Name: Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Erfahren Sie die Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Analyse der Arteriogenese durch Tracking von Leukozytenadhärenz und -extravasation in murinen Kollateralarterien. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Echtzeit-Visualisierung mit geringer Phototoxizität.

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Die Studie wurde vom SFB 914 der Deutschen Forschungsgemeinschaft gefördert (HI-A/SM, Projekt Z01). Wir danken Dr. Susanne Stutte für die Lektüre des Manuskripts.

Diese Studie wurde vom Bayerischen Tierschutzausschuss genehmigt (genehmigt durch den Ethikkodex: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); Diese Versuche wurden unter strikter Einhaltung der deutschen tierrechtlichen Richtlinien durchgeführt.
1. Tiere und Ligatur der Oberschenkelarterie (FAL)
HINWEIS: Um eine sterile Entzündung und Arteriogenese zu induzieren, wurden 8-10 Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse verwendet. Keine der Mäuse starb oder litt an einer Wundinfektion oder Wundheilungsstörung während bzw. nach einer FAL- bzw. Scheinoperation.
<ol><li>Anästhesie HINWEIS: Vor der Injektion der MMF-Mix-Anästhesie wird empfohlen, zunächst mit 5% Isofluran zu betäuben, bis die Maus schläft.<ol><li>Wiegen Sie die Maus und bereiten Sie eine MMF-Mischung mit einer Dosis von Midazolam 5,0 mg/kg, Medetomidin 0,5 mg/kg und Fentanyl 0,05 mg/kg zu.</li>
		<li>Füllen Sie eine 1 mL Spritze mit MMF-mix und injizieren Sie ein Endvolumen von 100 μL s.c. mit einer 30 G Nadel (nach Narkose mit 5% Isofluran).</li>
		<li>Legen Sie die Maus auf ein warmes Pad und warten Sie, bis die Maus vollständig betäubt ist. Stellen Sie den Timer auf 35 Minuten. Nach dieser Zeit wird s.c. die Hälfte der Dosis (50 μL) des MMF-Mixes injiziert.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Narkosetiefe, indem Sie die Pedal- und Interdigitalreflexe (durch festes Zehendrücken) der Maus testen. HINWEIS: Ein ausbleibendes Ansprechen deutet auf eine ausreichende Analgesietiefe hin.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligatur der Arteria femoralis (FAL) Anmerkungen: Verwenden Sie sterile chirurgische Instrumente und Nähte. Desinfizieren Sie die Haut vor dem Öffnen und nach dem Schließen mit Desinfektionsmittel.<ol><li>Legen Sie die betäubte Maus auf eine Heizplatte (35-37 °C), um die physiologische Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Tragen Sie Augencreme (Dexpanthenol) auf jedes Auge auf, um ein Austrocknen der Augen unter Narkose zu verhindern.</li>
		<li>Die anästhesierte Maus wird vor und nach der FAL in eine Laser-Doppler-Bildgebungskammer (LDI) gebracht, um den Blutfluss und die Perfusion zu überprüfen (Abbildung 1A-C).</li>
		<li>Entfernen Sie Haare, desinfizieren Sie die Haut und machen Sie einen Schnitt, um Zugang zur Oberschenkelarterie zu erhalten. Unter einem Operationsmikroskop ligieren Sie die rechte Oberschenkelarterie der Maushintergliedmaße mit einer geflochtenen Seidennaht (7-0) und führen Sie eine Scheinoperation an der linken Oberschenkelarterie durch, die als interne Kontrolle dient, wie zuvor beschrieben6 (Abbildung 1D-K). HINWEIS: Der Hautschnitt wurde mit einer kleinen Schere vorgenommen, um eine direkte Verletzung der hautnahen Blutgefäße zu vermeiden.</li>
		<li>Verschließen Sie die Haut mit einer geflochtenen Seidennaht (6-0). Verabreichen Sie Buprenorphin (0,1 mg/kg) s.c. alle 12 Stunden, beginnend 10 Minuten vor Beginn der Anästhesie zur Schmerzlinderung. Beobachten Sie das Tier 24 Stunden nach der Operation auf Schmerzsignale, d. h. verminderte Fellpflege, Bewegungsunlust oder gekrümmte Körperhaltung.</li>
		<li>Injizieren Sie (s.c.) eine Kombination aus Naloxon (1,2 mg/kg), Flumazenil (0,5 mg/kg) und Atipamezol (2,5 mg/kg), um die Anästhesie nach Abschluss der FAL und Verschluss der Haut zu antagonisieren.</li>
		<li>Halten Sie die Maus nach der Operation auf dem warmen Pad und überwachen Sie das Tier kontinuierlich, bis es eine aufrechte Haltung einnehmen und normal um den Käfig herumlaufen kann.</li>
		<li>Wenn die Maus vollständig wach ist, setzen Sie sie zusammen mit den anderen Mäusen wieder in den Käfig und bringen Sie den Käfig in den Stallraum zurück.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Gewebepräparation für die Multiphotonen-Intravital-Bildgebung
