Name: Bewertung funktioneller Metriken der Skelettmuskelgesundheit in Mikrobeschwerden der menschlichen Skelettmuskulatur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung und Analyse von 3D-humanen Skelettmuskel-Mikrogeweben mit der MyoTACTIC-Plattform. Diese Methode ermöglicht wiederholte Messungen von Kontraktionskraft und Calciumtransienten für Muskelbiologie und Krankheitsmodellierung.

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Wir danken Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli und Sadegh Davoudi für ihren Beitrag zur Erfindung der MyoTACTIC-Kulturplattform und zur Etablierung der hier beschriebenen Herstellungs- und Analysemethoden. HL erhielt Mittel aus einem Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Training Program in Organ-on-a-Chip Engineering and Entrepreneurship Scholarship und einem University of Toronto Wildcat Graduate Scholarship. PMG ist der Canada Research Chair in Endogenous Repair und erhielt für diese Studie Unterstützung vom Ontario Institute for Regenerative Medicine, dem Stem Cell Network und von Medicine by Design, einem Canada First Research Excellence Program. Schematische Diagramme wurden mit BioRender.com erstellt.

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<li>DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+price+of+innovation%3A+New+estimates+of+drug+development+costs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Health+Economics%22%5BJournal%5D)">The price of innovation: New estimates of drug development costs.</a> Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).</li>
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<li>Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+contractile+myofiber+sheets+as+a+platform+for+studies+of+skeletal+muscle+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li>
<li>Afshar Bakooshli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+culture+model+of+innervated+human+skeletal+muscle+enables+studies+of+the+adult+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction.</a> eLife. 8, 1-29 (2019).</li>
<li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).</li>
<li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLoS One. 15 (5), 0232081(2020).</li>
<li>Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D-printed+platform+for+modular+neuromuscular+motor+units%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystems+%26+Nanoengineering%22%5BJournal%5D)">A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units.</a> Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).</li>
<li>Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+contractile+muscle+tissue+consisting+of+human+skeletal+myocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).</li>
<li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20(2019).</li>
<li>Gholobova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tissue-engineered+skeletal+muscle%3A+a+novel+3D+in+vitro+model+for+drug+disposition+and+toxicity+after+intramuscular+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), 5847(2018).</li>
<li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li>
<li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+muscle+fibers+and+satellite-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).</li>
<li>Khodabukus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+increases+hypertrophy+and+metabolic+flux+in+tissue-engineered+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle.</a> Biomaterials. 198, 259-269 (2019).</li>
<li>Nagashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+tissues+with+contractility+fabricated+by+immortalized+human+myogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biosystems%22%5BJournal%5D)">In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells.</a> Advanced Biosystems. , 2000121(2020).</li>
<li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+human+skeletal+micro+muscle+platform+with+pacing+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities.</a> Biomaterials. 198, 217-227 (2019).</li>
<li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+tissue+gauges+to+measure+and+manipulate+forces+from+3D+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).</li>
<li>Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+delivered+in+their+niche+efficiently+generate+functional+myotubes+in+three-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture.</a> PLOS One. 13 (9), 0202574(2018).</li>
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<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+to+monitor+statin-induced+myopathy+in+individual+engineered+skeletal+muscle+myobundles%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles.</a> Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).</li>
<li>Rajabian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+skeletal+muscle+as+a+model+of+muscle+aging+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration.</a> Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).</li>
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<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 34(2011).</li>
<li>Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li>
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<li>Bakooshli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+model+of+human+skeletal+muscle+innervated+with+stem+cell-derived+motor+neurons+enables+epsilon-subunit+targeted+myasthenic+syndrome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies.</a> BioRxiv. , 275545(2018).</li>
<li>Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+highly+contractile+tissue-cultured+avian+skeletal+myotubes+in+collagen+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel.</a> Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li>
<li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Dieses Manuskript beschreibt Methoden zur Herstellung und Analyse eines 3D-hMMT-Kulturmodells, das auf Studien der grundlegenden Muskelbiologie, Krankheitsmodellierung oder für die Prüfung von Kandidatenmolekülen angewendet werden kann. Die MyoTACTIC-Plattform ist kostengünstig, einfach herzustellen und benötigt eine relativ kleine Anzahl von Zellen, um Skelettmuskel-Mikrogewebe herzustellen. hMMTs, die innerhalb der MyoTACTIC-Kulturplattform gebildet werden, bestehen aus ausgerichteten, mehrkernigen und quergestreiften ...

