Generierung von 3D-Ganzlungenorganoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen zur Modellierung der Lungenentwicklungsbiologie und -krankheit

Dieses Protokoll verwendet induzierte pluripotente Stammzellen, um sie in Lungenzellen zu differenzieren, um menschliche Lungenerkrankungen und -entwicklungen in einer Schale zu modellieren. Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es schwierig ist, primäres menschliches Lungengewebe zu erhalten und zu kultivieren. Der Hauptvorteil der Unterscheidung von Lungenzellen von pluripotenten Stammzellen besteht darin, eine konstante Versorgung mit spezifischen Lungenzellen zu haben, um die Entwicklung und Krankheit der menschlichen Lunge zu untersuchen.

Diese Zellen können über lange Zeiträume in Zellkultur gehalten werden, können für zukünftige Anwendungen kryokonserviert werden und können genetisch manipuliert werden, um Genmutationen zu untersuchen. Das Verfahren wird Rachel McVicar, eine Doktorandin aus meinem Labor, demonstrieren. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, tauen Sie langsam ein Wachstumsfaktor-reduziertes oder GFR-Basalmembranmatrixmedium auf Eis auf und verdünnen Sie es in einem gleichen Volumen von kaltem DMEM F12.

Legen Sie die P1000-Spitzen vor gebrauchsfertig in den Gefrierschrank, um sie zu kühlen. Als nächstes beschichten Sie jede Vertiefung einer 12-Well-Platte mit 500 Mikrolitern des 50% GFR-Basalmembranmatrixmediums und entfernen Sie überschüssige Mediumsmischungen und Blasen aus den Vertiefungen. Legen Sie die Brunnenplatten auf Nasseis oder einen Kühlschrank bei vier Grad Celsius, um sie für 20 Minuten einzustellen, und bewegen Sie die Platte dann über Nacht in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

Wenn hohe PSEs 70% Konfluenz erreichen, fügen Sie 10 mikromolaren ROCK-Inhibitor Y27632 zu human induzierten pluripotenten Stammzellen hinzu und warten Sie eine Stunde vor der Dissoziation. Saugen Sie die Medien ab und waschen Sie die Zellen einmal mit PVS. Dissoziieren Sie IPSCs durch Zugabe von 500 Mikrolitern Zellablösungsmedium pro Vertiefung und inkubieren Sie für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator.

Nach der Inkubation 500 Mikroliter Stammzell-Passaging-Medium pro Vertiefung hinzufügen. Pipettieren Sie zellen vorsichtig mit einer P1000-Spitze, um eine einzelne Zellsuspension zu erhalten. Dann übertragen Sie die dissoziierten Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 300 mal G.Nach der Zentrifugation saugen Sie das Medium ab und resuspenieren Sie das Zellpellet mit einem Milliliter mTeSR Plus-Medium, ergänzt mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren.

Nachdem Sie die Zellen gezählt haben, fügen Sie zweimal 10 zu den fünften IPSCs zu jeder Vertiefung einer 12-Well-GFR-Medium-beschichteten Platte hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag aspirieren Sie das mTeSR Plus, bevor Sie definitive Endoderm- oder DE-Induktionsmedien hinzufügen. Wechseln Sie an den Tagen zwei und drei die DE-Induktionsmedien.

Beginnen Sie am vierten Tag mit der AFE-Induktion, indem Sie DE-Induktionsmedien durch serumfreies Basalmedium ersetzen. Wechseln Sie das AFE-Medium drei Tage lang täglich, bevor Sie die AFE-Effizienz am Ende des sechsten Tages analysieren. Am siebten Tag das GFR-Basalmembran-Matrix-Medium auf Eis zur späteren Verwendung auftauen.

Fahren Sie gleichzeitig mit der Differenzierung der Lungenvorläuferzellen fort, indem Sie die AFE-Medien ansaugen und die Vertiefungen mit PVS waschen. Einen Milliliter Zellablösung in den Brunnen geben und 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation einen Milliliter Abschreckmedium in die Wells geben, die Zellablösung enthalten.

Halten Sie Zellen als Aggregate, indem Sie vorsichtig nach oben und unten pipettieren. Stellen Sie sicher, dass alle Zellen entfernt sind, aber um sie fünf Minuten lang in ein konisches 15-Milliliter-Rohr zur Zentrifugation bei 300 mal G zu übertragen. Entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in LPC-Induktionsmedien.

Zählen Sie die Zellen und fügen Sie 2,5 mal 10 zu den fünften Zellen zu 100 Mikrolitern kaltem GFR-Basalmembranmatrixmedium hinzu und mischen Sie gut. Legen Sie einen Tropfen in einen Brunnen einer 12-Well-Platte und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter LPC-Medien pro Vertiefung hinzu, um sicherzustellen, dass der mittlere Tropfen vollständig eingetaucht ist und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert wird.

