Name: In vivo Calcium Imaging in Maus Inferior Olive (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Lernen Sie ein chirurgisches Protokoll zur Calcium-Imaging in vivo im Nucleus olivaris inferior von erwachsenen Mäusen mit GRIN-Linsen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Dynamik und räumlich-zeitlicher Aktivitätsmuster.

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Wir danken Andrew Scott vom Medienzentrum von OIST für seine Hilfe bei der Videoaufzeichnung und -bearbeitung. Wir danken Hugo Hoedemaker für seine Hilfe bei der Entwicklung der Operation zur Enthüllung des Hirnstamms und Dr. Kevin Dorgans für seine Hilfe beim Zeichnen von Diagrammen für Figuren. Darüber hinaus vielen Dank an Salvatore Lacava für seine Voice-over-Erzählung, sowie alle nRIM Mitglieder und Haustiere für die kontinuierliche Unterstützung für das Wohlbefinden in den schwierigen Zeiten von COVID-19.

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Da der chirurgische Eingriff Operationen im Halsbereich mit zahlreichen vital kritischen Strukturen (Arterien, Nerven) umfasst, ist es wichtig, dass es von einem Forscher mit hohen chirurgischen Fähigkeiten durchgeführt wird. Im Folgenden weisen wir auf einige Kernpunkte des Verfahrens hin und kommentieren sie; es muss jedoch daran erinnert werden, dass keine Menge schriftlicher Ratschläge die Erfahrung, Geschicklichkeit und Intuition des Forschers verdrängen kann.
Der kritischste Schritt in der Operation ist die Tracheotomie. Es geht darum, die Luftröhre zu schneiden, Isoflurane vom Nasenkegel zum Intubationsrohr zu wechseln, die Luftröhre an der Brusthaut zu sichern und die Luftröhre und das Intubationsrohr miteinander zu verbinden. Alle diese Operationen müssen reibungslos und schnell durchgeführt werden, um Unfälle wie unzureichende Anästhesie, Flüssigkeitszufluss in Luftröhre oder Ausrutscher von Intubationsrohren zu vermeiden. Man muss das Protokoll klar im Auge behalten, bevor man die Luftröhre schneidet.
Blutungen sind eine der Hauptursachen für den Tod von Tieren in dieser Operation. Da der Halsbereich mit Blutgefäßen dicht ist, sollte der Schnitt nur ausgeführt werden, wenn die Sichtlinie klar ist, um ungesehene Venen und Arterien zu vermeiden. Daher müssen Muskeln und Bindegewebe, die das Sehvermögen verschleiern, entfernt werden, und Blut aus gebrochenen Kapillaren muss vor dem Fortschreiten gereinigt werden.
Tier kann lange (mehr als 8 Stunden) ab Beginn der Operation am Leben gehalten werden. Jedoch, Es ist wichtig, den chirurgischen Eingriff schnell zu beenden, so gibt es mehr Zeit, um Hirnstamm Neuronen zu untersuchen, wenn tierischephysiologischeN Zustand ist gut. Ein erfahrener Forscher kann das ganze Verfahren in 70 min beenden.
Während die Methode eine saubere Ansicht der ventralen Gehirnoberflächen bietet, ist es leider unmöglich, dies ohne eine Tracheotomie zu tun sowie erhebliche Menge an Gewebe im Halsbereich zu entfernen. Daher darf das Tier nicht aus der Anästhesie aufwachen. Auch wenn es möglich ist, das Tier viele Stunden mit sorgfältiger Einstellung der Anästhesiezufuhr, Aufrechterhaltung der Körpertemperatur und Hydratation am Leben zu erhalten, ist es unvermeidlich, dass längere Experimente schließlich zu einer Schwächung des tierischen Zustandes führen. Es bleibt der Expertise des Forschers überlassen, die maximale Dauer stabiler Aufnahmen zu berücksichtigen.