Die Skelettmuskulatur ist eines der am häufigsten vorkommenden Gewebe im menschlichen Körper und unterstützt wichtige Körperfunktionen wie Fortbewegung, Wärmehomöostase und Stoffwechsel1. In der Vergangenheit wurden Tiermodelle und zweidimensionale (2D) Zellkultursysteme verwendet, um biologische Prozesse und Krankheitspathogenese sowie pharmakologische Verbindungen bei der Behandlung von Skelettmuskelerkrankungen zu untersuchen2,3. Während Tiermodelle unser Wissen über die Skelettmuskulatur in Gesundheit und Krankheit stark verbessert haben, wurde ihre translationale Wirkung durch hohe Kosten, ethische Überlegungen und Unterschiede zwischen den Artenbehindert 2,4. Bei der Hinwendung zu menschlichen zellbasierten Systemen zur Untersuchung der Skelettmuskulatur sind 2D-Zellkultursysteme aufgrund ihrer Einfachheit günstig. Es gibt jedoch eine Einschränkung. Dieses Format versäumt es oft, die Zell-Zell- und Zell-extrazellulären Matrix-Interaktionen zu rekapitulieren, die natürlich im Körper auftreten5,6. In den letzten Jahren haben sich dreidimensionale (3D) Skelettmuskelmodelle als leistungsfähige Alternative zu Ganzentiermodellen und herkömmlichen 2D-Kultursystemen herauskristallisiert, indem sie die Modellierung physiologisch und pathologisch relevanter Prozesse ex vivoermöglichen 7,8. Tatsächlich haben eine Vielzahl von Studien über Strategien zur Modellierung der menschlichen Skelettmuskulatur in einem bioartifiziellen 3D-Kulturformatberichtet 1. Eine Einschränkung für viele dieser Studien besteht darin, dass die aktive Kraft nach der Entfernung des Muskelgewebes von den Kulturplattformen und der Befestigung an einem Kraftaufnehmer quantifiziert wird, was destruktiv ist und daher darauf beschränkt ist, als Endpunkt-Assay zu dienen9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Andere haben Kultursysteme entwickelt, die nicht-invasive Methoden zur Messung der Wirkkraft ermöglichen, aber nicht alle sind für Molekültestanwendungen mit hohem Gehalt geeignet7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur Herstellung von Human Muscle Microtissues (hMMTs) in der Skelettmuskel (Myo) microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) Plattform; ein 96-Well-Plate-Gerät, das die Massenproduktion von 3D-Skelettmuskel-Mikrogeweben30unterstützt. Die MyoTACTIC-Plattenherstellungsmethode ermöglicht die Erzeugung einer 96-Well-Polydimethylsiloxan (PDMS)-Kulturplatte und aller entsprechenden Well-Merkmale in einem einzigen Gießschritt, wobei jede Vertiefung eine relativ kleine Anzahl von Zellen für die Bildung von Mikrogeweben benötigt. Mikrogewebe, die in MyoTACTIC gebildet werden, enthalten ausgerichtete, gestreifte und mehrkernige Myotuben, die von Gut zu Brunnen des Geräts reproduzierbar sind und bei Reifung auf chemische und elektrische Reize in situ reagieren können30. Hierin werden die Technik zur Herstellung eines PDMS MyoTACTIC-Kulturplattengeräts aus einer Polyurethan (PU)-Replik, eine optimierte Methode zur Implementierung immortalisierter menschlicher myogener Vorläuferzellen zur Herstellung von hMMTs und die funktionelle Bewertung der technischen hMMT-Krafterzeugung und der Calciumhandhabungseigenschaften skizziert und diskutiert.

