Name: Generierung von 3D-Ganzlungenorganoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen zur Modellierung der Lungenentwicklungsbiologie und -krankheit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Erfahren Sie die Differenzierung von hiPSCs zu 3D-Lungenorganoiden. Diese Methode ermöglicht die Modellierung menschlicher Lungenentwicklung und Krankheiten in vitro mit epithelialen und mesenchymalen Zellpopulationen.

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Diese Forschung wurde vom California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022) unterstützt.

Dieses Studienprotokoll wurde vom Institutional Review Board des Human Research Protections Program der UCSD (181180) genehmigt.
1. Definitive Endoderm-Induktion aus induzierten pluripotenten Stammzellen (Tag 1 - 3)
<ol><li>Langsames Auftauen des Wachstumsfaktors reduziert (GFR)-Basalmembran (BM) Matrixmedium auf Eis 30 Minuten vor Gebrauch. In kaltem DMEM/F12-Gemisch das GFR BM-Matrixmedium 1:1 so verdünnen, dass es 50% dieses Mediums ausmacht. Legen Sie die P1000-Pipettenspitzen in den Gefrierschrank, um sie vor gebrauchen zu kühlen.</li>
	<li>Beschichten Sie jede Vertiefung einer 12-Well-Platte mit 500 μL 50% GFR-Basalmembranmatrixmedium, das in eiskaltem DMEM/F12 hergestellt wurde. Sobald die gewünschte Anzahl von Vertiefungen beschichtet ist, entfernen Sie überschüssiges Mediumsgemisch und/oder Blasen aus den Vertiefungen und stellen Sie die Platte bei 4 °C für 20 minuten auf Eis oder Kühlschrank. Dann die Platte über Nacht bei 37 °C zum Gelieren und Trocknen in den Inkubator bringen.</li>
	<li>Sobald hiPSCs eine Konfluenz von 70-90% erreicht haben, fügen Sie eine Stunde vor der Dissoziation 10 μM Rho-assoziierten Kinase (ROCK) Inhibitor Y-27632 hinzu. Saugen Sie das Medium ab und waschen Sie es einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Dissoziieren Sie hiPS-Zellen durch Zugabe von Zellablösungsmedium (0,5 ml / Vertiefung einer 12-Well-Platte) und inkubieren Sie für 20 min bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator.</li>
	<li>Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und geben Sie 0,5 ml/12-Well Stammzell-Passaging-Medium (Tabelle 1) in die Vertiefungen; Zellen mit einer P1000-Spitze sanft verdrängen, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Übertragen Sie dissoziierte Zellen in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen; Zentrifuge für 5 min bei 300 x g.</li>
	<li>Aspirieren Sie das Medium ab und resuspenieren Sie das Zellpellet mit 1 ml mTeSR Plus-Medium, ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor (Y-27632). Führen Sie eine Zellenzählung durch. Fügen Sie 2,0 x 105 hiPSCs in 1 ml mTeSR, ergänzt mit ROCK-Inhibitor Y-27632, pro Vertiefung einer 12-Well GFR-Basement-Membran medium coated Plate hinzu. Über Nacht bei 37 °C inkubieren. HINWEIS: Die Anzahl der Zellaussaatzellen muss pro Zelllinie optimiert werden. 24 h nach dem Plattieren sollten die Vertiefungen 50% -70% konfluent sein.</li>
	<li>An Tag 1 das mTeSR Plus absaugen und definitive Endoderm (DE)-Induktionsmedien (Tabelle 1) hinzufügen, die mit 100 ng/ml humanem Aktivin A und 5 μM GSK3β-Inhibitor/Wnt-Aktivator CHIR99021 ergänzt werden. HINWEIS: DE-Medien mit GSK3β-Inhibitor/Wnt-Aktivator CHIR99021 sollten innerhalb von 20-24 h nach Tag 1 DE-Induktion für eine erfolgreiche Differenzierung entfernt werden.</li>
	<li>Wechseln Sie an Tag 2 und Tag 3 zu DE-Induktionsmedien, die nur mit 100 ng /ml Aktivin A ergänzt werden. HINWEIS: Die DE-Differenzierung sollte insgesamt 72 h nicht überschreiten, da sonst die Wirksamkeit abnimmt. Wenn an Tag 4 ein Absterben großer Zellen beobachtet wird, verringern Sie die gesamte DE-Medienexpositionszeit um 6-12 h.</li>
	<li>Um die DE-Effizienz zu analysieren, bestätigen Sie mehr als 90% CXCR4- und/oder cKit-Expression mittels Durchflusszytometrie oder Immunfluoreszenzanalyse von FOXA2 und/oder SOX17 (Abbildung 2a).</li>
</ol>2. Induktion des vorderen Vorderdarmendoderms (AFE) (Tag 4 - 6)
<ol><li>Wechseln Sie an Tag 4 das Medium zu serumfreiem Basalmedium (SFBM) (Tabelle 1), ergänzt mit 10 μM SB431542 und 2 μM Dorsomorphin zur AFE-Induktion. Wechseln Sie die AFE-Medien täglich für 3 Tage (Tag 4, Tag 5 und Tag 6).</li>
	<li>Um die AFE-Effizienz zu analysieren, bestätigen Sie die robuste Expression von SOX2, TBX1 und FOXA2 durch Immunfluoreszenzfärbung (Abbildung 2b).</li>
</ol>3. Differenzierung der Lungenvorläuferzellen (LPC) (Tag 7 - 16)
