Name: Angebundene Doppelschicht-Lipidmembranen zur Überwachung der Wärmeübertragung zwischen Goldnanopartikeln und Lipidmembranen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Erfahren Sie die Überwachung der Wärmeübertragung von Goldnanopartikeln zu angebundenen Doppelschicht-Lipidmembranen mittels Impedanzspektroskopie. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen für photothermale Therapien.

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Diese Arbeit wurde vom Australian Research Council (ARC) Discovery Program (DP150101065) und dem ARC Research Hub for Integrated Device for End-user Analysis at Low-levels (IDEAL) (IH150100028) unterstützt.

1. tBLMs Elektroden vorbereitung
<ol><li>Vorbereitung der ersten Monolayer-Beschichtung<ol>
<li>Tauchen Sie einen frisch gesputterten goldgemusterten Elektrodenmikroskopobjektträger in eine ethanolische Lösung, die aus einem 3 mM 1: 9-Verhältnis von Benzyldisulfid-Tetra-Ethyleneglykol-OH-"Spacer"-Molekülen (Benzyldisulfid bestand aus vier Sauerstoff-Ethylenglykol-Abstandhaltern, die mit einer OH-Gruppe abgeschlossen wurden) und Benzyldisulfid (Tetra-Ethylenglykol) n = 2 C20-Phytanyl "angebundene" Moleküle. Dadurch entsteht die erste Schichtbeschichtung, auf der eine Doppelschicht verankert werden kann. HINWEIS: Die Goldelektrode wird durch Verdampfen von 100 nm, 99,9995% Gold (5n5 Gold) Film auf benutzerdefinierte 25 mm x 75 mm Polycarbonat-Dias20hergestellt.</li>
		<li>Inkubieren Sie Elektroden mit der ersten Schicht bei Raumtemperatur für mindestens 1 h.</li>
		<li>Spülen Sie die Goldelektroden aus, indem Sie über 30 s in reichlich reines Ethanol eintauchen.</li>
		<li>Verwenden Sie den Goldelektrodenschieber mit der ersten Monoschicht direkt für den nächsten Schritt oder lagern Sie ihn in einem Glas voller reinem Ethanol.</li>
		<li>HINWEIS: Um die Integrität der ersten Schicht zu gewährleisten, minimieren Sie jeden direkten Kontakt mit den Goldanteilen des Objektträgers.</li>
	</ol></li>
	<li>Montage des ersten monoschichtbeschichteten Schlittens<ol>
<li>Nehmen Sie vorsichtig einen koplanaren Goldelektrodenschieber mit einer Pinzette aus seinem Behälter und achten Sie darauf, keinen Kontakt mit den gemusterten Bereichen aufzunehmen, in denen sich die tBLMs bilden. HINWEIS: Achten Sie darauf, die Seite des Objektträgers zu identifizieren, auf der das Gold abgelagert wird.</li>
		<li>Lufttrockener Gleiten für 1 - 2 min, um Restethanol zu entfernen.</li>
		<li>Legen Sie die Goldelektrode über eine trockene Oberfläche und stellen Sie sicher, dass die Goldelektrode korrekt ausgerichtet ist und die Gemusterte Goldoberfläche nach oben zeigt.</li>
		<li>Ziehen Sie die transparente Klebeschichtabdeckung von einem dünnen Laminat und legen Sie sie über die 6 Kanäle, um jeden Brunnen zu definieren.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Andruckwalze, um Luft zwischen dem Schlitten und der transparenten Klebeschicht freizugeben, wie in Abbildung 1A dargestellt. HINWEIS: Die für diesen Schritt benötigte Zeit muss vom Forscher optimiert werden. In diesem Protokoll liegen die Zeiten zwischen 2-3 Minuten.</li>
		<li>Sobald möglich (innerhalb von 1-2 Minuten) die zweite Lipiddoppelschicht zur Selbstmontage in die montierte erste monolayerbeschichtete Elektrode eingeführt wird, um eine Beschädigung der ersten Schicht zu vermeiden.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung der zweiten Lipiddoppelschicht<ol>
<li>Fügen Sie 6 μL mit 3 mM Lipiden von Interesse zur ersten Bohrung der sechs Bohrer hinzu. Lassen Sie den Rand der Mikropipettenspitze nicht die Goldoberfläche berühren, wodurch die angebundenen Chemikalien an der Elektrode beschädigt werden können. HINWEIS: Die in dieser Arbeit verwendete Lipidmischung bestand aus 3 mM 70% zwitterionischen C20-Diphytanyl-Ether-Glycero-Phosphatidylcholin (DPEPC) und 30% C20-Diphytanyldiglycetherlipiden (GDPE), gemischt mit 3 mM Cholesterin-PEG-Biotin im Molarverhältnis 50:1.</li>