<table><tbody><tr><td>0,9% Kochsalzlösung, sterile</td><td>Hausmarke</td><td>1010</td><td>10 mL Aliquots der Lösung werden hergestellt und bei 4° gelagert; C</td></tr><tr><td>25G Nadel</td><td>BD, Medstore, Universität Toronto</td><td>2548-CABD305127</td><td></td></tr><tr><td>6-Aminocapronsäure, &ge; 99% (Titration), Pulver</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A2504-100G</td><td>Eine Stammlösung von 50 mg / ml wird durch Auflösen von 5 mg 6-Aminocapronsäurepulver in 100 mL autoklaviertem, destilliertem Wasser erzeugt. Die Lösung wird vakuumfiltriert und 10 mL Aliquots werden bei 4° gelagert; C</td></tr><tr><td>6,35 mm ID Schlauch</td><td>VWR</td><td>60985-528</td><td></td></tr><tr><td>AB1167 Myoblast Cell Line</td><td>Institut de Myologie (Paris, Frankreich)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arbiträrsignalgenerator</td><td>Rigol</td><td>DG1022Z</td><td></td></tr><tr><td>Basalmembranextrakt (Geltrex)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14132-02</td><td>Gelagert als Aliquots von 50 & Mikro; L oder 100 &micro; L bei -80°; C</td></tr><tr><td>Tisch-Vakuumkammer</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>D2672</td><td></td></tr><tr><td>BNC auf Aligator Clip-Kabel</td><td></td><td></td><td>Bestellt bei Amazon</td></tr><tr><td>Culture Plastics</td><td>Sarstedt</td><td></td><td>Enthält Kulturplatten, serologische Pipetten usw</td></tr>. <tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>D8418-250ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, Pulver, kein Kalzium, kein Magnesium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>21600069</tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Hierbei handelt es sich um ein DMEM mit hohem Glukosegehalt und L-Glutamin und Natriumpyruvat</td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum</td><td>Fisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen aus Rinderplasma</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>F8630-5G</td><td>Aliquots im Bereich von 7 - 10 mg Fibrinogenpulver werden hergestellt und bei -20 ° C gelagert. C</td></tr><tr><td>Filtropur Spritzenfilter, 0,22 μm Porengröße</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Humanes rekombinantes Insulin</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>91077C</td><td>Stammlösung ist 100X und wird durch Auflösen von 1 mg humanem rekombinantem Insulin in 1 mL DMEM und 1 & Mikro hergestellt; L von NaOH 10N. Die Lösung wird filtriert und als 1 mL Aliquote bei 4 μg gelagert; C</td></tr><tr><td>Bilderfassungssoftware</td><td>Olympus</td><td>cellSens Dimension</td><td></td></tr><tr><td>Bildverarbeitungssoftware</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Ofen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop - Kamerahalterung</td><td>Labcam</td><td>Labcam für iPhone</td><td>Bei Amazon bestellt</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Einwegspritzen aus Kunststoff, 1cc</td><td>BD</td><td>2606-309659</td><td></td></tr><tr><td>Einwegspritzen aus Kunststoff, 50cc</td><td>BD</td><td>2612-309653</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127, Pulver, BioReagenz</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td>Eine 5%ige Stammlösung von Pluronsäure wird hergestellt, indem 5 g Pluronsäurepulver in 100 ml gekühltem, autoklaviertem, destilliertem Wasser aufgelöst werden. Die Lösung wird vakuumfiltriert und 10 mL Aliquots werden bei 4° gelagert; C</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silikonelastomer Kit)</td><td>Dow</td><td>4019862</td><td>Kits sind auch bei Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich usw. erhältlich.</td></tr><tr><td>Polyurethan-Negativform</td><td>im Haus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trennmittel</td><td>Mann Release Technologies</td><td>200</td><td></td></tr><tr><td>Drehschieber-Vakuumpumpe</td><td>Edwards</td><td>A65401906</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>Almedic, Medstore, Universität von Toronto</td><td>2586-M36-0100</td><td></td></tr><tr><td>Einschneidige Rasierklinge</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Skelettmuskelzelle Basal Medium</td><td>Promocell</td><td>C-23260</td><td>30 mL Aliquote werden erzeugt und bei 4°C gelagert.</td></tr><tr><td>Wachstumsmedium für Skelettmuskelzellen (gebrauchsfertig)</td><td>Promocell</td><td>C-23060</td><td>42 mL Aliquots werden erzeugt und bei 4 °C gelagert.</td></tr><tr><td>Smartphone (iPhone)</td><td>Apple</td><td>SE</td><td></td></tr><tr><td>Standard Duty Trockenvakuumpumpe</td><td>Welch</td><td>2546B-01</td><td></td></tr><tr><td>Sterilisationsbeutel</td><td>Alliance</td><td>211-SCM2</td><td></td></tr><tr><td>Fingerhut</td><td>Igege</td><td></td><td>Bestellt bei Amazon</td></tr><tr><td>Thrombin aus menschlichem Plasma</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T6884-250UN</td><td>100 Einheiten Thrombin werden in 1 ml einer 0,1%igen BSA-Lösung gelöst. 10 & Mikro; L-Aliquots werden bei -20°C zubereitet und gelagert.</td></tr><tr><td>Verzinnter Kupferdraht</td><td>Arco</td><td>B8871K48</td><td>Bestellt bei Amazon</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4 %</td><td>Thermo Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0,25 %</td><td>Thermo FIsher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumkammer 2</td><td>SP Bel-Art</td><td>F42027-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

bewertung funktioneller metriken der skelettmuskelgesundheit in mikrobeschwerden der menschlichen skelettmuskulatur

Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues

Dreidimensionale (3D) In-vitro-Modelle der Skelettmuskulatur sind ein wertvoller Fortschritt in der biomedizinischen Forschung, da sie die Möglichkeit bieten, die Reform und Funktion der Skelettmuskulatur in einem skalierbaren Format zu untersuchen, das experimentellen Manipulationen zugänglich ist. 3D-Muskelkultursysteme sind wünschenswert, da sie es Wissenschaftlern ermöglichen, skelettierte Muskeln ex vivo im Kontext menschlicher Zellen zu untersuchen. 3D-In-vitro-Modelle ahmen Aspekte der nativen Gewebestruktur der erwachsenen Skelettmuskulatur genau nach. Ihre universelle Anwendung ist jedoch durch die Verfügbarkeit von Plattformen begrenzt, die einfach herzustellen, kostengünstig und benutzerfreundlich sind und relativ hohe Mengen an menschlichem Skelettmuskelgewebe liefern. Da die Skelettmuskulatur eine wichtige funktionelle Rolle spielt, die im Laufe der Zeit in vielen Krankheitszuständen beeinträchtigt wird, ist eine experimentelle Plattform für Mikrorisikostudien am praktischsten, wenn minimal-invasive Messungen der transienten und kontraktilen Kalziumkraft direkt in der Plattform selbst durchgeführt werden können. In diesem Protokoll wird die Herstellung einer 96-Well-Plattform namens "MyoTACTIC" und die Massenproduktion von 3D-Mikrogeweben (hMMTs) für menschliche Skelettmuskeln beschrieben. Darüber hinaus werden die Methoden für eine minimalinvasive Anwendung der elektrischen Stimulation beschrieben, die wiederholte Messungen der Skelettmuskelkraft und der Kalziumhandhabung jedes Mikrogewebes im Laufe der Zeit ermöglicht.

Beschrieben sind Hierin Verfahren zum Gießen einer 96-Well-PDMS-basierten MyoTACTIC-Kulturplattform aus einer PU-Form, zur Herstellung von Arrays von hMMT-Replikgeweben und zur Analyse von zwei Aspekten der hMMT-Funktion innerhalb der Kulturvorrichtung -Krafterzeugung und Calciumhandhabung. Abbildung 1 bietet einen schematischen Überblick über die Vorbereitung von MyoTACTIC-Kulturbohrungen vor der hMMT-Aussaat. PDMS ist ein weit verbreitetes Polymer auf Silikonbasis, das leicht geformt werde...

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von Arrays von 3D-Mikrogeweben der menschlichen Skelettmuskulatur und minimalinvasiven Downstream-In-situ-Funktionsassays, einschließlich kontraktiler Kraft- und Kalziumhandhabungsanalysen.

Bewertung funktioneller Metriken der Skelettmuskelgesundheit in Mikrobeschwerden der menschlichen Skelettmuskulatur

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study ...

