Name: Reaktivierung neuronaler Stammzellen in kultivierten Drosophila-Hirnexplantationen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Erfahren Sie die Reaktivierung quieszenter neuronaler Stammzellen in kultivierten Drosophila-Hirnexplantaten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung systemischer und gewebsintrinsischer Signale zur Regulation von Neuroblasten.

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Wir erkennen das LSAMP Bridges to Doctorate Programm zur Finanzierung (CNK) sowie NIH / NIGMS (R01-GM120421 und R35-GM141886) an. Wir danken Dr. Conor Sipe für Abbildung 1. Wir danken auch allen Siegrist Lab-Mitgliedern für ihre anhaltende Unterstützung und Mentorschaft. Wir danken insbesondere Chhavi Sood und Gary Teeters für ihre sorgfältige Lektüre des Manuskripts und für ihre Kommentare.

<ol><li>Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+clinical+applications+of+stem+cells+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).</li>
<li>Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+regenerative+medicine%3A+challenges+and+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).</li>
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<li>Chell, J. M., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrition-responsive+glia+control+exit+of+neural+stem+cells+from+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nutrition-responsive glia control exit of neural stem cells from quiescence.</a> Cell. 143, 1161-1173 (2010).</li>
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<li>Britton, J. S., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+control+of+the+cell+cycle+in+Drosophila%3A+nutrition+activates+mitotic+and+endoreplicative+cells+by+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms.</a> Development. 125, 2149-2158 (1998).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremes+of+lineage+plasticity+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Extremes of lineage plasticity in the Drosophila brain.</a> Current biology : CB. 23, 1908-1913 (2013).</li>
<li>Sipe, C. W., Siegrist, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyeless+uncouples+mushroom+body+neuroblast+proliferation+from+dietary+amino+acids+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Eyeless uncouples mushroom body neuroblast proliferation from dietary amino acids in Drosophila.</a> Elife. 6, 26343(2017).</li>
<li>Speder, P., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+and+local+cues+drive+neural+stem+cell+niche+remodelling+during+neurogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Systemic and local cues drive neural stem cell niche remodelling during neurogenesis in Drosophila.</a> Elife. 7, 30413(2018).</li>
<li>Yuan, X., Sipe, C. W., Suzawa, M., Bland, M. L., Siegrist, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dilp-2-mediated+PI3-kinase+activation+coordinates+reactivation+of+quiescent+neuroblasts+with+growth+of+their+glial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Dilp-2-mediated PI3-kinase activation coordinates reactivation of quiescent neuroblasts with growth of their glial stem cell niche.</a> PLoS Biology. 18, 3000721(2020).</li>
<li>Colombani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nutrient+sensor+mechanism+controls+Drosophila+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth.</a> Cell. 114, 739-749 (2003).</li>
<li>Geminard, C., Rulifson, E. J., Leopold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+insulin+secretion+by+fat+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Remote control of insulin secretion by fat cells in Drosophila.</a> Cell Metabolism. 10, 199-207 (2009).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Molecular Biology of the Cell. 16, 5127-5140 (2005).</li>
<li>Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culturing+of+whole%2C+developing+Drosophila+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4270(2012).</li>
<li>Bostock, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immobilization+technique+for+long-term+time-lapse+imaging+of+explanted+drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted drosophila tissues.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094(2020).</li>
<li>Datta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+neuroblast+proliferation+in+explant+culture+of+the+Drosophila+larval+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Activation of neuroblast proliferation in explant culture of the Drosophila larval CNS.</a> Brain Research. 818, 77-83 (1999).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen.

Die hier beschriebene Methode zur Kultur von Hirnexplantationen kann in den meisten Laborumgebungen durchgeführt werden. Die benötigten Werkzeuge sowie die Vorgehensweise und Datenerfassung sind einfach und unkompliziert. Mit dieser Methode kann man eine Vielzahl von Hypothesen testen, einschließlich derjenigen, die sich auf die Zellsignalkaskaden und extrinsischen Faktoren beziehen, die die Reaktivierung und Proliferation von NB regulieren. Hier fanden wir unter Verwendung von Wildtyp-OregonR-Tieren heraus, dass exogene...