		<li>6 μL der Lipidmischung in die anderen Vertiefungen mit einem Abstand von 10 s zwischen jeder Zugabe geben.</li>
		<li>Inkubieren Sie jede Vertiefung für genau 2 min bei Raumtemperatur, bevor Sie das Lipidgemisch über die Elektroden mit einem Puffer wie PBS austauschen. Die Zeiten für die Addition und den Pufferaustausch liegen 10 s auseinander, so dass jede Vertiefung jeweils genau 2 Minuten mit dem Lipid inkubiert wird.</li>
		<li>3 weitere Male mit 50 μL PBS-Puffer (pH 7,0) waschen. Achten Sie darauf, jederzeit 50 μL Puffer über den Elektroden zu lassen. Lassen Sie die Elektroden nicht trocknen. HINWEIS: Die Verdrängung des Ethanollösungsmittels mit der wässrigen Lösung auf diese Weise (Lösungsmittelaustauschmethode)ermöglicht die schnelle Bildung einer einzigen Lipiddoppelschicht, die über die angebundenen Chemikalien an der Goldelektrode verankert ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Prüfung der tBLM-Bildung mittels messungen der elektrischen Impedanzspektroskopie (EIS)<ol>
<li>Setzen Sie den vorbereiteten Elektrodenschieber in ein AC-Impedanzspektrometer (z. B. Tethapod) ein. Stellen Sie sicher, dass das Spektrometer über einen USB-Anschluss an einen Computer angeschlossen ist, auf dem die Software ausgeführt wird.</li>
		<li>Öffnen Sie die Software, klicken Sie auf Setup und öffnen Sie Hardware.</li>
		<li>Stellen Sie die Hardwareeinstellungen so ein, dass 25 mV Peak-to-Peak AC-Anregung verwendet wird.</li>
		<li>Stellen Sie Frequenzen zwischen 0,1 und 10.000 Hz mit zwei Schritten pro Jahrzehnt für schnelle Impedanzmessungen ein.</li>
		<li>Klicken Sie auf das Menü Setup und öffnen Sie Modell.</li>
		<li>Verwenden Sie ein äquivalentes Schaltungsmodell, das die Anbinde-Goldelektrode als konstantes Phasenelement in Reihe mit einem Widerstand beschreibt, der den Elektrolytpuffer beschreibt, und einem parallelen Widerstands-Kondensator-Netzwerk, um die Lipiddoppelschicht zu beschreiben, und drücken Sie OK.</li>
		<li>Drücken Sie die Starttaste, um eine Echtzeitmessung der Membrankapazität (Cm)und der Membranleitung (Gm)zu starten. Cm-Werte typischer tBLMs sollten im Bereich von 12,5 nF bis 15,5 nF für 10% gebundene Chemikalienliegen 21,22.</li>
		<li>Nachdem Sie das Protokoll ausgeführt und das Experiment abgeschlossen haben, speichern Sie die Daten.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Messung mit der nächsten Vertiefung.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Laserbestrahlung
<ol><li>Versuchsaufbau HINWEIS: Das maßgeschneiderte System wird für jeden tBLM gut individuell eingerichtet.<ol>
<li>Führen Sie Experimente in einer lichtdichten Box durch, um den Laser gefährlich zu minimieren.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Optiktabelle, um das Experiment einzurichten, um unerwünschte Vibrationen zu reduzieren.</li>
		<li>Platzieren Sie den Impedanzleser, an dem der Goldschlitten angeschlossen ist, auf einer XYZ-Bühne und heben Sie ihn so an, dass er im Weg der Laserquelle sitzt.</li>
		<li>Verwenden Sie grob-feinfokussierendes mikroskopisches Getriebe, um die Höhe der Laserquelle zu steuern, um die entsprechende Präzision zu erreichen.</li>
		<li>Richten Sie den Laserpfad entlang der Längsachse des Elektrodenträgers aus. ACHTUNG: Tragen Sie immer eine geeignete Laserschutzbrille und pflegen Sie gute Lasersicherheitsprotokolle.</li>
		<li>Lassen Sie den ausgewählten abgestimmten Laser stabilisieren, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. HINWEIS: Ein Schema des Versuchsaufbaus ist in Abbildung 2Adargestellt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ausrichtung von Laser- und Goldelektroden HINWEIS: Bevor Sie beginnen, bewerten Sie immer die Laserleistung mit einem Leistungsmesser, um sicherzustellen, dass nur sehr geringe Wattagen an die tBLMs geliefert werden.<ol>