<ol><li>An Tag 7 das GFR-Basalmembran-Matrixmedium auf Eis auftauen. Saugen Sie das AFE-Medium ab und waschen Sie es gut mit 1x PBS. 1 ml Zellablösung zugeben und 10 min bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>1 ml Abschreckmedium (2 % FBS in DMEM/F12) in die Vertiefungen geben, die Zellablösung enthalten. Halten Sie Zellen als Aggregate, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Stellen Sie sicher, dass alle Zellen entfernt und in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt werden. Zentrifuge für 5 min bei 300 x g.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in Quenching-Medium, ergänzt mit 10 ng/ml humanem rekombinantem knochenmorphogenem Protein-4 (BMP4), 0,1 μM All-trans-Retinsäure (RA), 3 μM GSK3β-Inhibitor/Wnt-Aktivator CHIR99021 und 10 μM Gesteinsinhibitor Y-27632.</li>
	<li>Führen Sie eine Zellenzählung durch. Fügen Sie 2,5 x 105 Zellen zu 100 μL kaltem GFR-Basement-Membranmatrixmedium hinzu, mischen Sie gut und geben Sie das Tröpfchen in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte. Die Platte bei 37 °C für 30-60 min inkubieren, damit das Medium polymerisieren kann. Fügen Sie 1 ml LPC-Medien, ergänzt mit 10 μM ROCK Inhibitor Y-27632 pro Vertiefung, hinzu, um sicherzustellen, dass der mittlere Tropfen vollständig eingetaucht ist, und inkubieren Sie bei 37 ° C über Nacht.</li>
	<li>Wechseln Sie am Tag 8, 24 h nach der LPC-Induktion, das LPC-Medium, um den ROCK-Inhibitor Y-27632 zu entfernen. Wechseln Sie das LPC-Medium jeden zweiten Tag für insgesamt 9-11 Tage. HINWEIS: Wenn das Medium innerhalb von 24 Stunden gelb wird, wechseln Sie das Medium jeden Tag.</li>
	<li>Um die LPC-Effizienz zu analysieren, bestätigen Sie die robuste Expression des intrazellulären Transkriptionsfaktors NKX2-1 oder führen Sie eine Durchflusszytometrie für die Oberflächenmarker CD47hi/CD26low15 oder CPM18 durch (Abbildung 2c). Grob gesagt sollten die LPC-Sphäroide rund und transparent sein (Abbildung 2c). HINWEIS: Fahren Sie nicht mit der Differenzierung der Lungenorganoide fort, wenn die Effizienz von NKX2-1 unter 30% liegt.</li>
</ol>4.3D Lungenorganoid-Induktion (Tag 16 - 22)
<ol><li>Am Tag 17 das GFR-Basalmembran-Matrixmedium auf Eis auftauen. Aspirieren Sie das LPC-Induktionsmedium. Anschließend werden 2 μg/ml Dispase (1 ml) in die Vertiefung gegeben und das Medium/Dispase-Gemisch mit einer P1000-Pipette resuspendiert. Bei 37 °C für 15 min inkubieren. Die Mischung erneut verdränken und bei 37 °C weitere 15 min inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Dispase und die Zellen in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie gekühltes PBS (2-3 ml), um den Brunnen zu waschen und die Dispase / Zell-Mischung wieder zu verstopfen. Zentrifuge für 5 min bei 400 x g. Entfernen Sie den Überstand manuell und achten Sie darauf, die Medium- / Zellpelletschicht nicht zu entstuben. Wiederholen Sie die gekühlte PBS-Wäsche und zentrifugieren Sie das konische Zentrifugenröhrchen für weitere 5 minuten bei 400 x g.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand manuell und geben Sie dann 2 ml Trypsin-basierte Dissoziationslösung in das konische Zentrifugenröhrchen. Bei 37 °C für 12 min inkubieren.</li>
	<li>Nach der Inkubation resuspendieren Sie die Zellen mit einer P1000-Pipettenspitze. Dann ein gleiches Volumen Abschreckmittel in das konische Zentrifugenröhrchen geben und bei 400 x g für 5 min herunterdrehen. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie Zellen in Löschmedium + 10 μM ROCK Inhibitor Y-27632. HINWEIS: Eine erfolgreiche Lungenorganoidinduktion tritt auf, wenn Zellen als Aggregate eingebettet sind, nicht einzelne Zellen, passen Sie das Pipettieren entsprechend an.</li>
	<li>Führen Sie eine Zellenzählung durch. Berechnen Sie das Volumen, das benötigt wird, um 5,0-8,0 x 104 Zellen pro Bohrloch zu erhalten. Aliquot aggregiert die LPC-Zelle zu 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiert für 5 min bei 400 x g. Entfernen Sie überschüssigen Überstand und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu rühren. Lassen Sie nur 10 μL Restmedien.</li>
	<li>Suspendieren Sie das Zellpellet in 200 μL kaltem GFR-Basalmembranmatrixmedium erneut und fügen Sie sie den Zellkulturmembraneinsätzen hinzu (6,5 mm Durchmesser, 0,4 μm Pore, Polyestermembran). Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 30-60 min, damit das GFR-Basalmembranmatrixmedium polymerisieren kann.</li>