Eine weitere mögliche Einschränkung der hier beschriebenen Methode besteht darin, dass, da die GRIN-Linse nicht in das Parenchym des Gehirns eingeführt wird, nur relativ oberflächliche Neuronen (ca. 150-200 m) untersucht werden können. Während eine chirurgische Implantation der GRIN-Linse technisch möglich ist, lässt die akut operierende Methode den Neuronen nicht genügend Zeit, sich von oxidativem Stress zu erholen, und das Vorhandensein von Blut nach der Implantation wird wahrscheinlich die Bildqualität über das akzeptable hinaus verschlechtern.
Trotz der oben genannten Bedenken glauben wir, dass dies das erste Mal ist, dass eine Methode zur In-vivo-Bildgebung von IO-Neuronen vorgestellt wird. Es ermöglicht die Untersuchung der raumzeitlichen Aktivität in den IO-Neuronen im Kontext in vivo in Gegenwart intakter affemitischer Eingänge aus sensorischen Systemen sowie der Signale der Kleinhirnkerne und der mesodiencephalischen Kreuzung22, eine Leistung, die bisher nicht möglich war. Mit dieser Methode kann die Funktion der IO nun mit einer Kombination von sensorischer und optogenetischer Stimulation vertieft untersucht werden. Insbesondere mit der Entwicklung der Spannungsbildgebung (wie unsere jüngste Methode zur Spannungsbildgebung im IO 23) hoffen wir, dass die vorgestellte chirurgische Methode zahlreiche Forscher dazu inspirieren wird, die Herausforderung anzunehmen, zu untersuchen, wie die IO zur Erzeugung von Kleinhirnkomplexen beiträgt.

Das Hauptziel der Systemneurowissenschaften ist es zu verstehen, wie raumzeitliche Aktivitätsmuster neuronaler Netzwerke zur Erzeugung von Tierverhalten beitragen. So hat sich die fluoreszierende Bildgebungsmethodik unter Verwendung von kalziumempfindlichen Sonden in den letzten zehn Jahren zu einem Hauptwerkzeug für die Untersuchung der neuronalen Netzwerkaktivität bei lebenden Tieren1,2, entwickelt, da sie die Visualisierung solcher Dynamiken über räumliche Skalen von einzelnen Zellen bis hin zu mesoskalien Schaltkreisen ermöglicht. In den letzten Jahren wurde der gemeinsame Ansatz, bei dem neuronale Schaltkreise in oberflächlichen Gehirnstrukturen (wie zerebrale oder kleinhirnige Kortizes) durch ein transparentes Schädelfenster3 abgebildet werden, durch die Verwendung von Gradienten-Refraktiven Index(GRIN)-Objektiven4 ergänzt, die eine Untersuchung der Netzwerkdynamik in tiefen Gehirnstrukturen ermöglichen. Derzeit verfügbare GRIN-Objektive ermöglichen das Greifen in Strukturen von mehreren Millimetern Tiefe, wie die Maus-Amygdala, Hippocampus und Basalganglien5. Viele Interessensgebiete wie verschiedene Kerne im ventralen Medulla liegen jedoch deutlich tiefer und platzieren sie am Äußersten der GRIN-Linse.
Hier beschreiben wir, wie man diese Schwierigkeit überwinden kann, indem wir die relativ einfache Zugänglichkeit von Medulla durch den ventralen Aspekt des Gehirns nutzen. Mit erwachsenen Mäusen, bei denen die minderwertige Olive (IO), ein Kern in der ventralen Medulla, viral mit einem Kalziumsensor GCaMP6s transfiziert wurde, beschreiben wir die chirurgischen Schritte (modifiziert von der Methode, die ursprünglich in Khosrovani et al. 20076beschrieben wurde), um eine GRIN-Linse auf der ventralen Oberfläche des Gehirns einer anästhetisierten Maus zu platzieren. Mit einem Miniaturmikroskop zeigen wir die Machbarkeit der Aufzeichnung neuronaler Aktivität in solchen extrem ventralen Hirnregionen. Während das Verfahren notwendigerweise eine Nicht-Überlebensoperation ist und keine Experimente an wachen Tieren durchgeführt werden können, ermöglicht das Verfahren die Untersuchung einer intakten Netzwerkdynamik im Kontext einer sensorischen oder anderen affeken Signalwegstimulation, was klare Vorteile gegenüber Ex-vivo-Ansätzen wie der Verwendung akuter Scheibenpräparate bietet.