<li>Stellen Sie entweder den Laserweg oder den Winkel der Elektrode so ein, dass der Laser durch die Flüssigkeit geht, die die Elektrode bedeckt, und nur gleichmäßig an der Goldoberfläche sichtbar ist.</li>
		<li>Passen Sie die Laserstrahllichtposition für jedes Experiment an, indem Sie die Laserstrahlquelle mithilfe der Feineinstellung anheben oder senken, während Sie Änderungen der Membranleitfähigkeit beobachten.</li>
		<li>Verriegeln Sie den Knopf, um die Position des Laserpfads zu sichern, wenn keine Leitfähigkeitsänderungen beobachtet werden. HINWEIS: Erhöhte Membranleitwertwerte werden erzeugt, wenn der Laser mit der darunter liegenden Goldelektrode interagiert. Es ist daher wichtig, den Laserweg so einzustellen, dass solche Wechselwirkungen nicht möglich sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Probenvorbereitung<ol>
<li>Bereiten Sie die Ausrichtung des Laserstrahllichts vor (bei der sich der Membranleitwert nicht ändert), wie in Abbildung 2, Position 3 dargestellt.</li>
		<li>Fügen Sie dem PBS-Puffer, in den die tBLMs eingetaucht sind, während der Laser ausgeschaltet ist, interessante GNPs (funktionalisiert oder nackt) hinzu.</li>
		<li>Mischen Sie den PBS-Puffer, der die tBLMs umgibt, dreimal vorsichtig und achten Sie darauf, die Elektrode nicht zu berühren.</li>
		<li>5-10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Schalten Sie den Laser ein, um die Probe zu bestrahlen, wobei Sie die korrekt ausgerichtete Laserstrahllichtposition verwenden, wie in Abbildung 2, Position 3 dargestellt.</li>
		<li>Verwenden Sie die geeignete Kombination aus GNPs Größe, Form und Konzentration mit Laserlichtwellenlänge. HINWEIS: Der Laserstrahl der eingestellten Wellenlänge sollte an die entsprechende BSP-Plasmon-Resonanzfrequenz gekoppelt werden.</li>
		<li>Erfassen Sie den gemessenen Strom kontinuierlich (Echtzeitmessungen).</li>
		<li>Führen Sie die Schritte 2.2.1 - 2.3.7 aus, wobei die BSP-Zugabe für die Kontrollexperimente weggelassen wird.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Statistische Datenanalyse und Darstellung
<ol><li>Exportieren Sie die Daten in eine Tabelle.</li>
	<li>Extrahieren Sie den Membranleitwertparameter im Vergleich zur Zeit.</li>
	<li>Verwenden Sie die aufgezeichneten Daten nach dem Einstellen eines Laserstrahllichts mit der richtigen Position und vor der Einführung von GNPs.</li>
	<li>Normalisieren Sie die Daten, indem Sie den gemessenen Membranleitwert über den Basismembranleitwert aufteilen. HINWEIS: Dies bestätigt, dass relative Veränderungen der Membranleitungswerte durch eingeführte bestrahlte BSP hervorgerufen werden.</li>
	<li>Präsentieren Sie Daten als Zeitdiagramme (x-Achse) im Vergleich zur normalisierten Membranleitung (y-Achse).</li>
</ol>4. Vorhersage der Menge an lokalisierter Wärme, die in den tBLMs aus bestrahlten Nanopartikeln erzeugt wird (thermisches Vorhersagemodell)
<ol><li>Lösen Sie das Strahlungsübertragungsproblem nach Dombrovsky23, um die absorbierte Strahlungsleistung in bestrahlten Nanopartikellösungen zu berechnen.</li>
	<li>Berechnen Sie die Wärmeentwicklung, indem Sie die Wärmequelle aufgrund der absorbierten Strahlung in die Energiegleichung einbeziehen. HINWEIS: Eine detaillierte Erläuterung der numerischen Analyse der Wärmeentwicklung in den tBLMs aus bestrahlten Nanopartikeln und der Nanomaterial-Elektroden-Grenzfläche finden Sie in 19.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären die folgenden finanziellen Interessen/persönlichen Beziehungen, die als potenzielle konkurrierende Interessen angesehen werden können: Prof. Bruce Cornell ist Direktor - Wissenschaft und Technologie bei Surgical Diagnostics SDx tethered membranes Pty. Ltd.