	<li>1 ml 3D-Organoid-Induktionsmedium (Tabelle 1), ergänzt mit Fibroblasten-Wachstumsfaktor-7 (FGF7) (10 ng/ml), FGF10 (10 ng/ml), GSK3β-Inhibitor/Wnt-Aktivator CHIR (3 μM), epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) (10 ng/ml) und 10 μM ROCK-Inhibitor Y-27632 in die basolaterale Kammer des Membraneinsatzes geben. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag für 6 Tage.</li>
</ol>5.3D Lungenorganoidverzweigung (Tag 23 - 28)
<ol><li>Am Tag 23 Wechsel zu 3D-Verzweigungsmedium (Tabelle 1), ergänzt mit FGF7 (10 ng/ml), FGF10 (10 ng/ml), GSK3β-Inhibitor/Wnt-Aktivator CHIR99021 (3 μM), RA (0,1 μM), EGF (10 ng/ml) und vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF) / Plazentawachstumsfaktor (PlGF) (10 ng/ml). Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag für 6 Tage. HINWEIS: An Tag 6 der 3D-Verzweigungsdifferenzierung sollten mehrere verzweigte Organoide vorhanden sein (Abbildung 2).</li>
</ol>6.3D Reifung der Lungenorganoide (Tag 29 - 34)
<ol><li>Wechseln Sie am Tag 29 zu einem 3D-Reifungsmedium (Tabelle 1), das mit dem 3D-Verzweigungsmedium identisch ist, jedoch mit dem Zusatz von Dexamethason (50 nM), cAMP (100 μM) und 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), einem Phosphodiesterase-Inhibitor, der auch isobutylxanthin (100 μM) genannt wird. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag für 6 Tage. HINWEIS: Innerhalb von 24 h nach der 3D-Reifung sollten sich die verzweigten Organoide ausdehnen und in transparente Kugeln übergehen.</li>
</ol>7.3D Immunzytozytochemie des Lungenorganoids
<ol><li>Für die 3D-Analyse des gesamten Lungenorganoids das GFR-Basalmembranmatrixmedium in den Membraneinsätzen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 1 h bei 4 °C fixieren. In Paraffinwachs einbetten und gemäß den standardmäßig veröffentlichten Protokollen auf Objektträger montieren.</li>
	<li>Führen Sie vor der Färbung einen Antigenabruf durch. Zu den Atemwegsmarkierungen gehören KRT5, MUC5AC und SCGB3A2. Alveolare Marker umfassen SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 und HOPX (Abbildung 3).</li>
</ol>8. Entfernung ganzer Lungenorganoide aus dem GFR-Basalmembranmatrixmedium für Passage, FACS oder Kryokonservierung
<ol><li>Um die Organoide vom GFR-Basalmembranmatrixmedium zu dissoziieren, entfernen Sie Medien aus der Basalkammer und fügen Sie 2 μg/ml Dispase (1 ml) in die apikale Kammer hinzu.</li>
	<li>Das Medium/Dispase-Gemisch mit einer P1000-Pipette vorsichtig verdrängen und für 15 min in den Inkubator geben. Die Mischung noch einmal vorsichtig veredeln und weitere 15 min inkubieren.</li>
	<li>1 mL gekühltes PBS (4 °C) zugeben und Organoide mit dem Matrixmedium in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen übertragen. Bei 400 x g für 5 min drehen. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, um das Zellpellet nicht zu stören.</li>
	<li>Noch einmal mit 1 ml gekühltem PBS waschen und bei 400 x g für 5 min herunterdrehen. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, um das Medium/Zell-Gemisch nicht zu stören.</li>
	<li>1 ml Zellablösung in das konische Zentrifugenröhrchen geben, vorsichtig verdreinigen und das GFR-Basement-Membranmatrix-Medium/Zell-Gemisch vorsichtig resuspendieren. Für 12 min in den Inkubator geben, um Zellen als Aggregate oder zur Kryokonservierung zu überreichen) oder 20 min für Einzelzellsuspensionen.</li>
	<li>Fügen Sie das gleiche Volumen an Löschmedien hinzu und drehen Sie es bei 400 x g für 5 min herunter. Resuspend in Abschreckmedium + 10 μM ROCK-Inhibitor Y-27632. HINWEIS: Bei diesem Schritt sollte kein Restmedium der Basalmembran im Rohr zu sehen sein. Wenn das Restmedium übrig bleibt, wiederholen Sie die Schritte 8.5 und 8.6.</li>
	<li>Führen Sie eine Zellenzählung durch. Berechnen Sie das für nachgelagerte Anwendungen benötigte Volumen.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Die erfolgreiche Differenzierung von 3D-Ganzlungenorganoiden (WLO) beruht auf einem mehrstufigen, 6-wöchigen Protokoll mit Liebe zum Detail, einschließlich der Zeit der Exposition gegenüber Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen, der Zelldichte nach dem Passieren und der Qualität der hiPS-Zellen. Informationen zur Problembehandlung finden Sie in Tabelle 2. hiPS-Zellen sollten etwa 70%-80% konfluent sein, mit weniger als 5% spontaner Differenzierung vor der Dissoziation. Dieses Protokoll erfordert das Me...