<ol><li>Injektion der Schwanzvene HINWEIS: Das Tier muss unter Narkose stehen, bevor es mit der Vorbereitung für die intravitale Bildgebung beginnt. Vor dem Einführen der Nadel des Venenkatheters wird empfohlen, ein Hautdesinfektionsmittel auf den Schwanz aufzutragen. Dies hilft auch bei der Visualisierung der Gefäße.<ol><li>Bereiten Sie einen Schwanzvenen-Injektionskatheter mit einer 2 x 30 G-Nadel, 10 cm einem Polyethylenschlauch mit feinem Durchmesser (0,28 mm Innendurchmesser und 0,61 mm Außendurchmesser), einer 1-ml-Spritze und einem Histoacrylkleber vor, um den Katheter am Mausschwanz für weitere intravenöse Injektionen während der Bildgebung zu fixieren (Abbildung 2A, B und Abbildung 2F).</li>
		<li>Bereiten Sie die Antikörperlösung für die intravenöse Injektion vor: CD45-PE und CD41-FITC (20 μg/Maus) mit einem Endvolumen von 100 μl.</li>
		<li>Überprüfen Sie den Schwanz auf die seitlich gelegenen Schwanzadern und stauen Sie die Vene, um die Schwanzvene zu identifizieren. Desinfizieren Sie den Schwanz, führen Sie den Venenkatheter ein und fixieren Sie ihn mit Gewebehistoacrylkleber (Abbildung 2B).</li>
		<li>Injizieren Sie die Antikörper vor der Bildgebung (mindestens 15 Minuten vorher) und nach Abschluss der Gewebepräparation.</li>
	</ol></li>
	<li>Gewebevorbereitung Anmerkungen: Verwenden Sie immer ein warmes Pad und verabreichen Sie vor der Gewebevorbereitung einen Tropfen Augencreme (Dexpanthenol) in jedes Auge. Verwenden Sie sterile chirurgische Instrumente und Nähte. Desinfizieren Sie die Haut vor dem Öffnen und nach dem Schließen mit Desinfektionsmittel.<ol><li>Legen Sie die betäubte Maus auf eine stabile und tragbare Unterlage. Fixieren Sie die Maus in Rückenlage mit einer 4-Punkt-Fixierung auf dem Pad mit Klebeband (Abbildung 2B).</li>
		<li>Formen Sie zwei Stücke Modelliermasse und legen Sie die Stücke unter das obere Hinterbein der Maus, um eine ebene Position des Adduktorenmuskels zu gewährleisten (Abbildung 2B, gekennzeichnet durch rote Pfeile).</li>
		<li>Um eine stabile Körpertemperatur von 37 °C der Maus zu gewährleisten, legen Sie das Pad mit der Maus auf eine Heizplatte unter einem Operationsmikroskop mit einem 0,64-4,0-fachen Zoom (Abbildung 1L).</li>
		<li>Entfernen Sie die Haare von beiden Beinen, desinfizieren Sie die Haut und schneiden Sie die Haut kreisförmig um die Narbe der früheren Oberschenkelarterie der rechten Hintergliedmaße (Abbildung 1M).</li>
		<li>Entfernen Sie die Haut- und Fettschicht von der Oberseite des Beins (Abbildung 1N,O) und ziehen Sie die restliche Haut mit Nähten beiseite, um eine Tasche um den Adduktorenmuskel zu schaffen (Abbildung 1P, Q).</li>
		<li>Entfernen Sie subkutanes Fett, um eine klare Sicht auf den Adduktorenmuskel und die Arterie/Vene tiefgründig sowie die Kollateralgefäße zu erhalten (Abbildung 1Q,R).</li>
		<li>Beginnen Sie vorsichtig mit der Entfernung der oberflächlichen Muskelschicht auf den Kollateralgefäßen, indem Sie sie vorsichtig mit einer feinen Pinzette präparieren (Abbildung 1R). HINWEIS: Die Arteria collateralis und die Vena collateralis sind deutlich sichtbar und bereit für die Bildgebung (Abbildung 1S).</li>
		<li>Füllen Sie die vorbereitete Tasche mit Kochsalzlösung, um ein Austrocknen des Gewebes zu vermeiden, und fahren Sie mit dem gleichen Verfahren für das scheinoperierte linke Hinterbein fort. Geben Sie vor der Bildgebung Ultraschallgel in beide Taschen, das ein Austrocknen verhindert und als Immersionsmedium für die optische Kopplung mit dem Objektiv dient (Abbildung 2C und Abbildung 2F).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Intravitale Multiphotonenmikroskopie
<ol><li>Präparat Anmerkungen: Bewahren Sie eine Spritze mit Ultraschallgel in der Inkubatorkammer des Mikroskops auf, um eine warme Temperatur zum Auffüllen der Taschen während der Langzeitbildgebung aufrechtzuerhalten.<ol><li>Entfernen Sie die Kochsalzlösung aus den beiden vorbereiteten Taschen und ersetzen Sie sie durch Ultraschallgel, um die Kollateralgefäße abzudecken (Abbildung 2C).</li>