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung des tBLM-Modells mit einem koplanaren Elektrodensubstrat in Verbindung mit einer horizontalen Laserausrichtung, die die Aufzeichnung der elektrischen Impedanz in Echtzeit als Reaktion auf die Laserbestrahlung von Goldnanopartikeln ermöglicht. Die hier vorgestellte Methode der EIS-Aufzeichnung erstellt eine minimale Liste von Experimenten, die notwendig sind, um Ionenstromänderungen über die Membran aufzuzeichnen, die der Wärme entsprechen, die du...

Die hyperthermische Leistung bestrahlter Gold-Nanomaterialien bietet eine neue Klasse minimalinvasiver, selektiver und gezielter Behandlung von Infektionen und Tumoren1. Die Verwendung von Nanopartikeln, die mit einem Laser erhitzt werden können, wurde verwendet, um erkrankte Zellen selektiv zu zerstören und ein Mittel zur selektiven Wirkstoffabgabebereitzustellen 2,3. Eine Folge der Photothermolysephänomene erhitzter plasmonischer Nanopartikel ist eine Schädigung der Zellmembranen. Die flüssige Lipiddoppelschichtmembran gilt als besonders anfällige Stelle für Zellen, die sich solchen Behandlungen unterziehen, da die Denaturierung intrinsischer Membranproteine sowie Membranschäden auch zum Zelltod führen können4, da viele Proteine dazu da sind, den Ionenpotentialgradienten über Zellmembranen aufrechtzuerhalten. Während die Fähigkeit, die Wärmeübertragung auf der Nanoskala zu bestimmen und zu überwachen, von zentralem Interesse für die Untersuchung und Anwendung von bestrahlten BSP1,5,6,7, Bewertung und Verständnis der molekularen Wechselwirkungen zwischen BSP und Biomembranen sowie der direkten Folgen der laserinduzierten Erwärmungsphänomene eingebetteter BSP in biologischen Geweben ist, müssen noch vollständig aufgeklärt werden8. Daher bleibt ein gründliches Verständnis des Hyperthermieprozesses von bestrahlten BSP eine Herausforderung. Daher könnte die Entwicklung einer Nanomaterial-Elektroden-Grenzfläche, die die natürliche Umgebung von Zellen nachahmt, ein Mittel sein, um die Wärmeübertragungseigenschaften von bestrahlten Goldnanopartikeln innerhalb biologischer Systeme eingehend zu untersuchen.
Die Komplexität nativer Zellmembranen ist eine der wesentlichen Herausforderungen beim Verständnis der bestrahlten GNPs-Wechselwirkungen in Zellen. Es wurden verschiedene künstliche Membranplattformen entwickelt, um nahe an einfachen biomimetischen Versionen der natürlichen Lipidmembranarchitektur und -funktionalität zu liefern, einschließlich, aber nicht beschränkt auf schwarze Lipidmembranen9,unterstützte planare Doppelschichtmembranen10,hybride Doppelschichtmembranen11,polymergepolsterte Lipiddoppelschichtmembranen12 und gebundene Doppelschichtlipidmembranen13. Jedes künstliche Lipidmembranmodell hat deutliche Vorteile und Einschränkungen in Bezug auf die Nachahmung der natürlichen Lipidmembranen14.
Diese Studie beschreibt den Einsatz von lipidmembranbeschichteten Elektroden als Sensor zur Beurteilung von Goldnanopartikel- und Lipidmembranwechselwirkungen unter Verwendung des tBLM-Modells. Das tBLM-basierte Biosensor-Detektionsschema bietet inhärente Stabilität undEmpfindlichkeit 13, da angebundene Membranen sich selbst reparieren können, im Gegensatz zu anderen Systemen (wie Membranen, die durch Patch-Clamp oder Liposomen gebildet werden), bei denen nur eine geringe Menge an Membranschäden zu ihrem Kollapsführt 15,16,17,18. Da tBLMs mm2 Abmessungen haben, ist die Hintergrundimpedanz um Größenordnungen niedriger als bei Patch-Clamp-Aufzeichnungstechniken, was eine Aufzeichnung von Veränderungen des Basalmembranionenflusses aufgrund von Nanopartikelwechselwirkungen ermöglicht. Infolgedessen kann das vorliegende Protokoll Änderungen der Membranleitfähigkeit durch gebundene GNPs kontrastieren, die von Lasern angeregt werden, deren Leistung so niedrig wie 135 nW / μm2 ist.
Das hier vorgestellte System bietet eine empfindliche und reproduzierbare Methode zur Bestimmung präziser Laserparameter, Partikelgröße, Partikelbeschichtungen und Zusammensetzung, die für die Entwicklung und Entwicklung thermischer Therapien erforderlich sind. Dies ist entscheidend für die Verfeinerung neuer photothermischer Therapien und bietet wertvolle Informationen für detaillierte Mechanismen der Wärmeübertragung innerhalb biologischer Systeme. Das vorgestellte Protokoll basiert auf bereits veröffentlichten Arbeiten19. Ein Überblick über das Protokoll ist wie folgt: Der erste Abschnitt definiert die tBLM-Formation; Im zweiten Abschnitt wird beschrieben, wie das Setup aufgebaut und die Anregungslaserquelle ausgerichtet wird. Der letzte Abschnitt veranschaulicht, wie Informationen aus den Daten der elektrischen Impedanzspektroskopie extrahiert werden.