Die Lunge ist ein kompliziertes, heterogenes, dynamisches Organ, das sich in sechs verschiedenen Stadien entwickelt - embryonaler, pseudoglandulärer, kanalikulärer, sackulärer, alveolärer und mikrovaskulärer Reifung1,2. Die beiden letztgenannten Phasen treten prä- und postnatal in der menschlichen Entwicklung auf, während die ersten vier Phasen ausschließlich während der fetalen Entwicklung auftreten, es sei denn, es tritt eine Frühgeburt auf3. Die embryonale Phase beginnt in der endodermalen Keimschicht und endet mit dem Austrieb der Luftröhre und der Lungenknospen. Die Lungenentwicklung erfolgt zum Teil über die Signalübertragung zwischen den Epithel- und Mesenchymzellen4. Diese Wechselwirkungen führen zu Lungenverzweigung, Proliferation, Bestimmung des zellulären Schicksals und zellulärer Differenzierung der sich entwickelnden Lunge. Die Lunge ist in leitende Zonen (Luftröhre zu den terminalen Bronchiolen) und Atemzonen (respiratorische Bronchiolen zu den Alveolen) unterteilt. Jede Zone enthält einzigartige Epithelzelltypen; einschließlich basaler, sekretorischer, flimmerförmiger, Bürsten-, neuroendokriner und Ionozytenzellen im leitenden Atemweg5, gefolgt von alveolären Typ-I- und -II-Zellen im respiratorischen Epithel6. Über die Entstehung und Reaktion auf Verletzungen der verschiedenen Zelltypen ist noch viel unbekannt. iPSC-abgeleitete Lungenorganoidmodelle ermöglichen die Untersuchung von Mechanismen, die die Entwicklung der menschlichen Lunge vorantreiben, der Auswirkungen genetischer Mutationen auf die Lungenfunktion und der Reaktion sowohl des Epithels als auch des Mesenchyms auf Infektionserreger, ohne dass primäres menschliches Lungengewebe erforderlich ist.
Zu den Markern, die den verschiedenen Stadien der embryonalen Differenzierung entsprechen, gehören CXCR4, cKit, FOXA2 und SOX17 für das definitive Endoderm (DE)7, FOXA2, TBX1 und SOX2 für das vordere Vorderdarmendoderm (AFE)8 und NKX2-1 für frühe Lungenvorläuferzellen9. Bei der embryonalen Lungenentwicklung teilt sich der Vorderdarm in die dorsale Speiseröhre und die ventrale Luftröhre. Die Knospen der rechten und linken Lunge erscheinen als zwei unabhängige Ausscheidungen um die Trachealknospe10. Während der Verzweigung der Morphogenese produziert das Mesenchym, das das Epithel umgibt, elastisches Gewebe, glatte Muskulatur, Knorpel und Gefäßkulatur11. Die Wechselwirkung zwischen Epithel und Mesenchym ist essentiell für eine normale Lungenentwicklung. Dazu gehört die Sekretion von FGF1012 durch das Mesenchym und SHH13, das vom Epithel produziert wird.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gerichteten Differenzierung von hiPS-Zellen in dreidimensionale (3D) ganze Lungenorganoide (WLO). Während es ähnliche Ansätze gibt, die die Isolierung von Lungenvorläuferzellen durch Sortierung im LPC-Stadium beinhalten, um alveolär-ähnliche 14,15 (distale) Organoide oder Atemwege16 (proximale) Organoide herzustellen oder ventral-anteriore Vorderdarm-Sphäroide zu erzeugen, um menschliche Lungenorganoide herzustellen, die alveoläre Zell- und mesenchymale Marker und Knospenspitzen-Vorläuferorganoide exprimieren17 Die Stärke dieser Methode ist die Einbeziehung sowohl von Lungenepithel- als auch von mesenchymalen Zelltypen, um die Morphogenese, Reifung und Expansion der Lunge in vitro zu strukturieren und zu orchestrieren.
Dieses Protokoll verwendet kleine Moleküle und Wachstumsfaktoren, um die Differenzierung pluripotenter Stammzellen durch definitive Endoderm-, vordere Vorderdarm-Endoderm- und Lungenvorläuferzellen zu steuern. Diese Zellen werden dann durch wichtige Entwicklungsschritte, einschließlich Verzweigung und Reifung, in 3D-Ganze Lungenorganoide induziert. Die Zusammenfassung des Differenzierungsprotokolls ist in Abbildung 1a mit repräsentativen Hellfeldbildern der endodermalen und organoiden Differenzierung in Abbildung 1b dargestellt. Abbildung 1c,d zeigt die Genexpressionsdetails der endodermalen Differenzierung sowie die Genexpression sowohl der proximalen als auch der distalen Populationen von Lungenepithelzellen nach Abschluss der Differenzierung.

