Puppen- und Erwachseneninjektionen zur RNAi- und CRISPR-Genbearbeitung bei Nasonia vitripennis

Die Forschung an nicht-kanonischen Insektenmodellen, wie der parasitoiden Wespe, ist begrenzt, da die embryonale Mikroinjektion eine große Herausforderung darstellt. Unsere Methode umgeht dieses Problem und ermöglicht ortsspezifische und vererbbare Keimbahnmutationen. Die Injektion von Puppen oder erwachsenen Weibchen ist schnell und macht teure Geräte oder spezielle Schulungen überflüssig, die für erfolgreiche embryonale Mikroinjektionen erforderlich sind.

Diese Technik wird es keinem spezialisierten Labor, das keinen Zugang zu teuren Geräten hat, ermöglichen, funktionelle Studien an Insektenarten durchzuführen, die sie als Modell verwenden. Nach der Optimierung kann diese Methode verwendet werden, um die funktionelle Genetik vieler anderer Gene in Nasonia zu untersuchen. Wir glauben auch, dass diese Methode verwendet werden kann, um Nukleinsäuren für die genetische Transformation von Nasonia oder anderen Insekten zu liefern.

Beginnen Sie damit, etwa 20 verpaarte Weibchen einzeln in kleine Reagenzgläser zu setzen, die mit Watte verschlossen sind. Fügen Sie zwei S.bullata-Wirte pro Röhrchen hinzu und halten Sie die Wespen zwei bis drei Tage lang bei 25 Grad Celsius und 30 % relativer Luftfeuchtigkeit mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12:12. Nach zwei bis drei Tagen entfernen Sie die Weibchen vorsichtig mit einer feinen Bürste, um eine kontinuierliche Überposition und eine Synchronität in der Entwicklung der Nachkommen zu vermeiden.

Entfernte Weibchen können optional neu gehostet oder bis zu einem Monat bei fünf Grad Celsius gelagert werden. Halten Sie den parasitierten Wirt sieben Tage lang bei 25 Grad Celsius und 30 % relativer Luftfeuchtigkeit mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12:12, wenn das gewünschte Injektionsstadium weiße Puppen erfordert, 13 Tage lang, wenn das erforderliche Entwicklungsstadium schwarze Puppen ist, oder 14 Tage für junge, neu geschlüpfte Erwachsene. Wenn das gewünschte Stadium erreicht ist, knacken Sie das Wirtspuparium mit einer Präpariernadel auf, um N.vitripennis-Puppen und adulte Tiere zu gewinnen.

Bereite einen Objektträger vor, indem du eine Linie Schulkleber in der Mitte aufträgst. Verteilen Sie den Kleber mit der Präpariernadel, um eine dicke Schicht zu erhalten, die zum Ausrichten der Puppen verwendet wird. Lassen Sie den Kleber etwa zwei Minuten trocknen, bevor Sie die Puppen übertragen.

Tragen Sie unter einem Präpariermikroskop mit einer Präpariernadel Kleber auf den Hinterkopf der Puppe auf. Befestigen Sie die Puppe mit dem Bauch nach oben an der Klebeschicht auf dem Objektträger. Richten Sie 20 bis 30 Puppen nebeneinander auf der Folie aus.

Legen Sie den Objektträger mit den Puppen und einer Petrischale auf die Seite, um den Kleber etwa 10 Minuten lang einwirken zu lassen. Bevor Sie mit den Injektionen beginnen, testen Sie die Haftung der Puppen am Kleber, indem Sie sie vorsichtig mit der Präpariernadel andrücken. Wenn die meisten Puppen gelockert sind, bereiten Sie einen neuen Objektträger vor.

Alternativ können Sie alle losen Puppen entfernen und mit der Injektion derjenigen fortfahren, die ordnungsgemäß an der Objektträgerin befestigt sind. Legen Sie ein Kapillarglasröhrchen in einen Nadelabzieher und ziehen Sie die Nadeln gemäß den Anweisungen des Herstellers. Befüllen Sie die Nadel mit fünf Mikrolitern der vorbereiteten Injektionsmischung mit Hilfe von Microloader-Pipettenspitzen.

Öffnen Sie die Nadel und schieben Sie die Spitze auf eine Fläche, die aus zwei überlappenden Schiebern besteht. Alternativ kannst du die Spitze der Nadel mit einer feinen Pinzette öffnen, um eine scharfe Kante zu erzeugen. Legen Sie den Objektträger mit den ausgerichteten Puppen unter ein Präpariermikroskop, führen Sie dann die Nadel in das Injektionsrohr des Femtojets ein und ziehen Sie den Griffkopf fest.