		<li>Injizieren Sie die Antikörperlösung durch den Schwanzvenenkatheter. 15 min nach der Antikörperinjektion wird das Pad mit der fixierten Maus in die erwärmte Multiphotonen-Bildgebungskammer übertragen (Abbildung 2F).</li>
		<li>Nach Abschluss der Bildaufnahme wird die Maus durch zervikale Luxation unter tiefer Narkose eingeschläfert.</li>
	</ol></li>
	<li>Multiphotonenmikroskopische Bildaufnahme Anmerkungen: Schalten Sie das Mikroskop 30 Minuten vor der Bildgebung ein, um eine Laserstabilisierung zu ermöglichen. Für die beste optische Stabilität des Mikroskops empfiehlt es sich, die Mikroskopkammer dauerhaft beheizt zu halten.<ol><li>Schalten Sie den Schlüssel der Ti:Sapphire-Laserbox, der elektronischen Schnittstellenboxen, der Heizeinheit der Inkubationskammer, der Leuchtstofflampe und des Computers ein (Abbildung 2D, E).</li>
		<li>Starten Sie die Erfassungssoftware (Inspector-Software). Stellen Sie die Wellenlänge auf 800 nm ein und öffnen Sie den Mikroskopverschluss (Abbildung 3A ii).</li>
		<li>Wählen Sie im Dialogfeld Messassistent den Gerätemodus (Einzelstrahl) und im Messmodus (3D-Scan-Zeitraffer) (Abbildung 3A i).</li>
		<li>Übertragen Sie die anästhesierte Maus in die vorgewärmte Inkubationskammer des Mikroskops. Positionieren Sie den Bereich mit dem Ultraschallgel (Schritt 2.2.8) direkt in Kontakt mit der Objektiv-Frontlinse (Abbildung 2F).</li>
		<li>Öffnen Sie den Verschluss des Epifluoreszenzmikroskops und wählen Sie eine geeignete Filter-/dichroitische Einstellung für die FITC-Visualisierung (4), um den interessierenden Bereich zu finden, indem Sie den Blutfluss unter Epifluoreszenzbeleuchtung verfolgen. Nachdem Sie den interessierenden Bereich in das mittlere Sichtfeld gebracht haben, schließen Sie den Verschluss des Epifluoreszenzmikroskops.</li>
		<li>Stellen Sie im xy-Scanner-Dialog die folgenden Parameter ein: Bildgröße (554x554), Pixel (512x512), Frequenz (400), Zeilendurchschnitt (1) (Abbildung 3A iii). Stellen Sie die Laserleistung (5 %) ein (Abbildung 3A iv) und stellen Sie die Verstärkung des Photomultipliers (PMT) für die Kanäle Grün (66), Rot (66) und Blau (63) ein (Abbildung 3A v).</li>
		<li>Wählen Sie ein geeignetes Objektiv für die intravitale Bildgebung und die Einstellungen für die Driftkorrektur (siehe Details in 3.2.11). HINWEIS: Hier wurde das Nikon LWD 16x als Objektiv ausgewählt (Abbildung 3A vi).</li>
		<li>Definieren Sie den Bildstapelbereich, indem Sie den Vorschauerfassungsmodus starten , indem Sie auf die rote Schaltfläche in der oberen rechten Ecke des Dialogfensters des Messassistenten klicken (Abbildung 3A i).</li>
		<li>Definieren Sie den Bereich und die Struktur des Interesses, indem Sie fokussieren, um ein gutes Bild zu erhalten. Ändern Sie dann während der Beobachtung des Bildschirms den Fokus, indem Sie das Objektiv nach oben bewegen, bis das Bild verschwindet, und stellen Sie es auf Null (first= 0). Ändern Sie den Fokus in die entgegengesetzte Richtung, indem Sie das Objektiv nach unten bewegen, bis das Bild wieder vom Bildschirm verschwindet, und stellen Sie es als letzte (Ende = 40 μm) Position in axialer Richtung ein (Abbildung 3A vii).</li>
		<li>Stellen Sie die Schrittweite auf 2 μm ein. Klicken Sie auf die rote Schaltfläche in der oberen rechten Ecke des Dialogfelds Messassistent , um den Vorschau-Scan zu stoppen. HINWEIS: Die Anzahl der Bilder wird automatisch berechnet und eingestellt (21 Bilder), wie in Abbildung 3A vii angegeben.</li>
		<li>Wenn das Mikroskop mit der Live-Drift-Korrektur9 ausgestattet ist, starten Sie die Driftkorrektur-Software (z. B. VivoFollow) und befolgen Sie die unten beschriebenen Schritte.<ol><li>Wählen Sie im Dialogfeld Mess-Assistent die Python-Achse (Python Ax) (Abbildung 3A viii) als erstes Achsengerät aus. Aktivieren Sie NICHT den automatischen Speichermodus. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Automatisches Speichern (AS) nur auf der Zeitachse (Zeitzeit). Klicken Sie auf das Python-Symbol im Fenster "Verfügbare Geräte" (Abbildung 3A ix), um das Python-Dialogfenster zu öffnen. </li>
			<li>Geben Sie im Python-Dialogfeld Achseneinstellungen von (0 null) und bis (-40) ein. Geben Sie die Anzahl der Schritte (21) ein, wie in Abbildung 3A x dargestellt.</li>