<table><tbody><tr><td>Cell Culture12-Well-Platten</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Einsätze, 0,4 μm, durchscheinend</td><td>VWR</td><td>10769-208</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B27 ohne Retinsäure</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA) Fraktion V, 7,5% ige Lösung</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCellTech</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082139</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologien</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Ham' s F12</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Modifizierter Dulbecco" s Medium (IMDM) + Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>31980030</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Ersatz (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycerol</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus Kit (10/Karton)</td><td>Stammzelle Tech</td><td>5825</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 + Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Gesteinsinhibitor)</td><td>R& D Systems</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td>Wachstumsfaktoren/Kleine Moleküle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>F& D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>All-trans-Retinsäure (RA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP/CF</td><td></td></tr><tr><td>Br-cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5386</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Abcam</td><td>ab120890</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>R& D Systems</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>F& T D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>F& Technik D Systems</td><td>345-FG/CF</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>F& T & T D Systems</td><td>251-KG/CF</td><td></td></tr><tr><td>IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>F& Forschung D Systems</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>VEGF/PIGF</td><td>F& Technik D Systems</td><td>297-VP/CF</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Primärantikörper</td><td></td><td></td><td>Verdünnungsrate</td></tr><tr><td>CXCR4-PE</td><td>R& D Systems</td><td>FAB170P</td><td>1:200 (F)</td></tr><tr><td>HOPX</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-398703</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>HTII-280</td><td>Terrace Biotech</td><td>TB-27AHT2-280</td><td>0.145833333</td></tr><tr><td>KRT5</td><td>Abcam</td><td>ab52635</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>NKX2-1</td><td>Abcam</td><td>ab76013</td><td>0.25</td></tr><tr><td>NKX2-1-APC</td><td>LS-BIO</td><td>LS-C264437</td><td>1:1000 (F)</td></tr><tr><td>proSPC</td><td>Abcam</td><td>ab40871</td><td>0,215277778</td></tr><tr><td>SCGB3A2</td><td>Abcam</td><td>ab181853</td><td>0,25</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-014</td><td>0,1805555556</td></tr><tr><td>SOX9</td><td>R& D Systems</td><td>AF3075</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>SPB (ausgereift)</td><td>7 Hills</td><td>48604</td><td>1: 1500 (F) 1:500 (W)a</td></tr><tr><td>SPC (ausgereift)</td><td>LS Bio</td><td>LS-B9161</td><td>1:100 (F); 1:500 (W) a</td></tr></tbody></table>