Unser Protokoll beschreibt detaillierte Methoden zur Herstellung und Analyse einer 3D-Mikrogewebekultur des menschlichen Skelettmuskels. Muskelmikrogewebe können für Studien der grundlegenden Muskelbiologie, Krankheitsmodellierung oder für Kandidatenmolekültests angewendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine In-situ-Beurteilung der kontraktilen Kraft und der Calciumtransienten ermöglicht.Aus diesem Grund können Sie Längsschnittuntersuchungen der Muskelgewebefunktion durchführen. Brennen Musgrave und Heta Lad, Doktoranden aus meinem Labor, werden das Verfahren demonstrieren. Legen Sie zwei bis drei Stunden vor der Zellaussaat eine sechs gut milde taktische Tellerportion in eine 10 Zentimeter große Zellkulturschale.Bereiten Sie jede einzelne myotaktische Kultur gut vor, indem Sie 100 Mikroliter einer 5% pluronischen F-127-Lösung hinzufügen. Verwenden Sie den Deckel, um die Vertiefungen abzudecken, und tragen Sie einen Paraffinfilm auf, um die Schüssel zu versiegeln. Zentrifugieren Sie die Schale bei 1.550 mal G für eine Minute in einer Zentrifuge, die mit einem Plattenspinneradapter ausgestattet ist.Lagern Sie die Kulturschale bei vier Grad Celsius, bis die Zellen für die Aussaat bereit sind. Dann langsam 150 Mikroliter Aliquot Basalmembranextrakt und 110 Mikroliter Aliquot Thrombin auf Eis in der Kulturhaube auftauen. In der Zellkulturhaube werden 700 Mikroliter 0,9% Kochsalzlösung zu einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen mit sieben Milligramm pulverisiertem Fibrinogen gegeben.Legen Sie das Röhrchen für drei bis fünf Minuten ohne Wirbelung in einen 37 Grad Celsius großen Zellkultur-Inkubator. Entfernen und streichen Sie das Röhrchen vorsichtig, dann pulsieren Sie die gelöste Lösung in einer Mikrozentrifuge, bevor Sie sie in die Kulturhaube zurückführen. Filtrieren Sie die Fibrinogenlösung mit einer Ein-Milliliter-Spritze, die mit einem 0,22-Mikrometer-Spritzenfilter ausgestattet ist.Dann die gelöste Fibrinogenlösung zusammen mit dem Basalmembranextrakt und den Thrombin-Aliquots auf Eis übertragen. Bereiten Sie die Gewebewachstumsmedien bei 37 Grad Celsius vor und erwärmen Sie sie vor, die nach der Aussaat der Gewebe in die Kulturtöpfe eingebracht werden. Entfernen Sie die Zellkulturplatten aus dem Inkubator und aspirieren Sie die Kulturmedien.Dann waschen Sie die Zellen einmal, indem Sie fünf Milliliter DPBS in jede Kulturplatte geben. Aspirieren Sie den DPBS und lösen Sie die Zellen, indem Sie einen Milliliter 0,25% Trypsin EDTA in jede Kulturschale geben. Legen Sie die Platte für drei Minuten in den Zellkultur-Inkubator, halten Sie das Trypsin, indem Sie drei Milliliter Waschmedium in die Kulturschale geben, und übertragen Sie die Zellen dann in ein konisches Röhrchen von geeigneter Größe.Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 400 mal G für 10 Minuten. Aspirieren Sie das Medium vorsichtig, ohne das Zellpellet zu beschädigen, und suspendieren Sie die Zellen dann in einem Milliliter des Waschmediums erneut. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblaufarbstoff unter Hellfeldmikroskopie.Um sechs Gewebe zu säen, bereiten Sie genügend Zellen und extrazelluläre Matrix für acht Gewebe vor, wodurch Verluste und Blasenbildung berücksichtigt werden. Übertragen Sie 1,2 Millionen Zellen in ein neues konisches Rohr und erhöhen Sie dann das Volumen mit Waschmedium auf 10 Millimeter. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 400 mal G für 10 Minuten.Bereiten Sie 150 Mikroliter ECM-Mischung in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor und lagern Sie die Mischung bis zur Verwendung auf Eis. Aspirieren Sie das Medium aus dem konischen Röhrchen, das die Zellen enthält, und achten Sie darauf, das Zellpellet zu vermeiden. Streichen Sie kräftig mit einem behandschuhten Finger über das Ende der Röhre, bis das Pellet als Zellschlamm erscheint.