<table><tbody><tr><td>Streptavidin-konjugierte Gold-Nanopartikel mit einem Durchmesser von 30 nm</td><td>Zytodiagnostik</td><td>AC-30-04-05</td><td>Dies ist ein gebrauchsfertiges Streptavidin-konjugiertes GNPs-Produkt</td></tr><tr>Blanke<td>Gold-Nanopartikel mit einem Durchmesser von 30 nm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>753629</td><td>Dies ist ein gebrauchsfertiges Bare-GNPs-Produkt</td></tr><tr><td>Cholesterin-PEG-Biotin (MW1000)</td><td>NANOCS</td><td>PG2-BNCS-10k</td><td>Gelöst in hochreinem Ethanol</td></tr><tr><td>C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholin-Lipide</td><td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td><td>SDx-S1</td><td>1 ml Durchstechflasche aus Glas mit 70 % C16-Diphytanylphosphatidylcholin (DPEPC) und 30 % C16-Diphytanylglycerin (GDPE) in 99,9 % Ethanol</td></tr><tr><td>Benzyldisulfid-tetra-ethylenglykol-OH</td><td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td><td>SDx-S2</td><td>Spacermoleküle</td></tr><tr><td>Benzyldisulfid (Tetraethylenglykol) n=2 C20-phytanyl&nbsp;</td><td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td><td>SDx-S2</td><td>Angebundene Moleküle</td></tr><tr><td>532 nm grüner Laser Dauerlicht</td><td>OBIS LS/OBIS CORE LS, China</td><td>ND-1000</td><td>Die Leistung dieses Lasers betrug ~135&nbsp; mW&nbsp;</td></tr><tr><td>tethaPod EIS-Lesegerät</td><td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td><td>SDx-R1</td><td>Ein Lesegerät für Leitwert und Kapazität auf sechs Kanälen gleichzeitig</td></tr><tr><td>tethaPlate Kartuschenbaugruppe</td><td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td><td>SDx-BG</td><td>Materialien zur Befestigung des Objektträgers mit Elektroden an der Durchflusszellenkartusche</td></tr><tr><td>Klemm- und Objektträgermontagevorrichtung</td><td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td><td>SDx-A1</td><td>Materialien zur Befestigung des Objektträgers mit Elektroden an der Durchflusszellenkartusche</td></tr><tr><td>Lipidbeschichtete koplanare Goldelektroden</td><td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td><td>SDx-T10</td><td>koplanare&nbsp&�te Elektroden bestehen aus 25 mm x 75&nbsp; mm x&nbsp; 1&nbsp; mm Polycarbonat-Basissubstrat mit gemustertem Gold-Array-Layout, dann beschichtet mit Benzyldisulfid, Bis-Tetraethylenglykol C16 Phytanyl-Halbmembran, die die Halteseile in einem Halteverhältnis von 10 % überspannt;</td></tr><tr><td>tethaQuick Software</td><td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td><td>SDx-B1</td><td>Software zur Verwendung mit tethaPod zur Verarbeitung von Daten und Anzeige von Leitwert-, Impedanz- und Kapazitätsmessungen von den tethaPlate Elektroden</td></tr><tr><td>&nbsp; 99,9% reines Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>34963</td><td>Absolut,&nbsp; 99,9</td></tr><tr><td>%Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>pH 7</td></tr></tbody></table>

angebundene doppelschicht-lipidmembranen zur Überwachung der wärmeübertragung zwischen goldnanopartikeln und lipidmembranen

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Hier berichten wir über ein Protokoll zur Untersuchung der Wärmeübertragung zwischen bestrahlten Goldnanopartikeln (GNPs) und Zweischichtlipidmembranen durch Elektrochemie unter Verwendung von gebundenen Doppelschichtlipidmembranen (tBLMs), die auf Goldelektroden montiert sind. Bestrahlte modifizierte BSP, wie Streptavidin-konjugierte BSP, sind in tBLMs eingebettet, die Zielmoleküle wie Biotin enthalten. Mit diesem Ansatz werden die Wärmeübertragungsprozesse zwischen bestrahlten GNPs und der Modelldoppelschichtlipidmembran mit interessierenden Entitäten durch einen horizontal fokussierten Laserstrahl vermittelt. Das thermische Prädiktive Rechenmodell wird verwendet, um die elektrochemisch induzierten Leitfähigkeitsänderungen in den tBLMs zu bestätigen. Unter den verwendeten spezifischen Bedingungen erforderte die Detektion von Wärmeimpulsen eine spezifische Befestigung der Goldnanopartikel an der Membranoberfläche, während ungebundene Goldnanopartikel keine messbare Reaktion hervorrufen konnten. Diese Technik dient als leistungsstarker Detektionsbiosensor, der direkt für das Design und die Entwicklung von Strategien für thermische Therapien verwendet werden kann, die eine Optimierung der Laserparameter, der Partikelgröße, der Partikelbeschichtungen und der Zusammensetzung ermöglichen.

Das Goldsubstrat, auf dem tBLMs erzeugt werden können, ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein Schema des Versuchsaufbaus ist in Abbildung 2 dargestellt.
Koplanare Goldelektroden, wie in Abbildung 1Agezeigt, bestehen aus 25 mm x 75 mm x 1 mm Polycarbonat-Basissubstrat mit gemusterten Goldarrays. Eine transparente Klebeschicht definiert die sechs einzelnen Messkammern. Die koplanare Goldelektrode ermöglicht di...

Diese Arbeit skizziert ein Protokoll zur dynamischen, nicht-invasiven Überwachung der Wärmeübertragung von laserbestrahlten Goldnanopartikeln auf tBLMs. Das System kombiniert Impedanzspektroskopie zur Echtzeitmessung von Leitfähigkeitsänderungen über die tBLMs hinweg mit einem horizontal fokussierten Laserstrahl, der die Goldnanopartikelbeleuchtung antreibt, zur Wärmeerzeugung.