generierung von 3d-ganzlungenorganoiden aus induzierten pluripotenten stammzellen zur modellierung der lungenentwicklungsbiologie und -krankheit

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Die Entwicklung und Erkrankung der menschlichen Lunge war aufgrund des Mangels an biologisch relevanten In-vitro-Modellsystemen schwer zu untersuchen. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPS-Zellen) können schrittweise in mehrzellige 3D-Lungenorganoide differenziert werden, die sowohl aus epithelialen als auch aus mesenchymalen Zellpopulationen bestehen. Wir rekapitulieren embryonale Entwicklungssignale, indem wir zeitlich eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen einführen, um effizient definitive Endoderm-, anteriore Vorderdarm-Endoderm- und anschließend Lungen-Vorläuferzellen zu erzeugen. Diese Zellen werden dann in ein wachstumsfaktorreduziertes (GFR)-Basalmembranmatrixmedium eingebettet, so dass sie sich als Reaktion auf externe Wachstumsfaktoren spontan zu 3D-Lungenorganoiden entwickeln können. Diese ganzen Lungenorganoide (WLO) durchlaufen frühe Entwicklungsstadien der Lunge, einschließlich verzweigter Morphogenese und Reifung nach Exposition gegenüber Dexamethason, zyklischem AMP und Isobutylxanthin. WLOs besitzen Atemwegsepithelzellen, die die Marker KRT5 (basal), SCGB3A2 (Club) und MUC5AC (Kelch) exprimieren, sowie alveoläre Epithelzellen, die HOPX (alveolarer Typ I) und SP-C (alveolarer Typ II) exprimieren. Mesenchymalzellen sind ebenfalls vorhanden, einschließlich Aktin der glatten Muskulatur (SMA) und des von Thrombozyten abgeleiteten Wachstumsfaktorrezeptors A (PDGFRα). iPSC-abgeleitete WLOs können unter 3D-Kulturbedingungen für viele Monate aufbewahrt und nach Oberflächenmarkern sortiert werden, um eine bestimmte Zellpopulation zu reinigen. iPSC-abgeleitete WLOs können auch verwendet werden, um die menschliche Lungenentwicklung zu untersuchen, einschließlich der Signalübertragung zwischen dem Lungenepithel und dem Mesenchym, um genetische Mutationen auf die Funktion und Entwicklung menschlicher Lungenzellen zu modellieren und die Zytotoxizität von Infektionserregern zu bestimmen.