			<li>Rufen Sie das Dialogfenster xyz Stage Z auf und vergrößern Sie den Scanbereich an beiden Enden um 200 μm: Geben Sie in Start (200 μm) und in Ende (-240 μm) ein, der Bereich wird automatisch eingestellt (-440 μm). Behalten Sie die Schrittweite (2 μm) wie in Abbildung 3A xi gezeigt bei.</li>
			<li>Öffnen Sie das Dialogfeld " VivoFollow-Frontend " und klicken Sie auf das Feld "Bewegungsprofil " (Abbildung 3A xii).</li>
			<li>Starten Sie die Bildaufnahme, indem Sie auf die grüne Pfeilspitze in der oberen linken Ecke des Dialogfelds Messassistent der Inspektor-Software drücken (Abbildung 3A i).</li>
			<li>Wenn die Live-Drift-Korrektur verwendet wird, suchen Sie nach einem Dialogfeld, in dem die Konfiguration der Driftkorrektur angezeigt wird, wie in Abbildung 3A xiii gezeigt. Legen Sie den Erfassungskanal fest, der als unbewegliche Orientierungspunktreferenz verwendet werden soll (wählen Sie für dieses Protokoll Kanal 2, in dem das vaskuläre Tracersignal aufgezeichnet werden soll). Geben Sie den maximalen Korrekturversatz in μm ein, der an der ersten und letzten z-Position (hier 200 μm) addiert wurde, und klicken Sie auf OK.</li>
			<li>Überwachen Sie den aktuellen Drift-Offset in x, y und z in Echtzeit während der Bildaufnahme im VivoFollow-Frontdialogfenster Abbildung 3A xiv.</li>
			<li>Beenden Sie die Bildaufnahme nach ~35 Minuten, wenn ein weiterer Zyklus der Anästhesie-Reinjektion erforderlich ist. Injizieren Sie eine halbe Dosis des MMF-Mixes (50 μl s.c.) und starten Sie die Bildaufnahme erneut, indem Sie erneut auf die grüne Pfeilspitze drücken (Schritt 3.2.11.5).</li>
			<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das Experiment beendet ist.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. The top 10 causes of death. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death</a> (2020).</li>
<li>Deindl, E., Schaper, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+of+arteriogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The art of arteriogenesis.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 43 (1), 1-15 (2005).</li>
<li>Lasch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+RNA+released+due+to+shear+stress+controls+natural+bypass+growth+by+mediating+mechanotransduction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice.</a> Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).</li>
<li>Kumaraswami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+effective+flow+Ccytometry-based+method+for+identification+and+quantification+of+tissue+infiltrated+leukocyte+subpopulations+in+a+mouse+model+of+peripheral+arterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593(2020).</li>
<li>Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+acute+and+subacute+murine+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166(2016).</li>
<li>Limbourg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+postnatal+arteriogenesis+and+angiogenesis+in+a+mouse+model+of+hind-limb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1737(2009).</li>
<li>Wagner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+monocyte+homing+and+tumor-related+angiogenesis+in+a+murine+model+of+peripheral+arterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290(2017).</li>
<li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP%2C+FLIP%2C+FLAP%2C+FRET+and+FLIM%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li>
<li>Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+tissue+offset+correction+system+for+intravital+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy.</a> Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).</li>
<li>Chandraratne, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+platelet+glycoprotein+ibalpha+in+arterial+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Die beschriebene Methode der Multiphotonen-in-vivo-Analyse der Leukozytenrekrutierung stellt eine Ergänzung zu den üblicherweise verwendeten Werkzeugen für Leukozytenrekrutierungsstudien wie (immun-)histologische oder FACS-Analysen dar. Mit diesem bildgebenden Verfahren ist es möglich, die dynamischen Prozesse der Leukozytenadhärenz und -extravasation während der Arteriogenese detaillierter darzustellen10. Trotz des Mehrwerts dieser Methode enthält das angebotene Protokoll einige kritisch...