Betrachten Sie die Nadel unter dem Mikroskop, schalten Sie den Femtojet ein und stellen Sie die Parameter für den Ausgleichsdruck und den Einspritzdruck durch Drehen der Drehknöpfe ein. Führen Sie die Nadel vorsichtig mit einem vertikalen Winkel von ca. 30 Grad zwischen dem zweiten und dritten sichtbaren Bauchsegment ein. Injizieren Sie mit einem kontinuierlichen Fluss, bis sich der gesamte Bauch bei Puppen im weißen Stadium grün färbt oder bis der Bauch bei schwarzen Puppen an Größe zunimmt.

Beenden Sie die Injektion, wenn klar ist, dass der Bauch keine Flüssigkeit mehr aufnehmen kann oder wenn die Flüssigkeit aus dem Körper zu fließen beginnt. Bewege dich vorsichtig zur nächsten Puppe und wiederhole diese Schritte. Übertragen Sie den Objektträger mit den injizierten Puppen in eine Petrischale.

Decken Sie die Schüssel mit dem Deckel ab und stellen Sie sie bei 25 Grad Celsius auf, bis die Wespe schlüpft. Für die Zubereitung bei Erwachsenen trennen Sie Gruppen von 20 jungfräulichen Weibchen in einem sauberen kleinen Reagenzglas mit einem feinen Pinsel. Lege einen Objektträger auf Eis und richte das Weibchen nebeneinander auf dem kalten Objektträger aus, wobei der Bauch nach oben unter einem Präparierfernrohr liegt.

Laden Sie eine Nadel mit der Ribonukleoproteinlösung unter Verwendung einer Mikroladespitze und führen Sie die Nadel in das Verbindungspaket der Aspiratorröhrchenbaugruppe ein. Stützen Sie die Weibchen von der gegenüberliegenden Seite mit abgestumpften Präpariernadeln, während Sie langsam in den Bauch injizieren. Vermeiden Sie es, den Ovipositor zu berühren.

Dadurch wird diese kritische Fortpflanzungsstruktur schwer beschädigt. Führen Sie die Nadel vorsichtig mit einem vertikalen Winkel von ca. 30 Grad zwischen dem zweiten und dritten sichtbaren Bauchsegment ein. Injizieren Sie die Lösung in den weiblichen Bauch und stoppen Sie, wenn keine Flüssigkeit mehr eindringen kann oder wenn ein Austreten der überschüssigen Lösung beobachtet wird.

Gehen Sie vorsichtig zum nächsten Weibchen und wiederholen Sie diese Schritte. Wenn Sie fertig sind, übertragen Sie ein einzelnes injiziertes Weibchen vorsichtig mit einem Pinsel in ein neues Röhrchen mit einem Wirt. Lassen Sie sie etwa eine Stunde lang bei Raumtemperatur erholen, bestätigen Sie das Überleben und stellen Sie die Röhren wieder in den Aufzuchtbrutkasten.

Nach der Auslösung der adulten Wespen aus den injizierten Puppen werden einzelne Wespen in ein Glas gelegt, das mit Watte verstopft wird, und ein S.bullata-Wirt eingesetzt. Lassen Sie für CRISPR/Cas9-Knockout-Experimente die Weibchen den Wirt einen Tag lang parasitieren und ersetzen Sie den Wirt jeden Tag an drei aufeinanderfolgenden Tagen. Platzieren Sie den parasitierten Wirt bei 25 Grad Celsius bis zum Schlüpfen der männlichen G0-Nachkommen, etwa 13 bis 14 Tage.

Untersuchen Sie G0-Männchen unter einem Präpariermikroskop auf die mutierten Phänotypen. Das Zinnober-Gen ist für die Augenpigmentierung verantwortlich. Wespen mit braunen Augen sind Wildtyps und Wespen mit leuchtend roten Augen oder Variationen zwischen roten und braunen Augen sind Mutanten.

Dieses Protokoll kann entweder für die Mikroinjektion von Puppen oder Erwachsenen verwendet werden. Die Überlebensraten dieses Verfahrens reichen von 15 bis 100 %Die Effizienz, den gewünschten Phänotyp über RNAi oder CRISPR zu erreichen, ohne dass aufwändige Ei-Injektionen erforderlich sind, wird hier gezeigt. Bei der Injektion von Puppen oder erwachsenen Weibchen sollte die Nadel scharf sein und so eingeführt werden, dass die Flüssigkeit nicht unmittelbar nach der Injektion austritt.

Entfernen Sie in diesem Fall die Nadel, stellen Sie sicher, dass die Spitze fein und scharf ist, wechseln Sie sie bei Bedarf oder injizieren Sie an einer anderen Stelle. Eine Funktionsanalyse kann an dem Gen durchgeführt werden, auf das dieses Verfahren abzielt. Dies beantwortet die Frage nach der Genfunktion und ob das Gen für den untersuchten Phänotyp notwendig ist.