24 Stunden nach dem Plattieren, Tag 1, sollten iPS-Zellen 50% -90% konfluent sein. An Tag 2 sollte DE zu 90%-95% konfluent sein. Während der DE-Induktion ist es üblich, am Tag 4 einen signifikanten Zelltod zu beobachten, aber die angeschlossenen Zellen behalten eine kompakte Kopfsteinpflastermorphologie bei (Abbildung 2b). Brechen Sie die Differenzierung ab, wenn sich die Mehrheit der adhärenten Zellen löst, und erwägen Sie, die Exposition gegenüber DE-Medien mit Activin A um 6-12 h zu verkü...

Der Artikel beschreibt die schrittweise gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zu dreidimensionalen ganzen Lungenorganoiden, die sowohl proximale als auch distale epitheliale Lungenzellen zusammen mit Mesenchym enthalten.

Generierung von 3D-Ganzlungenorganoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen zur Modellierung der Lungenentwicklungsbiologie und -krankheit

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

Dieses Protokoll verwendet induzierte pluripotente Stammzellen, um sie in Lungenzellen zu differenzieren, um menschliche Lungenerkrankungen und -entwicklungen in einer Schale zu modellieren. Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es schwierig ist, primäres menschliches Lungengewebe zu erhalten und zu kultivieren. Der Hauptvorteil der Unterscheidung von Lungenzellen von pluripotenten Stammzellen besteht darin, eine konstante Versorgung mit spezifischen Lungenzellen zu haben, um die Entwicklung und Krankheit der menschlichen Lunge zu untersuchen.Diese Zellen können über lange Zeiträume in Zellkultur gehalten werden, können für zukünftige Anwendungen kryokonserviert werden und können genetisch manipuliert werden, um Genmutationen zu untersuchen. Das Verfahren wird Rachel McVicar, eine Doktorandin aus meinem Labor, demonstrieren. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, tauen Sie langsam ein Wachstumsfaktor-reduziertes oder GFR-Basalmembranmatrixmedium auf Eis auf und verdünnen Sie es in einem gleichen Volumen von kaltem DMEM F12.Legen Sie die P1000-Spitzen vor gebrauchsfertig in den Gefrierschrank, um sie zu kühlen. Als nächstes beschichten Sie jede Vertiefung einer 12-Well-Platte mit 500 Mikrolitern des 50% GFR-Basalmembranmatrixmediums und entfernen Sie überschüssige Mediumsmischungen und Blasen aus den Vertiefungen. Legen Sie die Brunnenplatten auf Nasseis oder einen Kühlschrank bei vier Grad Celsius, um sie für 20 Minuten einzustellen, und bewegen Sie die Platte dann über Nacht in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator.Wenn hohe PSEs 70% Konfluenz erreichen, fügen Sie 10 mikromolaren ROCK-Inhibitor Y27632 zu human induzierten pluripotenten Stammzellen hinzu und warten Sie eine Stunde vor der Dissoziation. Saugen Sie die Medien ab und waschen Sie die Zellen einmal mit PVS. Dissoziieren Sie IPSCs durch Zugabe von 500 Mikrolitern Zellablösungsmedium pro Vertiefung und inkubieren Sie für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator.Nach der Inkubation 500 Mikroliter Stammzell-Passaging-Medium pro Vertiefung hinzufügen. Pipettieren Sie zellen vorsichtig mit einer P1000-Spitze, um eine einzelne Zellsuspension zu erhalten. Dann übertragen Sie die dissoziierten Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 300 mal G.Nach der Zentrifugation saugen Sie das Medium ab und resuspenieren Sie das Zellpellet mit einem Milliliter mTeSR Plus-Medium, ergänzt mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren.Nachdem Sie die Zellen gezählt haben, fügen Sie zweimal 10 zu den fünften IPSCs zu jeder Vertiefung einer 12-Well-GFR-Medium-beschichteten Platte hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag aspirieren Sie das mTeSR Plus, bevor Sie definitive Endoderm- oder DE-Induktionsmedien hinzufügen. Wechseln Sie an den Tagen zwei und drei die DE-Induktionsmedien.Beginnen Sie am vierten Tag mit der AFE-Induktion, indem Sie DE-Induktionsmedien durch serumfreies Basalmedium ersetzen. Wechseln Sie das AFE-Medium drei Tage lang täglich, bevor Sie die AFE-Effizienz am Ende des sechsten Tages analysieren. Am siebten Tag das GFR-Basalmembran-Matrix-Medium auf Eis zur späteren Verwendung auftauen.Fahren Sie gleichzeitig mit der Differenzierung der Lungenvorläuferzellen fort, indem Sie die AFE-Medien ansaugen und die Vertiefungen mit PVS waschen. Einen Milliliter Zellablösung in den Brunnen geben und 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation einen Milliliter Abschreckmedium in die Wells geben, die Zellablösung enthalten.Halten Sie Zellen als Aggregate, indem Sie vorsichtig nach oben und unten pipettieren. Stellen Sie sicher, dass alle Zellen entfernt sind, aber um sie fünf Minuten lang in ein konisches 15-Milliliter-Rohr zur Zentrifugation bei 300 mal G zu übertragen. Entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in LPC-Induktionsmedien.Zählen Sie die Zellen und fügen Sie 2,5 mal 10 zu den fünften Zellen zu 100 Mikrolitern kaltem GFR-Basalmembranmatrixmedium hinzu und mischen Sie gut. Legen Sie einen Tropfen in einen Brunnen einer 12-Well-Platte und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter LPC-Medien pro Vertiefung hinzu, um sicherzustellen, dass der mittlere Tropfen vollständig eingetaucht ist und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert wird.Wechseln Sie am achten Tag das LPC-Medium, um den ROCK-Inhibitor Y27632 zu entfernen. Wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag und analysieren Sie die LPC-Effizienz am Ende von Tag 16. Waschen Sie am Tag 17 die Wells und fügen Sie 500 Mikroliter von zwei Mikrogramm pro Milliliter dispase hinzu.Die Dispase-Mischung mit einer P1000-Pipette pipettieren und 15 Minuten inkubieren, dann die Mischung pipettieren und weitere 15 Minuten inkubieren. Nach der Inkubation einen Milliliter des Abschreckmediums in die Dispaese geben, die Vertiefungen enthält, und die Zellen in konische Röhrchen überführen. Zentrifugieren und resuspenieren Sie das Pellet in einem Milliliter gekühltem PVS und wiederholen Sie dann die Zentrifugation.Dann resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Zellablösungsmedium. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 12 Minuten, fügen Sie dann eine gleiche Menge Abschreckmittel hinzu und zentrifugieren Sie erneut. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Abschreckmedium und 10 mikromolaren ROCK-Inhibitor Y27632.Führen Sie eine Zellzählung durch, um das Volumen zu berechnen, das benötigt wird, um acht mal 10 bis zur vierten Zelle pro Vertiefung zu erhalten. Dann benötigte aliquot Volumen von LPC-Zellaggregaten in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge für fünf Minuten bei 300 mal G.Entfernen Sie überschüssigen Überstand, ohne das Zellpellet zu rühren, und lassen Sie 10 Mikroliter Restmedien zurück. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 Mikroliter kaltes GFR-Basalmembranmatrixmedium und übertragen Sie die Zellen auf Zellkulturmembraneinsätze.Bei 37 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten inkubieren. Nach der Inkubation einen Milliliter 3D-Organoid-Induktionsmedium in die basolaterale Kammer des Einsatzes geben und sechs Tage lang jeden zweiten Tag durch frisches Medium ersetzen. Schalten Sie am 23. Tag das Medium auf das 3D-Verzweigungsmedium um und wechseln Sie dann sechs Tage lang jeden zweiten Tag das Medium.Wechseln Sie am 29. Tag zum 3D-Reifungsmedium und ersetzen Sie das Medium in den nächsten sechs Tagen jeden zweiten Tag. Am vierten Tag der DE-Induktion zeigen die angeschlossenen Zellen eine kompakte Kopfsteinpflastermorphologie. Die definitiven Endodermmarker CXCR4 und SOX17, die mit Kernen überlagert waren, wurden exprimiert, was die endodermale Differenzierung bestätigte.Die vordere Vorderdarminduktion wurde am siebten Tag bestätigt, wobei die Morphologie enger verdichtete Zellen zeigte und die Marker FOXA2 und SOX2 mit Kernen überlagert waren. Die Erzeugung von 3D-Lungenvorläuferzellen wurde mit 3D-Sphäroiden und der endogenen Expression von NKX2-1 GFP in einer Reporterzelllinie bestätigt. Nach einer dreiwöchigen Differenzierung in ganze Lungenorganoide wurden die Lungenmarker immunzytochemisch analysiert.Marker für die verzweigte Morphogenese SOX2 und SOX9, die von Kernen überlagert werden, wurden in den Organoiden beobachtet. Die proximalen Lungenmarker P63 und KRT5, beides Marker von Basalzellen, wurden zusammen mit SCGB3A2, einem Marker für Clubzellen, erfolgreich nachgewiesen. Distale Lungenmarker induzierten Pro SPC- und SPB-Marker für alveoläre Typ-II-Zellen.Und HOPX-Marker von alveolären Typ-I-Zellen. Zusätzlich wurden NKX2-1 und ZO1 mit Kernen überlagert exprimiert. Die Mesenchyme-Lungenzellmarker PGFR Alpha, ein Marker für Fibroblasten, koexprimiert mit SOX9, repräsentierten distales Mesenchym.Vimentin wurde ebenfalls exprimiert und in der Lunge verteilt. Nach diesem Verfahren können die Lungenorganoide mit induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Endothel- und Immunzellen investiert werden. Lungenentwicklung und -erkrankung erfolgt durch eine Signalübertragung zwischen den epithelialen und mesenchymalen Zellpopulationen, aber auch von Endothelzellen und Makrophagen.Ein 3D-Lungengewebemodellsystem ist klinisch relevant für die Untersuchung menschlicher Krankheiten und Therapeutika.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Protokoll leitet effizient embryonalen Maus-Stammzellen abgeleiteten endgültigen Endoderm Epithelzellen der Atemwege zu reifen. Diese Differenzierung Technik verwendet 3-dimensional dezellularisierte Lungengerüste Lungen lineage Spezifikation, in einem definierten, serumfreien Kultureinstellung zu lenken.