Angebundene Doppelschicht-Lipidmembranen zur Überwachung der Wärmeübertragung zwischen Goldnanopartikeln und Lipidmembranen

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

Dieses Protokoll bietet eine Nanomaterial-Elektroden-Grenzfläche, die natürliche Zellmembranen nachahmt, und ermöglicht es, die Wirkung der lokalisierten Wärmeübertragung von bestrahlten Goldnanopartikeln auf die Integrität einer biologischen Membran zu bestimmen. Die Nanopartikel- und photothermischen Effekte können in Echtzeit an Modellzellmembranen erforscht werden. Bei dieser Technik wird ein biomimetisches Membransystem verwendet, um photothermische Effekte auf ein biologisches System zu beobachten und zu untersuchen, die sich aus der Wärme ergeben, die durch die Wechselwirkung von Goldnanopartikeln mit Licht erzeugt wird, indem die Leitfähigkeits- und Kapazitätsänderungen über die Modellzellmembran gemessen werden.Der Einsatz von Nanopartikeln und die photothermische Therapie sind vielversprechend als potenzielle Krebstherapie. Diese Methode gibt direkt Aufschluss darüber, wie sich dieser Ansatz auf Zellen auswirkt. Diese Plattform liefert wertvolle Daten für die Entwicklung von Strategien für thermische Therapien, die eine Optimierung der Laserparameter, der Partikelgröße, der Partikelbeschichtungen und der Zusammensetzung ermöglichen.Das Verfahren wird von den UTS-Forschern Professor Stella Valanzuela und Dr. Amani Alghalayini zusammen mit Professor Bruce Cornell von der chirurgischen Diagnostik demonstriert. Nehmen Sie zunächst vorsichtig eine koplanare Goldelektrode mit einer Pinzette aus dem Behälter und achten Sie darauf, dass sie nicht mit den gemusterten Bereichen in Berührung kommt, in denen sich das tBLMS bildet. Trocknen Sie den Objektträger ein bis zwei Minuten lang an der Luft, um Ethanolreste zu entfernen.Legen Sie dann die Zielelektrode mit der gemusterten Goldoberfläche nach oben auf eine trockene Oberfläche. Ziehen Sie die transparente Klebeschicht von einem dünnen Laminat ab und legen Sie sie über die sechs Kanäle, um jede Vertiefung zu definieren. Verwenden Sie eine Andruckrolle, um die Luft zwischen dem Objektträger und der transparenten Klebeschicht abzulassen.Führen Sie innerhalb von ein bis zwei Minuten die zweite livide Doppelschicht zur Selbstorganisation in die zusammengesetzte erste monolagenbeschichtete Elektrode ein. Geben Sie sechs Mikroliter von drei millimolaren Lipiden von Interesse in die erste Vertiefung des Objektträgers mit sechs Vertiefungen, ohne den Rand der Mikropipettenspitze mit der Goldoberfläche zu berühren, was die angebundenen Chemikalien auf der Elektrode beschädigen kann. Geben Sie sechs Mikroliter der Lipidmischung in die anderen Vertiefungen mit einem Abstand von zehn Sekunden zwischen jeder Ausgabe.Inkubieren Sie jede Vertiefung genau zwei Minuten lang bei Raumtemperatur. Tauschen Sie das Lipidgemisch über die Elektroden mit einem Puffer wie PBS aus, wobei die Zeiten für die Zugabe und den Pufferwechsel im Abstand von 10 Sekunden angeordnet sind, so dass jede Vertiefung genau zwei Minuten lang mit einem Lipid inkubiert wird. Waschen Sie die Elektroden noch dreimal mit 50 Mikrolitern PBS-Puffer, lassen Sie dabei immer 50 Mikroliter Puffer über den Elektroden und lassen Sie sie nicht trocknen.Führen Sie den vorbereiteten Elektrodenschieber in ein AC-Impedanzspektrometer ein. Stellen Sie sicher, dass das Spektrometer über den USB-Anschluss an einen Computer angeschlossen ist, auf dem die Software ausgeführt wird. Öffnen Sie die Software, klicken Sie auf Einrichten und öffnen Sie Hardware.Stellen Sie die Hardwareeinstellungen auf 25 Millivolt ein, sprechen Sie mit Spitzen-ACX-Zitation und stellen Sie die Frequenzen zwischen 0,5 und 10.000 Hertz mit zwei Schritten pro Dekade für schnelle Impedanzmessungen ein. Drücken Sie OK, klicken Sie dann auf das Setup-Menü und öffnen Sie das Modell. Unter Verwendung eines Ersatzschaltungsmodells, das die Tethering-Goldelektrode als konstantes Phasenelement in Reihe mit dem Elektrolytpuffer als Widerstand und einem parallelen Widerstandskondensatornetzwerk