische Bindung des Antikörpers mimetisch zu verhindern, inkubieren Sie die Mikrochips mit PBS BSA GS für fünf Minuten. Dann mit 200 nanomolaren Antikörper mimetisch für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.

Um das PMMA-Graphen aus dem Polymer zu entfernen, pipette ein paar Tröpfchen Wasser auf dem Polymer um das PMMA-Graphen. Tauchen Sie es dann in Wasser mit einem Winkel von 30 bis 45 Grad ein, um das PMMA-Graphen freizusetzen. Um kupferbasierte Verunreinigungen zu ätzen, eine 50-Milliliter-Lösung von 0,42 Mol-Natriumpersulfat in Wasser zu reparieren.

Verwenden Sie einen Standard-Glasschlitten, um PMMA-Graphen mit der Graphenseite nach unten in die Natriumpersulfatlösung zu übertragen. Das PMMA-Graphen schwebt an die Spitze der Lösung. Lassen Sie es dort über Nacht.

Am nächsten Tag das PMMA-Graphen aus der Natriumpersulfatlösung in sauberes Wasser übertragen. Lassen Sie es für eine halbe Stunde im Wasser schweben. Wiederholen Sie die Wäsche insgesamt dreimal, um alle Natriumpersulfatrückstände aus dem PMMA-Graphen zu entfernen.

Übertragen Sie dann das PMMA-Graphen auf einen Natriumchloridkristall. Bereiten Sie eine gesättigte Lösung von Natriumchlorid in Wasser in einer Petrischale vor und übertragen Sie das PMMA-Graphen auf die Lösung mit der Graphenseite nach unten. Halten Sie den Natriumchloridkristall mit einer Pinzette und nehmen Sie das schwimmende PMMA-Graphen auf.

Halten Sie es dann zwei Minuten lang vertikal, um überschüssiges Wasser herausfließen zu lassen. Lassen Sie es auf Raumtemperatur für 30 Minuten trocknen und backen Sie es im Ofen bei 100 Grad Celsius für 20 Minuten. Entfernen Sie das Wasser vollständig.

Aceton in einer glasigen Petrischale auf ca. 50 Grad Celsius auf einer Kochplatte in der Dunstabzugshaube vorheizen. Achten Sie sorgfältig auf die Temperatur, um Feuer zu vermeiden. Das PMMA-Graphen auf Salz in die mit Aceton gefüllte Petrischale eintauchen und 30 Minuten lang das PMMA auflösen lassen.

Lassen Sie das Graphen auf Salz lufttrocknen, bevor Sie es zur Probenvorbereitung verwenden. Waschen Sie einen vorbereiteten und beschrifteten Mikrochip in reinem Wasser, um Salzrückstände aus dem Puffer zu entfernen und auf Filterpapier zu legen. Die Zellen sollten als dunkle Flecken sichtbar sein.

Verwenden Sie eine Rasierklinge, um das mehrschichtige Graphen auf dem Natriumchloridkristall in ein Stück zu schneiden, das in das Siliziumnitridfenster eines Mikrochips passt. Entfernen Sie das Graphen aus dem Natriumchloridkristall, indem Sie es in ein Becherglas mit Wasser tauchen und den Kristall in einem 45-Grad-Winkel in Bezug auf die Oberfläche kippen. Fangen Sie das Graphen mit einer Metallschleife von der Oberfläche des Wassers, dann berühren Sie die obere Oberfläche des Mikrochips mit der unteren Schleifenoberfläche, wodurch der Mikrochip an der Metallschleife klebt.

Das Graphen ist auf dem Mikrochip zu sehen. Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop Filterpapier, um das restliche Wasser aus dem Mikrochip zu entfernen, sodass das Graphen alle Zellen im Siliziumnitridfenster abdeckt. Legen Sie den Mikrochip mit einer Pinzette auf ein Filterpapier.

Das Graphen ist als violetter Schimmer auf dem Mikrochip sichtbar. Übertragen Sie den Mikrochip vom Papier in ein Fach Petrischale. Pipette ein Tröpfchen Wasser in einem der freien Fächer und schließen Sie den Deckel, um eine wassergesättigte Atmosphäre zu bieten.

Versiegeln Sie dann die Fachschale mit Paraffinfolie und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius im Kühlschrank. Stellen Sie den STEM auf 200 Kilovolt Strahlenergie ein, indem Sie eine Ausrichtungsprobe für eine Sondengröße von mindestens 0,2 Nanometern verwenden, indem Sie die Kondensatorlinsen einstellen. Stellen Sie einen Sondenstrom von 180 Picoampere und einen Strahlkonvergenzhalbwinkel von 13,2 Milliradians ein, indem Sie eine Blende einfügen.

Stellen Sie den Halbwinkelbereich des ADF-MINT-Detektors auf 68 bis 280 Milliradians ein, indem Sie die Einstellungen der Projektorlinse anpassen. Legen Sie dann die MINT-Bildgröße auf 2048 um 2048 Pixel und die Pixelverweilzeit auf sechs Mikrosekunden fest. Laden Sie den Mikrochip mit graphenbeschichteten Zellen in einen Standard-Probenhalter für Tem so, dass die Zellen nach oben gerichtet sind und den Halter in das Elektronenmikroskop laden.

Verschaffen Sie sich ein Übersichtsbild bei 800 X Vergrößerung. Identifizieren Sie dann einen Bereich von Interesse und Bild der Quantenpunkt-Nanopartikel bei 80.000 X mit einer Pixelgröße von 1,3 Nanometern. Optimal gesäte Zellen werden hier gezeigt.

Das Fenster ist bedeckt, aber es gibt genügend Platz, damit sie sich abflachen und haften können. Wenn zu viele Zellen auf einem Mikrochip gesät wurden, war nicht genügend Platz für alle Zellen, um sich zu haften. Nach 24 Stunden flachte mehr als die Hälfte der Zellen nicht ab.

Wenn zu wenige Zellen gesät werden, erhält das Siliziumnitridfenster nach 24 Stunden einen großen leeren Raum. Hier werden DIC- und Fluoreszenzbilder von optimal gesäten Zellen gezeigt, die eine erfolgreiche Kennzeichnung von HER2 belegen. STEM wurde an graphenbeschichteten und unbeschichteten SKBR3-Zellen durchgeführt.

Die Eingaben in den 800 X Vergrößerungsbildern wurden bei 80.000 X abgebildet. Die Quantenpunkt-Nanopartikel sind als helle Flecken bei 50.000 X Vergrößerung sichtbar. Um die Wirkung der Elektronenstrahlbeleuchtung auf die Probe zu untersuchen, wurden in einer Bildserie mit einer akkumulierenden Elektronendosis STEM-Bilder aufgenommen. Repräsentative Ergebnisse für nicht beschichtete und graphenbeschichtete Proben werden hier gezeigt.

Die Exposition von nicht beschichteten Proben führte zu hellen Strukturen auf den Zelloberflächen, die bei keiner der graphenbeschichteten Proben auftraten. Die durchschnittliche relative Entfernungsänderung der Partikelpaare blieb bei nicht beschichteten Proben unter 1,3 % und bei den beschichteten Proben unter 0,8 %. Nach diesem Verfahren können verschiedene Arten von Membranproteinen auf ganzen Zellen mit anderen Mikroskopiemethoden abgebildet werden.

Diese Technik ermöglicht es, Proteine in der intakten Plasmamembran abzubilden, um mehr Informationen über die Organisation der Plasmamembran und die Wechselwirkung zwischen Proteinen zu erhalten.