Die Erzeugung von ESC-derived Maus Airway epithelialen Zellen unter Verwendung von Dezellularisierte Lung Scaffolds

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Vorbereitung der Agarose-gefüllte menschlichen präzise geschliffenen Lunge Scheiben aus resezierten Patienten Gewebe, die für die Erzeugung von 3D Lunge Gewebekulturen, Modell menschlichen Lungenerkrankungen in biologischen und biomedizinischen Studien eignen.

Generation von menschlichen 3D Lungengewebe Kulturen (3D-LTCs) für Krankheit Modellierung

Dieses Protokoll ermöglicht die Differenzierung menschlicher pluripotenter Zellen in Darmorganoide. Das Protokoll ahmt die normale menschliche Entwicklung nach, indem es Zellen in eine Population von definitivem Endoderm, Hinterdarm-Endoderm und dann Darmepithel differenziert. Dadurch eignet sich das Protokoll sowohl für die Untersuchung der Darmentwicklung als auch für Anwendungen zur Modellierung von Krankheiten.

Generierung von hiPSC-abgeleiteten Darmorganoiden für Entwicklungs- und Krankheitsmodellierungsanwendungen

Dieser Artikel bietet eine detaillierte Methodik für Gewebedissoziation und zelluläre Fraktionierungsansätze, die die Anreicherung lebensfähiger Epithelzellen aus proximalen und distalen Regionen der menschlichen Lunge ermöglichen. Hierin werden diese Ansätze für die funktionelle Analyse von Lungenepithel-Vorläuferzellen durch den Einsatz von 3D-Organoid-Kulturmodellen angewendet.

Isolierung und Anreicherung menschlicher Lungenepithel-Vorläuferzellen für Organoidkulturen

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur effizienten Herstellung entwicklungsrelevanter menschlicher Herzorganoide (hHOs) unter Verwendung menschlicher pluripotenter Stammzellen durch Selbstorganisation. Das Protokoll beruht auf der sequentiellen Aktivierung von Entwicklungshinweisen und produziert hochkomplexes, funktionell relevantes menschliches Herzgewebe.

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Das Protokoll stellt eine Methode vor, um menschliche Lungenorganoide aus primärem Lungengewebe abzuleiten, die Lungenorganoide zu erweitern und eine proximale Differenzierung zu induzieren, um 3D- und 2D-Atemwegsorganoide zu erzeugen, die das menschliche Atemwegsepithel originalgetreu phänokopieren.

Etablierung menschlicher Lungenorganoide und proximale Differenzierung zur Erzeugung reifer Atemwegsorganoide

Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte zur Erzeugung und Charakterisierung von murinen oral-ösophagealen 3D-Organoiden, die normale, präneoplastische und Plattenepithelkarzinomläsionen darstellen, die durch chemische Karzinogenese induziert werden.

Modellierung des oral-ösophagealen Plattenepithelkarzinoms in 3D-Organoiden

Dieses Protokoll stellt ein Verfahren zur Erzeugung von Gefäßorganoiden unter Verwendung menschlicher pluripotenter Stammzellen vor.

Generierung von Gefäßorganoiden aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die menschliche Erzeugung induzierten pluripotenten Stammzellen von Patienten stammenden Fibroblasten-ähnlichen Synoviozyten, ein lentiviraler System ohne Feeder-Zellen.

Die Erzeugung von Induced-pluripotenten Stammzellen Fibroblast-wie Synoviozyten Isoliert von Gelenken von Patienten mit rheumatoider Arthritis

Das Ziel dieses Protokolls ist es, das Protokoll für die Reprogrammierung von Melanomtumor-infiltrierenden Lymphozyten in induzierte pluripotente Stammzellen zu zeigen.

Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Melanom-Tumor-infiltrierenden Lymphozyten

Erfahren Sie die Differenzierung von hiPSCs zu 3D-Lungenorganoiden. Diese Methode ermöglicht die Modellierung menschlicher Lungenentwicklung und Krankheiten in vitro mit epithelialen und mesenchymalen Zellpopulationen.

Generierung von 3D-Ganzlungenorganoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen zur Modellierung der Lungenentwicklungsbiologie und -krankheit (Video) | JoVE Journal

Generierung von 3D-Ganzlungenorganoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen zur Modellierung der Lungenentwicklungsbiologie und -krankheit

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