beschreibt, um die Lipiddoppelschicht zu beschreiben, drücken Sie dann auf OK.Drücken Sie die Starttaste, um eine Echtzeitmessung der Membrankapazität und der Membranleitung zu starten. Nachdem Sie das Protokoll ausgeführt und das Experiment abgeschlossen haben, speichern Sie die Daten. Wiederholen Sie die Messung mit der nächsten Vertiefung.Verwenden Sie einen Optiktisch, um das Experiment einzurichten, um unerwünschte Vibrationen zu reduzieren, und führen Sie Experimente in einer lichtdichten Box durch, um die Lasergefährdung zu minimieren. Schnüren Sie den Impedanzleser dort, wo die Goldseite auf einem XYZ-Tisch angeschlossen ist. Und heben Sie es so an, dass es im Weg der Laserquelle sitzt.Verwenden Sie eine grobe Fokussierung, um die Höhe der Laserquelle zu steuern und die entsprechende Position zu erreichen. Richten Sie den Laserweg entlang der Längsachse des Elektrodenschlittens aus und lassen Sie den ausgewählten abgestimmten Laser stabilisieren. Bevor Sie beginnen, bewerten Sie die Laserleistung mit einem Leistungsmesser, um sicherzustellen, dass nur sehr geringe Wattzahlen an die tBLMs abgegeben werden.Stellen Sie entweder den Laserweg oder den Winkel der Elektrode so ein, dass der Laser durch die Flüssigkeit dringt, die die Elektrode bedeckt, und gerade noch gleichmäßig auf der Goldoberfläche sichtbar ist. Passen Sie die Lichtposition des Laserstrahls für jedes Experiment an, indem Sie die Laserstrahlquelle mit der Feineinstellung anheben oder absenken, während Sie Änderungen des Membranleitwerts beobachten. Verriegeln Sie den Knopf, um die Position des Laserpfads zu sichern, wenn keine Leitwertänderungen aufgrund der Wechselwirkung des Lasers mit der darunter liegenden Goldelektrode beobachtet werden.Reparieren Sie die Lichtausrichtung des Laserstrahls und fügen Sie dem PBS-Puffer, in den die tBLMs eingetaucht sind, während der Laser ausgeschaltet ist, interessante Goldnanopartikel hinzu. Der koplanare Goldelektrodenschieber mit sechs Vertiefungen wurde schließlich durch die Zugabe einer dünnen transparenten Klebeschicht definiert. Das tBLM-Modell besteht aus einem Spacer und Molekülen, die an die Oberfläche des Goldsubstrats gebunden sind, um die erste Schicht zu bilden, und einem nicht gebundenen Lipid in der zweiten Schicht.Eine schematische Darstellung der verschiedenen Positionen der horizontalen Laserausrichtung und die normierten Leitwertaufzeichnungen über die Zeit, die den verschiedenen Ausrichtungspositionen entsprechen, sind hier dargestellt. Die Änderungen des Membranleitwerts an den Positionen eins und zwei sind auf die Wärme zurückzuführen, die durch Wechselwirkungen des Lasers mit Nanostrukturen innerhalb dieser gebutterten Goldschicht entsteht. Die Fokussierung des horizontalen Laserlichts direkt auf die Goldelektrode bewirkt eine Erhöhung der Membranleitfähigkeit.Die genaue Laserposition zeigte eine vernachlässigbare Variation der Membranleitfähigkeitsaufzeichnungen während der Perioden des Ein- und Ausschaltens des Lasers. Die Zugabe von Streptokokken-Teilung und konjugierten 30-Nanometer-Gold-Nanopartikeln zu tBLMs zeigte einen deutlichen Unterschied zwischen den Ein- und Aus-Perioden des Lasers sowie eine deutliche Zunahme des Verhaltens und der Samplitude während der Ein-Phase. Die sorgfältige und präzise Ausrichtung des Lasergangs auf den Puffer, der die Lipiddoppelschichtmembran umgibt, ist ein kritischer Schritt in diesem Protokoll.Das thermische Vorhersagemodell kann verwendet werden, um die mathematische Bestimmung der Menge an lokalisierter Wärme zu ermöglichen, die von jedem GNP erzeugt wird. Diese Technik bestimmt die Effizienz der Wärmeabgabe innerhalb biologischer Gewebe und unterstreicht die Rolle gezielter bestrahlter GNP-Hyperthermiebehandlungen in vivo.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Alkanthiolat stabilisiert Goldkolloide als Monoschicht geschützt Cluster (MPL) bekannt sind, synthetisiert, charakterisiert und montiert zu dünnen Filmen als Adsorptions-Schnittstelle für Protein-Monoschicht Elektrochemie von einfachen Redox-Protein...