Übertragen Sie 120 Mikroliter der ECM-Lösung auf das Röhrchen, das die Zellschlämme enthält, und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Zellen innerhalb des ECM vollständig neu zu suspendieren, um eine einzelne Zellsuspension zu erzeugen. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen und legen Sie die EcM-Suspension der Zelle bis zur Verwendung auf Eis. Legen Sie die gekühlte 10-Zentimeter-Schale mit den myotaktischen Vertiefungen auf einen Eisbeutel in der Zellkulturhaube und saugen Sie die pluronische F-127-Lösung aus jeder Vertiefung ab.Lassen Sie die verbleibende pluronische F-127-Lösung aus dem porösen PDMS austreten und setzen Sie sich auf dem Boden des Bohrlochs ab, indem Sie die Vertiefungen fünf Minuten lang auf Eis sitzen lassen und dann erneut absaugen. Pipettieren Sie die EcM-Zellsuspension vorsichtig, um die Zellen wieder zu suspendieren, und übertragen Sie dann 105 Mikroliter der Suspension in ein frisches, vorgekühltes 1,5-Milliliter-Röhrchen, indem Sie es nahe an der Oberseite greifen. Fügen Sie 0,84 Mikroliter à 100 Einheiten pro Milliliter Thrombin-Stammlösung zu den 105 Mikrolitern Zell-ECM-Suspension hinzu.Pipettieren Sie schnell und gründlich, um zu mischen, und vermeiden Sie die Einführung von Blasen. Fügen Sie 15 Mikroliter der Zell-ECM-Mischung zu jeder Vertiefung hinzu, ohne die Pipette in den Boden der Vertiefung zu drücken. Verteilen Sie mit zwei leichten Bewegungen die Zellsuspension hinter jedem Pfosten im Brunnen.Legen Sie den Deckel auf die 10 Zentimeter große Kulturplatte und geben Sie ihn für etwa fünf Minuten in einen 37 Grad Celsius großen Gewebekultur-Inkubator. Fügen Sie 200 Mikroliter vorgewärmtes Gewebewachstumsmedium zu jedem myotaktischen Brunnen hinzu, nachdem die Zell-ECM-Mischung polymerisiert wurde. Ersetzen Sie den Deckel der 10-Zentimeter-Schale und bewahren Sie ihn bis zur Differenzierung im Inkubator auf.Während einer 14-tägigen Kulturperiode zeigten Myoblasten die Aspekte des nativen Gewebes, indem sie sich in der milden Taktik gut selbst organisierten, um ein 3D-Mikrogewebe mit mehrkernigen gestreiften Myotuben zu bilden. Myotuben haben Sarkomerstreifen, die durch Immunfärbung für sarkomerisches Alpha-Actinin visualisiert wurden. Um gut ausgerichtete Myotuben zu erreichen, sollten technische Fehler wie Blasenbildung beim Pipettieren oder schädliche pluronische Beschichtungen während der Aspiration vermieden werden.Eine repräsentative Verschiebung des myotaktischen Wellplattenpfostens als Reaktion auf nieder- und hochfrequente elektrische Stimulation ist hier gezeigt, was darauf hindeutet, dass Myotuben auf unterschiedliche elektrische Reize reagieren und sich entsprechend zusammenziehen. Die Quantifizierung der Postverschiebung ermöglicht die Umwandlung der HMMTs in absolute kontraktile Kraft. Calciumtransienz auf HMMTs aus GCaMP6-transduzierten Myoblasten wurden ebenfalls als Reaktion auf nieder- und hochfrequente Stimulation analysiert.Die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität kann als Messung der Calcium-Handling-Eigenschaften von HMMTs verwendet werden. Die meisten Menschen, die diese Gewebeaussaat zum ersten Mal durchführen, kämpfen mit der Zugabe der extrazellulären Zellmatrix zu den Vertiefungen und mit der Bildung von Blasen. Wir empfehlen, die Technik vor dem ersten Versuch mit Zellen an einigen Ersatz-Mikrogewebekulturtöpfen mit einer sehr einfachen viskosen Lösung zu üben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Myo-mechanischen Analyse von isolierten Skelettmuskel