Trotz intensivem Forschungsinteresse in den letzten Jahren sind Herz-Kreislauf-Erkrankungen, z. B. ischämische Herzkrankheit und Schlaganfall, nach wie vor die weltweit häufigste Todesursache1. Gegenwärtig werden diese Erkrankungen mit hochinvasiven Therapien wie der perkutanen transluminalen Angioplastie, der perkutanen transluminalen Koronarangioplastie oder der Bypass-Operationbehandelt 2. Daher ist die Entwicklung alternativer, nicht-invasiver Therapieoptionen dringend erforderlich. Der Körper kann natürliche Bypässe um ein verstumpftes oder verschlossenes Gefäß herum anlegen, um den unterbrochenen Blutfluss in den distalen Teil der Stenose umzuleiten. Dieser Prozess wird als Arteriogenese2 bezeichnet. Viele neuere Studien haben gezeigt, dass eine erhöhte Flüssigkeitsscherung die Rekrutierung von Leukozyten beeinflusst, die eine wichtige Rolle bei der Arteriogenesespielt 3. Die wichtigsten aktuellen Optionen zur Analyse der Rekrutierung von Leukozyten während der Arteriogenese sind ex vivo (immun-)histologische Analysen oder die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)4. Um die Leukozytendynamik während der Arteriogenese beurteilen zu können, wird in dieser Arbeit ein intravitales Bildgebungsprotokoll mit Multiphotonenmikroskopie vorgestellt.
Leukozyten sind die wichtigsten Blutzellen, die während des Prozesses der Arteriogenese rekrutiertwerden 3. Dieses Protokoll verwendet Multiphotonen-Bildgebung, um das Kriechen von adhärenten Leukozyten, die mit injizierten Anti-CD45-PE-Antikörpern markiert waren, in Kollateralarterien 24 h nach der Induktion der Arteriogenese durch Femoralarterienligatur (FAL) unter Verwendung eines murinen Hintergliedmaßen-Ischämiemodells zu zeigen 5,6. Alternativ können Immunzellen ex vivo markiert und Mäusen schonend injiziert werden, wie Studien zur Angiogenese mittels Intravitalmikroskopiegezeigt haben 7. Der Blutfluss in Gefäßen und Arterien kann durch CD41-FITC (zur Markierung von Blutplättchen), Dextran-FITC (Plasma) oder durch die zweite harmonische Generation (SHG) visualisiert werden, die Kollagen Typ 1 in der Basalmembran eines Teils des Gefäßbaums sichtbar macht. SHG ist ein einzigartiger freier Markierungseffekt der Multiphotonenanregung. Die Multiphotonen-Bildgebung ermöglicht eine langfristige Zellverfolgung, ohne das Gewebe zu schädigen und die Zellen durch Anregung mit Laserleistung zu aktivieren. Die Multiphotonenmikroskopie ist die Bildgebungsmethode der Wahl für die Visualisierung fluoreszenzmarkierter Zellen und Strukturen in lebenden Tieren, da sie die Fluorophore mit minimaler Phototoxizität tiefer in das Gewebe/die Organe anregen kann8.
Die Verwendung von abgestimmten Infrarotlasern mit Pulsen, die in Femtosekundenintervallen abgegeben werden, regt das Fluorochrom nur in der Brennebene an, ohne Anregung oberhalb und unterhalb der Brennebene8. Somit ermöglicht die Multiphotonenmikroskopie eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung, weniger Lichtschäden und eine erhöhte Gewebedurchdringungsbildgebung zur Untersuchung dynamischer biologischer Ereignisse in den Organen. Es ist ein ideales Mikroskopiewerkzeug für die Bildgebung lebender Tiere. Multiphotonen und jede andere Kunst der intravitalen Mikroskopie sind jedoch durch Gewebebewegungen aufgrund von Herzschlag, Atmung, peristaltischen Bewegungen, Muskeltonalität und anderen physiologischen Funktionen begrenzt, was die Bildaufnahme und -analyse stört. Da diese Bewegungen die zeitliche und räumliche Auflösung beeinträchtigen und manchmal sogar eine nachträgliche Analyse verhindern, müssen sie angemessen berücksichtigt werden, um eine genaue Datenanalyse und -interpretation zu ermöglichen. Es wurden verschiedene Strategien entwickelt, um Artefakte durch Gewebebewegungen zu verringern oder zu verhindern. Dieses Protokoll wendet eine In-situ-Driftkorrektursoftware namens VivoFollow9 an, um die Gewebedrift während der Bildaufnahme zu korrigieren. Dieser Ansatz bietet die erforderliche Bildstabilisierung und ermöglicht eine Langzeitbildgebung und Zellverfolgungsanalyse.