<table><tbody><tr><td>AAV. CAG. GCaMP6s.WPRE.SV40</td><td>Addgene, USA</td><td>100844-AAV9</td><td></td></tr><tr><td>Resorbierbares Nahtmaterial mit 6 mm Halbkreisnadel</td><td>Natume, Japan</td><td>L6-60N2</td><td>Hakennadel mit</td></tr><tr><td>Faden Absorptionsdreiecke</td><td>FST, Deutschland</td><td>18105-03</td><td>Chirurgische Schwämme</td></tr><tr><td>Stereomikroskope</td><td>Leica, Deutschland</td><td>M50</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Nadelhalter mit gebogener Spitze und Schloss</td><td>FST, Deutschland</td><td>12061-01</td><td>Chirurgisches Werkzeug</td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>Sanyo, Japan</td><td>HUBY-340</td><td></td></tr><tr><td>Zarte Nahtbindezange</td><td>FST, Deutschland</td><td>11063-07</td><td>Chirurgisches Werkzeug</td></tr><tr><td>Zarte Nahtbindezange</td><td>FST, Deutschland</td><td>11063-07</td><td>Chirurgisches Werkzeug</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Pinzette</td><td>FST, Deutschland</td><td>11251-35</td><td>Chirurgisches Werkzeug</td></tr><tr><td>Feine Irisschere</td><td>FST, Deutschland</td><td>14060-09</td><td>Chirurgisches Werkzeug</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson rongeur gebogene Spitze</td><td>FST, Deutschland</td><td>16221-14</td><td>Chirurgisches Werkzeug</td></tr><tr><td>Gelfoam resorbierbarer Gelatineschwamm</td><td>Pfizer, USA</td><td>0315-08</td><td>Hämostatischer Gelatineschwamm</td></tr><tr><td>Glaskapillare Nanoinjektion</td><td>Neurostar, Deutschland</td><td>n/a</td><td>Für die Virusvektorinjektion</td></tr><tr><td>Graefe Pinzette mit gezackter Spitze</td><td>FST, Deutschland</td><td>11052-10</td><td>Chirurgisches Werkzeug</td></tr><tr><td>Implantationsstab</td><td>Inscopix, USA</td><td>n/a</td><td>Es ist Teil des nVoke2-Systems. Es ist so konzipiert, dass nVoke2 Miniatur-Mikroscpe und GRIN-Linse darauf montiert werden</td></tr><tr><td>können IsoFlo</td><td>Zoetis, UK</td><td>n/a</td><td>Isofluran</td></tr><tr><td>KETALAR FÜR INTRAMUSKULÄRE INJEKTION</td><td>Daiichi Sankyo, Japan</td><td>n/a</td><td>Ketamin</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark, USA</td><td></td><td>Reinigung von Gewebe</td></tr><tr><td>Laserbasierter Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument, USA</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipette Beveler</td><td>Sutter Instrument, USA</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Motorisierte Stereotaxe basierend auf Kopf, Modell 900</td><td>Neurostar, Deutschland</td><td>n/a</td><td>Stereotaktische</td></tr><tr><td>RahmenmausOxPlus mit rektalem Temperatursensor und Oberschenkelklemme Pulsoximeter</td><td>Starr Life Sciences, PA, USA</td><td>MouseOxPlus</td><td>Misst die Herzfrequenz von Tieren, die arterielle Sauerstoffsättigung (SpO2), die Atemfrequenz und die Temperatur</td></tr><tr><td>nVoke2 integriertes Mikrokamerasystem für die Kalziumbildgebung</td><td>Inscopix, USA</td><td>1000-003026</td><td>Miniaturmikroskop</td></tr><tr><td>Ohaus Compact Scales</td><td>Ohaus, USA</td><td>CS 200</td><td>Waage zum Wiegen von Tieren</td></tr><tr><td>Otsuka Normal