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Mikro Siliziumcantilevern biegsam Kulturoberflächen zur Messung der Kontraktionskraft der Muskelzellen in vitro. Zellkontraktion bewirkt Cantilever Biege, die gemessen werden können, aufgezeichnet und umgerechnet in die Messwerte von Kraft und bietet eine nicht-invasive und skalierbaren System zur Messung Kontraktionsfunktion in vitro.

Nutzung von Microscale Siliziumcantilevern to Cellular Kontraktionsfähigkeit beurteilen In-vitro-

Dieses Protokoll beschreibt eine robuste, reproduzierbare und einfache Methode zur Isolierung und Kultivierung von Myoblasten Vorläuferzellen aus dem Skelettmuskel von Erwachsenen und alten Menschen. Die Muskeln hier sind Fuß- und Beinmuskeln. Dieser Ansatz ermöglicht die Isolierung einer angereicherten Population von primären Myoblasten für funktionelle Studien.

Herstellung und Kultur von Myogenic Vorläuferzellen / Primär-Myoblasten aus Skelettmuskel von adulten und im Alter von Menschen

Messung von Nagetier Skelettmuskulatur kontraktile Funktion ist ein nützliches Tool, das Fortschreiten der Krankheit sowie die Wirksamkeit der therapeutischen Intervention zu verfolgen verwendet werden kann. Wir beschreiben hier die nicht-invasive, in Vivo Beurteilung der releveurs Muskeln, die im Laufe der Zeit in der gleichen Maus wiederholt werden kann.

Nicht-invasive Beurteilung des releveurs Muskelfunktion bei Mäusen

Dieser technische Bericht beschreibt eine Variation der modifizierten Bergström-Technik für die Biopsie des Musculus tibialis anterior, die Faserschäden begrenzt.

Sammlung von Skelettmuskelbiopsien aus dem Superior-Fach des menschlichen Musculus Tibialis Anterior für mechanische Bewertung

Die Quantifizierung der maximalen Kniestreckkraft ist unerlässlich, um funktionelle Anpassungen an Alterung, Krankheit, Verletzung und Rehabilitation zu verstehen. Wir stellen eine neuartige Methode vor, um das isometrische Spitzentitanmoment der Kniestreckung wiederholt in vivo zu messen.

In vivo Messung der Kniestreckmuskelfunktion bei Mäusen

In diesem Protokoll wird eine In-vitro-Kultivierungs- und Funktionsanalysemethode für Muskelstammzellen beschrieben, die die meisten ihrer Wechselwirkungen mit ihrer endogenen Nische bewahrt.

Single Myofiber Culture Assay zur Beurteilung der Funktionalität adulter Muskelstammzellen ex vivo

Dieses Protokoll stellt Methoden zur Erzeugung von 3D-konstruiertem Herz- und Skelettmuskelgewebe bereit und beschreibt deren Verwendung in präklinischen Arzneimittel-Screening-Modalitäten. Die beschriebenen Methoden verwenden ein magnetisches Sensorsystem, um die gleichzeitige Beurteilung von 24 Geweben parallel zu ermöglichen.

Präklinische Arzneimitteltests in skalierbaren 3D-Muskelgeweben

Wir beschreiben ein Protokoll zur Gewinnung enzymatisch dissoziierter Fasern unterschiedlicher Länge und Art aus sechs Muskeln erwachsener Mäuse: drei davon bereits beschrieben (Flexor digitorum brevis, Extensor digitorum longus, soleus) und drei von ihnen erstmals erfolgreich dissoziiert (Extensor hallucis longus, Peroneus longus, Peroneus digiti quarti).

Intakte kurze, mittlere und lange Skelettmuskelfasern, die durch enzymatische Dissoziation von sechs Hintergliedmaßenmuskeln von Mäusen gewonnen wurden: Jenseits des Flexor Digitorum brevis

Hier beschreiben wir eine umfassende Methode zur Messung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung in frischen permeabilisierten Skelettmuskelfasern aus menschlichen oder Mausmuskeln. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Quantifizierung der mitochondrialen Atmung und die Beurteilung der Brennstoffpräferenz und der metabolischen Flexibilität unter Beibehaltung bestehender mitochondrialer Netzwerke und der Membranintegrität.

Messung der mitochondrialen Atmung in Skelettmuskelfasern von Mensch und Maus mittels hochauflösender Respirometrie

Dieses Protokoll verwendet Mikro-Computertomographie, um eine kostengünstige Quantifizierung der fettfreien Masse zu ermöglichen, einschließlich Skelettmuskel- und Viszeralgewebe, Fettgewebe und Skelettgewebe bei Kleintieren. Sie unterscheidet zwischen magerem und fettem Gewebe, was für die biomedizinische Forschung, insbesondere in der translationalen Forschung an Kleintieren, erhebliche Vorteile bietet.

Nicht-invasive Quantifizierung der Skelettmuskulatur bei Kleintieren mittels Mikro-Computertomographie

Erfahren Sie die Herstellung und Analyse von 3D-humanen Skelettmuskel-Mikrogeweben mit der MyoTACTIC-Plattform. Diese Methode ermöglicht wiederholte Messungen von Kontraktionskraft und Calciumtransienten für Muskelbiologie und Krankheitsmodellierung.

Bewertung funktioneller Metriken der Skelettmuskelgesundheit in Mikrobeschwerden der menschlichen Skelettmuskulatur

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