<table><tbody><tr><td>1,0 mL</td><td>Spritze BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>309628</td><td>Spritze zur Injektion</td></tr><tr><td>3M Durapore Surgical Tape 1538-0</td><td>3M, St. Paul, MN, USA</td><td>1538-0</td><td>Fixierband</td></tr><tr><td>Atipamezole</td><td>Zoetis, Berlin, Deutschland</td><td></td><td>antagonisieren Anästhesie</td></tr><tr><td>Buprenorphin</td><td>Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK</td><td></td><td>antagonisieren Anästhesie</td></tr><tr><td>C57/B6J Maus</td><td>Charles River, Sulzfeld, Deutschland</td><td></td><td>Verwendete Tiere für die Chirurgie/Bildgebung</td></tr><tr><td>CD41-FITC ab</td><td>Biolegend</td><td>133904</td><td>Thrombozytenmarkierung in vivo</td></tr><tr><td>CD45-PE ab</td><td>Biolegend</td><td>368510</td><td>Leukozytenmarkierung in vivo</td></tr><tr><td>Desinfektionsmittel Cutasept</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland</td><td>AK64.2</td><td>Desinfektion</td></tr><tr><td>Augencreme (Bepanthen)</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>5g</td><td></td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>CuraMED Pharma, Karlsruhe, Deutschland</td><td></td><td>Anästhesie</td></tr><tr><td>Flumazenile</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland</td><td></td><td>antagonisieren Anästhesie</td></tr><tr><td>Feinbohrer Polyethylenschlauch</td><td>Smiths medical</td><td>Lot 278316</td><td>0,28 mm ID und 0,61 mm AD, Schlauch für den Venenkatheter</td></tr><tr><td>Histoacryl flexibel</td><td>BRAUM</td><td>1050052</td><td>Gewebekleber</td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Oxford Instruments</td><td>Version 9.2</td><td>Wird für Zellverfolgung, Zellgeschwindigkeitsanalyse, 3D-Projektion</td></tr><tr><td>Laserdoppler Bildgebungsinstrument</td><td>Moor LDI 5061 und Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEICA KL300 LED</td><td>Leica, Solms, Deutschland</td><td></td><td>Licht für Mikroskop</td></tr><tr><td>Leica M60</td><td>Leica, Solms, Deutschland</td><td></td><td>Mikroskop für die Chirurgie</td></tr><tr><td>LEICA MC120 HD</td><td>Leica, Solms, Deutschland</td><td></td><td>Kamera für Mikroskop</td></tr><tr><td>Medetomidin</td><td>Pfizer Pharma, Berlin, Deutschland</td><td></td><td>Anästhesie</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Ratiopharm GmbH, Ulm, Deutschland</td><td></td><td>Anästhesie</td></tr><tr><td>Multiphotonenmikroskop Lavision</td><td></td><td>TRIMScope II</td><td>WL 820 nm</td></tr><tr><td>NaCl 0,9%</td><td>Braun, Melsungen, Deutschland</td><td>3570310</td><td>Kochsalzlösung für die Tasche</td></tr><tr><td>Naloxone</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland</td><td></td><td>antagonisieren Anästhesienadel</td></tr><tr><td>30 G</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>305128</td><td>Nadel für i.v. Katheter</td></tr><tr><td>Seidengeflochtene Naht (7-0)</td><td>Pearsalls Ltd., Taunton, UK</td><td>SUT-S&nbsp; 103</td><td>Naht für die Ligatur der Oberschenkelarterie</td></tr><tr><td>Ultrason Gel</td><td>SONOSID-ASID BONZ 250 mL</td><td>782012</td><td>Gel für die Bildgebung</td></tr><tr><td>Vicryl 6.0 Naht</td><td>Vicryl, Johnson& Johnson, New Brunswick, NJ, USA</td><td>NW-2347</td><td>Naht zur Herstellung einer</td></tr><tr><td>VivoFollow-Driftkorrektursoftware</td> in der Tasche <td>Entwickelt von Mykhailo Vladymyrov</td><td></td><td>Referenz 9</td></tr></tbody></table>