Saline</td><td>Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Physiologisch-biologisches Temperaturreglersystem</td><td>SuperTech Instruments, Ungarn</td><td>TMP-5b</td><td>Wärmeleitpad für Maus</td></tr><tr><td>ProView Lens Probe 1,0 mm Durchmesser, 9,0 mm Länge</td><td>Inscopix, USA</td><td>1050-002214</td><td>Grin-Linse (Gradientenbrechungsindex)</td></tr><tr><td>Q114-53-10NP Glaskapillaren</td><td>Sutter Instrument, USA</td><td>112017</td><td>Kundenspezifische Quarzglaskapillaren</td></tr><tr><td>Sicherheits-IV-Katheter 20G</td><td>B. Braun, Deutschland</td><td>4251652-03</td><td>20-Gauge-Katheter zur Vorbereitung des Intubationsschlauchs</td></tr><tr><td>Schleifpapier</td><td>ESCO, Japan</td><td>EA366MC</td><td>Wird verwendet, um die Spitze einer 25G-Nadel zu polieren, um eine gebogene und stumpfe Nadel vorzubereiten</td></tr><tr><td>Skalpellklinge</td><td>Muromachi Kikai, Japan</td><td>10010-00</td><td>Wird verwendet, um die Spitze einer Quarzglaspipette zu schneiden</td></tr><tr><td>SomnoSuite Anästhesiesystem für Inhalationen mit niedrigem Durchfluss</td><td>Kent Scientific, USA</td><td>SOMNO</td><td>Bietet eine präzise Kontrolle des Isofluranflusses</td></tr><tr><td>Surgic XT Plus Bohrer</td><td>NSK</td><td>Y1002774</td><td>Für die Injektion von Virusvektoren</td></tr><tr><td>Spritze 1 ml</td><td>Terumo, Japan</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Spritzennadel 25G</td><td>Top, Japan</td><td>00819</td><td>Wird verwendet, um stumpfe und gebogene Nadel</td></tr> herzustellen <tr><td>Spritzennadel 26G</td><td>Terumo, Japan</td><td>NN-2613S</td><td></td></tr><tr><td>Thrive 2100 Professioneller Trimmer</td><td>Thrive, Japan</td><td>n/a</td><td>Rasierer</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; bingen Federschere</td><td>FST, Deutschland</td><td>15004-08</td><td>Chirurgiewerkzeug</td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Hayashi Pure Chemical, Japan</td><td>22000255</td><td></td></tr><tr><td>Veet empfindliche Haut</td><td>Veet, Kanada</td><td>n/a</td><td>Haarentfernungscreme</td></tr><tr><td>Xylocain Jelly 2 % 30ml</td><td>Aspen Japan,&nbsp; Japan</td><td>871214</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo calcium imaging in maus inferior olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Untere Olive (IO), ein Kern im ventralen Medulla, ist die einzige Quelle von Kletterfasern, die einen der beiden Eingangswege bilden, die in das Kleinhirn eindringen. IO wurde seit langem vorgeschlagen, entscheidend für die Motorsteuerung zu sein und seine Aktivität wird derzeit als das Zentrum vieler Hypothesen der motorischen und kognitiven Funktionen des Kleinhirns betrachtet. Während seine Physiologie und Funktion relativ gut auf einzelliger Ebene in vitrountersucht wurden, gibt es derzeit keine Berichte über die Organisation der Aktivitäten des IO-Netzwerks bei lebenden Tieren. Dies ist vor allem auf die extrem herausfordernde anatomische Lage der IO zurückzuführen, was es schwierig macht, konventionellefluoreszierende Bildgebungsverfahren zu unterziehen, bei denen ein optischer Pfad durch das gesamte Gehirn geschaffen werden muss, das sich dorsal in der Region des Interesses befindet.