Wechseln Sie am achten Tag das LPC-Medium, um den ROCK-Inhibitor Y27632 zu entfernen. Wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag und analysieren Sie die LPC-Effizienz am Ende von Tag 16. Waschen Sie am Tag 17 die Wells und fügen Sie 500 Mikroliter von zwei Mikrogramm pro Milliliter dispase hinzu.

Die Dispase-Mischung mit einer P1000-Pipette pipettieren und 15 Minuten inkubieren, dann die Mischung pipettieren und weitere 15 Minuten inkubieren. Nach der Inkubation einen Milliliter des Abschreckmediums in die Dispaese geben, die Vertiefungen enthält, und die Zellen in konische Röhrchen überführen. Zentrifugieren und resuspenieren Sie das Pellet in einem Milliliter gekühltem PVS und wiederholen Sie dann die Zentrifugation.

Dann resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Zellablösungsmedium. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 12 Minuten, fügen Sie dann eine gleiche Menge Abschreckmittel hinzu und zentrifugieren Sie erneut. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Abschreckmedium und 10 mikromolaren ROCK-Inhibitor Y27632.

Führen Sie eine Zellzählung durch, um das Volumen zu berechnen, das benötigt wird, um acht mal 10 bis zur vierten Zelle pro Vertiefung zu erhalten. Dann benötigte aliquot Volumen von LPC-Zellaggregaten in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge für fünf Minuten bei 300 mal G.Entfernen Sie überschüssigen Überstand, ohne das Zellpellet zu rühren, und lassen Sie 10 Mikroliter Restmedien zurück. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 Mikroliter kaltes GFR-Basalmembranmatrixmedium und übertragen Sie die Zellen auf Zellkulturmembraneinsätze.

Bei 37 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten inkubieren. Nach der Inkubation einen Milliliter 3D-Organoid-Induktionsmedium in die basolaterale Kammer des Einsatzes geben und sechs Tage lang jeden zweiten Tag durch frisches Medium ersetzen. Schalten Sie am 23. Tag das Medium auf das 3D-Verzweigungsmedium um und wechseln Sie dann sechs Tage lang jeden zweiten Tag das Medium.

Wechseln Sie am 29. Tag zum 3D-Reifungsmedium und ersetzen Sie das Medium in den nächsten sechs Tagen jeden zweiten Tag. Am vierten Tag der DE-Induktion zeigen die angeschlossenen Zellen eine kompakte Kopfsteinpflastermorphologie. Die definitiven Endodermmarker CXCR4 und SOX17, die mit Kernen überlagert waren, wurden exprimiert, was die endodermale Differenzierung bestätigte.

Die vordere Vorderdarminduktion wurde am siebten Tag bestätigt, wobei die Morphologie enger verdichtete Zellen zeigte und die Marker FOXA2 und SOX2 mit Kernen überlagert waren. Die Erzeugung von 3D-Lungenvorläuferzellen wurde mit 3D-Sphäroiden und der endogenen Expression von NKX2-1 GFP in einer Reporterzelllinie bestätigt. Nach einer dreiwöchigen Differenzierung in ganze Lungenorganoide wurden die Lungenmarker immunzytochemisch analysiert.

Marker für die verzweigte Morphogenese SOX2 und SOX9, die von Kernen überlagert werden, wurden in den Organoiden beobachtet. Die proximalen Lungenmarker P63 und KRT5, beides Marker von Basalzellen, wurden zusammen mit SCGB3A2, einem Marker für Clubzellen, erfolgreich nachgewiesen. Distale Lungenmarker induzierten Pro SPC- und SPB-Marker für alveoläre Typ-II-Zellen.

Und HOPX-Marker von alveolären Typ-I-Zellen. Zusätzlich wurden NKX2-1 und ZO1 mit Kernen überlagert exprimiert. Die Mesenchyme-Lungenzellmarker PGFR Alpha, ein Marker für Fibroblasten, koexprimiert mit SOX9, repräsentierten distales Mesenchym.

Vimentin wurde ebenfalls exprimiert und in der Lunge verteilt. Nach diesem Verfahren können die Lungenorganoide mit induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Endothel- und Immunzellen investiert werden. Lungenentwicklung und -erkrankung erfolgt durch eine Signalübertragung zwischen den epithelialen und mesenchymalen Zellpopulationen, aber auch von Endothelzellen und Makrophagen.

Ein 3D-Lungengewebemodellsystem ist klinisch relevant für die Untersuchung menschlicher Krankheiten und Therapeutika.