Synthesis, Assembly und Charakterisierung von Monolayer Protected Gold-Nanopartikeln Films für die Protein-Monoschicht Elektrochemie

Solution-suspendierbare Gold-Nanoröhrchen mit kontrollierter Dimensionen können durch elektrochemische Abscheidung in porösen anodischen Aluminiumoxid (AAO) Membranen mit einem hydrophoben Polymer-Kern synthetisiert werden. Gold-Nanoröhren und Nanoröhrchen-Arrays versprechen für Anwendungen in plasmonischen Biosensorik, surface-enhanced Raman-Spektroskopie, photo-thermische Heizung, ionischen und molekularen Transport, Mikrofluidik, Katalyse und elektrochemische Sensorik.

Template Gezielte Synthese von Plasmonic Gold-Nanoröhren mit einstellbaren IR Absorption

Wir beschreiben die verwendet werden, um die Wechselwirkungen von 13,56 MHz Hochfrequenz-(RF)-Protokolle untersuchen elektrischen Felder, die mit Gold-Nanopartikel Kolloide in beiden nicht-biologischen und biologischen Systemen (in vitro / vivo). Diese Wechselwirkung ist für die Anwendung in der Krebstherapie untersucht.

Protokolle für die Beurteilung der Radiofrequenz-Wechselwirkungen mit Gold-Nanopartikel und biologische Systeme für die Nicht-invasive Krebstherapie Hyperthermie

Wir beschreiben die Synthese und Eigenschaften von multifunktionalen Fe2O3-Au Nanopartikeln, die durch einen nasschemischen Ansatz hergestellt werden, und untersuchen ihre photothermischen Eigenschaften mittels Laserbestrahlung. Die Komposit-Fe2-O-3-Au-Nanopartikel behalten die Eigenschaften beider Materialien bei, wodurch eine multifunktionale Struktur mit hervorragenden magnetischen und plasmonischen Eigenschaften entsteht.

Multifunktions-Hybrid Fe<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 3</sub&gt; -Au Nanopartikel für effiziente Plasmonische Heizung

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Herstellungsmethode für Gold-Nanopartikel integriert fotoempfindlichen Liposome mit den im Handel erhältlichen Materialien. Es zeigt auch, wie die Mikrobläschen Kavitationsprozess der synthetisierten Liposomen bei der Behandlung von gepulsten Laser zu messen.

Synthese von Gold-Nanopartikeln Integrated Photo-responsive Liposomen und Messung ihrer Mikroblasen Kavitation auf Pulse Laseranregung

Wir stellen ein Protokoll Glas mit nanometrischer Proteinflecken von einem Fluid Lipiddoppelschicht umgeben funktionalisieren. Diese Substrate sind kompatibel mit den fortschrittlichen optischen Mikroskopie und sollen als Plattform für die Zelladhäsion und Migration Studien dienen.

Ligand Nano-Cluster-Arrays in einem unterstützten Lipid Bilayer

Wir beschreiben eine Methode zur Synthese von biokompatibler 10 nm gold-Nanopartikeln, durch Beschichtung Poly-Ethylen Glykol auf die Oberfläche funktionalisiert. Diese Partikel können gebrauchte in Vitro und in Vivo für die Bereitstellung von Therapeutika zu nanoskaligen zellulären und extrazellulären Räumen, die schwer zugänglichen mit konventionellen Nanopartikel Größen sind.

Synthese von funktionalisierten 10 nm Polymer beschichteten Goldpartikeln für Targeting Endothel und Drug-Delivery

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um den molekularen Mechanismus der Protonen-Translokation über Lipidmembranen der einzelnen Liposomen, studieren mit Cytochrom Bo3  als Beispiel. Kombination von Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie, pH-Änderungen in das Lumen der einzelne Vesikel, mit einzelnen oder mehreren Enzym können individuell erkannt und analysiert werden.

Einzelne Liposomen Messungen für das Studium der Protonen-Pumpen Membran Enzyme mit Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie

Hier zeigen wir den Einsatz der traditionellen Dunkelfeldmikroskopie zur Überwachung der Dynamik von Gold-Nanostäben (AuNRs) auf der Zellmembran. Die Position und Ausrichtung einzelner AuNRs wird mit ImageJ und MATLAB erkannt, und die diffusiven Zustände von AuNRs sind durch eine einzelfaktnverfolgte Analyse gekennzeichnet.

Visualisierung der Diffusionsdynamik von Gold-Nanostäben auf der Zellmembran mit Single Nanoparticle Darkfield-Mikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt, wie die TIRF-Mikroskopie verwendet werden kann, um einzelne Ionenkanäle zu verfolgen und ihre Aktivität in geträgerten Lipidmembranen zu bestimmen, wodurch das Zusammenspiel zwischen lateraler Membranbewegung und Kanalfunktion definiert wird. Es beschreibt, wie die Membranen vorbereitet, die Daten aufgezeichnet und die Ergebnisse analysiert werden.

Einzelmolekül-Bildgebung der lateralen Mobilität und Ionenkanalaktivität in Lipiddoppelschichten mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF)

Die thermoplasmonische Punktionsmethode integriert konfokale Mikroskopie, optische Pinzetten und Goldnanopartikel, um Proteinantworten während der Reparatur von Plasmamembranen in Zellen und riesigen unilamellären Vesikeln zu untersuchen. Die Technik ermöglicht eine schnelle und lokalisierte Membranpunktion und ermöglicht die Identifizierung von Schlüsselproteinen und ihrer funktionellen Rolle in der komplizierten Plasmamembran-Reparaturmaschinerie.

Ein thermoplasmonischer Ansatz zur Untersuchung der Reparatur von Plasmamembranen in lebenden Zellen und Modellmembranen

Erfahren Sie die Überwachung der Wärmeübertragung von Goldnanopartikeln zu angebundenen Doppelschicht-Lipidmembranen mittels Impedanzspektroskopie. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen für photothermale Therapien.

Angebundene Doppelschicht-Lipidmembranen zur Überwachung der Wärmeübertragung zwischen Goldnanopartikeln und Lipidmembranen

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