Hier beschreiben wir eine alternative Methode zur Gewinnung modernster Kalzium-Bildgebungsdaten aus dem IO-Netzwerk. Das Verfahren nutzt die extreme ventrale Lage der IO und beinhaltet ein chirurgisches Verfahren zum Einsetzen einer Gradienten-Refraktiven Index-Linse (GRIN) durch die Halsviszera, um mit der ventralen Oberfläche des Calciumsensors GCaMP6s-exzierende IO bei anästhesierten Mäusen in Kontakt zu kommen. Eine repräsentative Kalzium-Bildaufnahme zeigt die Machbarkeit, die IO-Neuronenaktivität nach der Operation aufzuzeichnen. Während dies eine nicht-überlebende Operation ist und die Aufnahmen unter Narkose durchgeführt werden müssen, vermeidet es Schäden an lebenskritischen Hirnkernen und ermöglicht die Durchführung einer Vielzahl von Experimenten, die räumzeitliche Aktivitätsmuster und Inputintegration in der IO untersuchen. Dieses Verfahren mit Modifikationen könnte für Aufnahmen in anderen, angrenzenden Regionen des ventralen Hirnstamms verwendet werden.

Hier stellen wir eine repräsentative Aufzeichnung mit der Methode wie beschrieben erhalten. Abbildung 6a zeigt die Position hell beschrifteter IO-Zellen, die während des Experiments visualisiert wurden. Die dunklen diagonalen Streifen sind Blutgefäße. Beachten Sie die variable Helligkeit einzelner Zellen, die sich aus der variablen Transfektionswirksamkeit ergibt. In Panel Abbildung 6b zeigen wir die mittelnormalisierte Fluoreszenzintensität (DeltaF/F) Spuren, die aus der somata erhalten werden, die mit Farben und Zahlen in Panel a angegeben ist. Aufwärtsverformungen stellen einen vorübergehenden Anstieg des intrazellulären Kalziums dar. Beachten Sie, wie unterschiedliche GCaMP6s-Expressionen (in der Zellhelligkeit im Panel a) zu variablen Signal-Rausch-Verhältnissen (SNR) führen.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62222/62222fig06.jpg"> Abbildung 6: Beispielaufzeichnung der Aktivität von IO-Neuronen in anästhesierter Maus. (a) Repräsentativer Beispielrahmen aus einer Aufzeichnung nach räumlicher Filterung. Helle Flecken sind IO neuronale Somata, von denen einige als Interessengebiete (ROIs, farbige Zahlen) angegeben wurden. Dunkle Streifen sind Blutgefäße. (b) Beispiel deltaF/F-Spuren, die aus den in Panel a angegebenen ROIs gewonnen wurden. Nach oben verlenkt entolieren Erhöhungen des Kalziumsignals. Skalieren Sie die Leiste in a=10 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62222/62222fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Wir präsentieren ein Protokoll, um das Hirnstamm der erwachsenen Maus von der ventralen Seite zu entlarven. Durch die Verwendung einer Gradienten-Refraktiven Indexlinse mit einem Miniaturmikroskop kann die Kalzium-Bildgebung verwendet werden, um die Aktivität von minderwertigen oliv-neuralen Somata nin vivo zu untersuchen.