multiphotonen-intravital-bildgebung zur Überwachung der leukozytenrekrutierung während der arteriogenese in einem murinen hintergliedmaßenmodell

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

Die Arteriogenese hängt stark von der Rekrutierung von Leukozyten und Thrombozyten in den perivaskulären Raum wachsender Kollateralgefäße ab. Der Standardansatz für die Analyse von Kollateralarterien und Leukozyten in der Arteriogenese ist die ex vivo (immun-)histologische Methodik. Diese Technik erlaubt jedoch nicht die Messung dynamischer Prozesse wie Blutfluss, Scherspannung, Zell-Zell-Wechselwirkungen und Partikelgeschwindigkeit. In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Überwachung von In-vivo-Prozessen in wachsenden Kollateralarterien während der Arteriogenese unter Verwendung intravitaler Bildgebung vorgestellt. Die hier beschriebene Methode ist ein zuverlässiges Werkzeug zur Dynamikmessung und bietet eine kontrastreiche Analyse mit minimaler Photozytotoxizität, die durch Multiphotonen-Anregungsmikroskopie ermöglicht wird. Vor der Analyse wachsender Kollateralarterien wurde die Arteriogenese im Adduktorenmuskel von Mäusen durch einseitige Ligatur der Oberschenkelarterie induziert.
Nach der Ligatur begannen die bereits vorhandenen Kollateralarterien aufgrund der erhöhten Scherspannung zu wachsen. Vierundzwanzig Stunden nach der Operation wurden die Haut und das Unterhautfett über den Seitenarterien entfernt, wodurch eine Tasche für weitere Analysen entstand. Um den Blutfluss und die Immunzellen während der In-vivo-Bildgebung sichtbar zu machen, wurden CD41-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) (Thrombozyten) und CD45-Phycoerythrin (PE) (Leukozyten) Antikörper intravenös (i.v.) über einen Katheter injiziert, der in die Schwanzvene einer Maus gelegt wird. In diesem Artikel wird die intravitale Multiphotonenbildgebung als Alternative oder in vivo Ergänzung zu den häufig verwendeten statischen ex vivo (immun-) histologischen Analysen zur Untersuchung von Prozessen vorgestellt, die für die Arteriogenese relevant sind. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit eine neuartige und dynamische in vivo Methode zur Untersuchung des Immunzelltransports, des Blutflusses und der Scherbelastung in einem Hintergliedmaßenmodell der Arteriogenese, was die Evaluierungsmöglichkeiten erheblich verbessert.

Die Multiphotonenmikroskopie bietet eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung für das Leukozyten-Tracking, wobei Zellmigrationsschritte und -geschwindigkeiten verfolgt und überwacht werden können (Abbildung 4A,B). Die physiologische Bewegung der Probe stellt jedoch eine Herausforderung dar, insbesondere für Langzeitaufnahmen in der Intravitalmikroskopie. Daher sind eine gute Gewebepräparation und Halterungen zur Fixierung des Gewebes sowie Werkzeuge, wie z. B. die Echtzeit...

Die Rekrutierung von Leukozyten und Blutplättchen stellt eine wesentliche Komponente dar, die für das effektive Wachstum von Kollateralarterien während der Arteriogenese notwendig ist. Die Multiphotonenmikroskopie ist ein effizientes Werkzeug zur Verfolgung der Zelldynamik mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in vivo und geringerer Phototoxizität, um die Rekrutierung und Extravasation von Leukozyten während der Arteriogenese zu untersuchen.

Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

Unser Protokoll ermöglicht es Forschern, den Prozess der Arteriogenese in vivo zu analysieren, indem sie die Adhärenz und Extravasation von Immunzellen in wachsenden Kollateralarterien in Echtzeit verfolgen. Die Multiphotonenmikroskopie-Technik ermöglicht die Visualisierung der Zelldynamik im tiefen Gewebe lebender Mausmodelle mit geringer Phototoxizität und hoher räumlich-zeitlicher Auflösung. Das mikroskopische Verfahren wird von Dominic van den Heuvel, einem technischen Assistenten der Multiphotonen-Bildgebungsplattform aus dem Labor von Dr. Helen Ishikawa-Ankerhold, demonstriert.Ich werde den chirurgischen Eingriff demonstrieren. Legen Sie die betäubte Maus zunächst in Rückenlage. Legen Sie dann zwei Stücke geformten Ton unter die obere Hintergliedmaße der Maus, um eine ebene Position des Adduktorenmuskels zu gewährleisten.Legen Sie die Maus unter das Stereomikroskop. Nachdem Sie die Haare von beiden Beinen entfernt haben, desinfizieren und schneiden Sie die Haut kreisförmig um die Narbe der früheren Oberschenkelarterie der rechten Hintergliedmaße. Entfernen Sie die Haut- und Fettschicht von der Oberseite des Beins und ziehen Sie die restliche Haut mit Nähten beiseite, um eine

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JoVE Journal

Medicine

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Hier beschreiben wir eine nicht-invasive Zwei-Photonen (2P)-Mikroskopie Ansatz zur Untersuchung Leukozyten homing in der Maus Fußballen. Wir besprechen die technischen Aspekte unserer Tissue Imaging Vorbereitung und gehen den Leser durch ein typisches Experiment von der ersten bis zur Ausführung und Datensammlung eingestellt.

Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo</em

Wir beschreiben ein Protokoll von Hellfeld Intravitalmikroskopie zur Messung dynamischer Neutrophilen-Endothel-Zell-Interaktionen während der neutrophilen Granulozyten Rekrutierung in Reaktion auf die Quelle eines neutrophilen Lockstoff in vivo. Neutrophile intraluminale Krabbeln, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Maus cremaster Muskelgewebe visualisiert mit Zeitraffer-Video Fotografie und verfolgt mit ImageJ.

Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie

Jüngste Fortschritte in der 2-Photonen-Mikroskopie sind in Echtzeit...

Bildgebung des dem Maus-Kniekehlen-Lymphknoten

Hier berichten wir über eine experimentelle Technik der Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündungen und Thrombusbildung in lebenden Mäusen sichtbar zu machen. Diese mikroskopische Technik wird wertvoll sein, um die molekularen Mechanismen der vaskulären Erkrankungen zu studieren und pharmakologische Mittel unter pathophysiologischen Bedingungen zu testen.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Kombinatorische 5 fluoreszierenden Proteinen markiert von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen in vivo ermöglicht klonalen Tracking über die konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie, die einen Einblick in die Knochenmark blutbild Architektur während der Regeneration. Dieses Verfahren ermöglicht nicht-invasive Abbildung von Schicksal spektral kodierten HSPCs abgeleiteten Zellen in intaktem Gewebe für ausgedehnte Zeiträume nach der Transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

Diese vereinfachte Anwendung der Intravitalmikroskopie von Mesenterialvenen bei Mäusen kann in verschiedenen Entzündungsmodellen verwendet werden, um Leukozyten-Endothel- und Thrombozyten-Leukozyten-Wechselwirkungen zu beobachten.

Intravitalmikroskopie der Leukozyten-Endothel und Plättchen-Leukozyten-Wechselwirkungen in Mesenterialvenen in Mice

Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung des Verhaltens von Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Bedingungen mittels intravitaler konfokaler Mikroskopie an anästhesierten Mäusen.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Dieses aktuelle Protokoll verwendet Fluoreszenzreporter, In-vivo-Markierung und intravitale Bildgebungstechniken, um die Überwachung des dynamischen Prozesses des Neutrophilen-Primings bei lebenden Tieren zu ermöglichen.

Intravital Imaging von Neutrophilen Priming Mit IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mäuse

Das Protokoll beschreibt ein neuartiges Maus-Femur-Fensterkammermodell, das verwendet werden kann, um die Bewegung von Zellen im femoralen Knochenmark in vivo zu verfolgen. Die Intravital-Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um drei Komponenten des femoralen Knochenmarks (Gefäße, Kollagenmatrix und Neutrophile) im Zeitverlauf abzubilden.

Femur Fensterkammer Modell für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zelltracking im Knochenmark der Maus

Monozyten sind wichtige Vermittler des Arteriogenesis im Rahmen der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit. Mit einem Basalmembran-wie Matrix und intravitalen Mikroskopie, untersucht dieses Protokoll Monocyte homing und im Zusammenhang mit Tumor-Angiogenese nach Monocyte-Injektion in die Femoral Arterie Ligatur Mausmodell.

Intravitalen Mikroskopie Monocyte Homing und Tumor-bezogene Angiogenese in einem Mausmodell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit

Die In-vivo-Bildgebung der Gelenke ist eine wertvolle Technik, um das Migrationsverhalten der Leukozyten und die molekulare Dynamik in den entzündeten Gelenken aufzudecken. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die in vivo Bildgebende der Gelenke mit einem Mausmodell der Typ-II-Kollagen-induzierten Arthritis (CIA) vor.

Im lebenden Organismus Die Bildgebung deckt das Wanderverhalten der Leukozyten in den Gelenken auf

Erfahren Sie die Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Analyse der Arteriogenese durch Tracking von Leukozytenadhärenz und -extravasation in murinen Kollateralarterien. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Echtzeit-Visualisierung mit geringer Phototoxizität.

Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell (Video) | JoVE Journal

Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell

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