In vivo Calcium Imaging in Maus Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Minderwertige Oliven sind der ventralste Teil der Medulla und daher bei einem lebenden Tier extrem schwer zu erreichen. Hier führen wir ein Protokoll ein, um den erwachsenen Maushirnstamm von der ventralen Seite zu belichten, und verwenden GRIN-Linsen, um neuronale Aktivität in den minderwertigen Olivenneuronen aufzuzeichnen, die Kalziumsensoren exdrücken. Diese Methode vermeidet Schäden am lebenskritischen Hirnstamm und ermöglicht Untersuchungen zu räumlich-zeitlichen Aktivitätsmustern und Inputintegration in der minderwertigen Olive.Da die Operation in der komplexen Halsregion mit vielen lebenswichtigen Strukturen durchgeführt wird, ist es wichtig, dass sie von einem Forscher mit hohen chirurgischen Fähigkeiten durchgeführt wird. Bereiten Sie ein Intubationsrohr vor, indem Sie einen 5 bis 6 Millimeter langen und 0,8 Millimeter breiten Schlitz von der Spitze eines 20-Spur-Katheters schneiden. Bereiten Sie eine stumpfe und gekrümmte Nadel vor, indem Sie die Spitze abschneiden, die Bruchfläche schleifen und mit der Zange biegen.Dies wird verwendet, um eine Luftröhre während der Tracheotomie zu unterstützen. Verdünnen Sie 15 Milligramm pro Milliliter Ketamin mit Saline zu 15%Assemble operations tools and consumables. Stellen Sie das Heizkissen auf 38 Grad Celsius ein.Drehen Sie den Nosecone 180 Grad horizontal in stereotaxic Rahmen. Wiegen Sie die Maus, deren minderwertige Olive zuvor von virustragenden GCaMP6s transfiziert wurde, und berechnen Sie die Menge an verdünntem Ketamin zur Injektion. Induktionsbox vorfüllen mit 5%isoflurane, und die Maus anästhesieren.Montieren Sie die Maus in den stereotaxic Rahmen, ventrale Seite nach oben. Rasieren Maus Kehle und Oberschenkelbereich. Entfernen Sie das Resthaar mit Haarentfernungscreme.Topisch Xylocain Gelee auf die Halshaut auftragen. Überwachen Sie die Maustemperatur mit einem rektalen Thermischen Sensor. Injizieren Sie einen Milliliter vorgewärmten saline intraperitoneally.Bewerten Sie die Tiefe der Anästhesie durch starke Prise an den Hinterbauchzehen. Es sollte keine erkennbare Antwort ausgelöst werden. Machen Sie einen vertikalen Schnitt in der Halshaut entlang der Mittellinie.Trennen Sie die Nackenhaut von der eingeweideten Haut mit einer stumpfen Seziermethode und schneiden Sie die Haut ab. Freie Speicheldrüsen aus Bindegewebe, und kippen sie seitlich, um die Sternothyroid muskelbedeckte Luftröhre auszusetzen. Intraperitoneally injizieren die erste Dosis von verdünntem Ketamin bei fünf Milliliter pro Kilogramm Tiergewicht.Sorgfältig gespalten Sternothyroid Muskel entlang der Mittellinie mit der Spitze einer feinen Zange, um Luftröhre auszusetzen. Luftröhre von Blutgefäßen und Speiseröhre mit Zangen mit stumpfer Seziermethode lösen. Injizieren Sie eine zweite Dosis verdünntes Ketamin mit 2,5 Milliliter pro Kilogramm Tiergewicht.Kreuzweise eine stumpfe Nadel unter Luftröhre einsetzen. Heben Sie die Luftröhre mit der stumpfen Nadel an. Lassen Sie den Nahtfaden um den dritten Luftröhrenring gehen, kauden die Schilddrüse, mit einer Halbkreisnadel.Machen Sie vier Instrumentenkrawatten auf diesem Ring. Pierce die Brusthaut mit der gleichen Halbkreisnadel und führen Sie den Faden durch die Haut. Heben Sie die Luftröhre vorsichtig mit dem Faden an und schneiden Sie die Luftröhre kaudal auf die Schilddrüse.Ziehen Sie die Luftröhre in Richtung Brusthaut. Heben Sie die Öffnung der Luftröhre an, indem Sie ein kleines Stück chirurgischen Schwamm unter sich hinzufügen. Entfernen Sie die verbleibende Flüssigkeit in der Öffnungsspitze der Luftröhre mit einem dünnen Streifen Reinigungsgewebe.Schalten Sie den Isofluran-Fluss von stereotaxic nosecone auf das Intubationsrohr. Setzen Sie das Intubationsrohr in die Luftröhre ein. Stellen Sie sicher, dass ein Teil des Schlitzes in der Röhre außerhalb der Luftröhre bleibt, um die Atmung zu ermöglichen.Befestigen Sie die Luftröhre an der Brusthaut der Maus, indem Sie drei bis vier Instrumentenkrawatten herstellen. Binden Sie die Luftröhre mit dem Nahtgewinde, um das Intubationsrohr zu sichern. Schlitzen Sie den Sternothyroidmuskel entlang der Muskelfasern mit den feinen Zangen.Schneiden Sie den isolierten Teil mit der Federschere ab. Sorgfältig freie Restluftundrache und Kehlkopf aus dem Muskel, um die Schäden an den Blutgefäßen im Muskel zu minimieren. Reste Luftröhre und Kehlkopf entfernen.Freie Speiseröhre aus anhänglichen Geweben mit Zange und mit federheiner Schere abschneiden. Entfernen Sie den Längsmuskel, der den Hirnstamm und den ventralen Bogen des Atlas bedeckt. Entfernen Sie den Muskel, der den Atlas ventralen Bogen und die vordere Knolle bedeckt.Schneiden Sie die ventralen Bögen des Atlas mit dem Rongeur. Entfernen Sie die vordere Knolle des Atlas. Entfernen Sie das Blut und die Flüssigkeit, um das Foramen magnum und den Hirnstamm zu sehen.Erweitern Sie das Foramen magnum, indem Sie den okzipitalen Knochen mit dem Rongeur entfernen. Entfernen Sie den Knorpel, und schälen Sie vorsichtig die periosteale Schicht der Dura mater mit den feinen Zangen, um eine klare Sicht auf den ventralen Hirnstamm zu haben. Klemmen Sie den SpO2-Sensor am Oberschenkel der Maus, um Vitalzeichen wie Herzfrequenz, Sauerstoffsättigung und Atemfrequenz zu überwachen.Montieren Sie die GRIN-Linse am Implantationsstab. Reinigen Sie die Linse sorgfältig mit 70% ethanolgetränktem Reinigungsgewebe. Fixieren Sie den Implantationsstab auf stereotaxic Rahmen und montieren Sie das Miniaturmikroskop auf dem Implantationsstab.Fügen Sie mehrere Tropfen Saline im Hirnstammbereich zum Eintauchen der GRIN-Linse hinzu. Nähern Sie sich dem Hirnstamm mit der GRIN-Linse. GCaMP6s, die minderwertige Olivenneuronen im oberflächlichen Bereich exdrücken, finden sich in einem rechteckförmigen Bereich, etwa 0,5 bis 1,7 Millimeter rostral zum verbleibenden Atlas und etwa 2,6 bis 1,1 Millimeter seitlich zur Mittellinie.Schalten Sie die anregende blaue LED im Miniaturmikroskop ein, um GCaMP6s transfizierte minderwertige Olivenneuronen zu lokalisieren. Die Neuronen zeigen aufgrund verschiedener GCaMP6s-Expressionsniveaus unterschiedliche Ausgangsfluoreszenzintensität. Die Veränderung des Kalziumspiegels der eingekreisten unteren Olivenneuronsomata im Video auf der linken Seite zeigt uns Delta F geteilt durch F Spuren auf der rechten Seite.Obwohl die Maus warm und hydratisiert gehalten wird, wird sie unweigerlich durch längere Anästhesie und Operation geschwächt. Es ist wichtig, die Dauer der Operation kurz zu halten, so dass die körperliche Verfassung der Maus gut für die Aufnahme sein wird. Ein erfahrener Forscher kann die Operation in 70 Minuten beenden.Diese Methode, mit Modifikationen, kann verwendet werden, um andere benachbarte Regionen des ventralen Hirnstamms zu studieren.

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Forschung

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