Stammzellen sind aufgrund ihres Potenzials für den Einsatz in der regenerativen Medizinvon großem Interesse 1,2. Viele Tiere, insbesondere solche, die langlebig sind, behalten Stammzellen in ihrem erwachsenen Gewebe. Diese residenten Stammzellen dienen der Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase und werden zur Reparatur nach körperlichen Verletzungen oder Krankheitenverwendet 3,4. Die meisten Stammzellen bei erwachsenen Tieren sind ruhig, ein relativ ruhender Zustand, der durch Zellzyklusstillstand und Inaktivierung der Wachstumssignalisierunggekennzeichnet ist 5. Als Reaktion auf extrinsische Hinweise verlassen Stammzellen die Ruhe, treten in den Zellzyklus ein und beginnen, Tochternachkommen zu erzeugen, die für ihren Gewebetyp spezifisch sind. Um beispielsweise eine effektive Immunantwort aufzubauen, induzieren Antigen-präsentierende Zellen ruhende naive T-Zellen, in den Zellzyklus einzutreten und sich klonalauszudehnen 6. Als Reaktion auf Schäden an der Skelettmuskulatur treten Muskelsatellitenstammzellen in den Zellzyklus ein und erzeugen Tochtermyoblasten, um beschädigte Myofibrillen zu ersetzen 5,7. Während es klar ist, dass ruhende Stammzellen auf extrinsische Signale reagieren, bleibt in vielen Fällen die Art des extrinsischen Hinweises unklar, ebenso wie der Mechanismus der Cue-induzierten Stammzellaktivierung. Ein besseres Verständnis dafür, wie ruhende Stammzellen auf extrinsische Hinweise reagieren und in den Zellzyklus eintreten, wird bei der Entwicklung besserer Stammzelltherapien in der Klinik helfen und die wissenschaftlichen Kenntnisse erweitern.
Seit Jahrzehnten werden Modellorganismen verwendet, um die Gene und Zellsignalwege aufzudecken, die die Stammzellproliferation während der Entwicklung und im Erwachsenenalter regulieren. Bei Drosophila teilen sich neuronale Stammzellen (NSCs), bekannt als Neuroblasten (NBs), während der gesamten Entwicklung, um alle Neuronen und Gliazellen zu erzeugen, die sich letztendlich integrieren und den neuronalen Schaltkreis bilden, der für die Gehirnfunktion erforderlich ist 8,9. Wie andere Stammzellen teilen sich NBs asymmetrisch, um sich selbst zu erneuern, und in einigen Fällen symmetrisch, um den Stammzellpool zu erweitern. Die NB werden während der Embryogenese spezifiziert und die meisten treten gegen Ende in die Ruhephase ein, was mit einem Rückgang der mütterlichen Nährstoffspeicher einhergeht (Abbildung 1). Nachdem die Embryogenese abgeschlossen ist, schlüpfen die Larven und beginnen mit der Fütterung. Als Reaktion auf die Tierfütterung reaktivieren sich die NBs aus der Ruhephase und nehmen die Zellteilungen 10,11,12,13,14,15,16 wieder auf. Da das Drosophila-ZNS relativ einfach ist und NBs zu definierten Zeiten in die Ruhephase ein- und austreten, erweist sich die Verwendung von Drosophila zur Untersuchung der Regulation von Ruhe, Ein- und Ausgang als ideal.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63189/63189fig01.jpg"> Abbildung 1: Relative Proliferation von CB-NBs (zentrale Gehirnneuroblasten, rot) und MB-NBs (Pilzkörper-Neuroblasten, blau) über die Entwicklungszeit. Am Ende der Embryogenese stellen die meisten NBs (rote Linie) die Proliferation ein und treten in die Ruhephase ein. Die Ruhephase dauert an, bis frisch geschlüpfte Larven ihre erste vollständige Mahlzeit zu sich nehmen. Die Zeitpunkte des Fokus für diese Methodik sind in roten Kreisen angegeben (1, Ruhezustand und 2, Reaktivierung). MB NBs (blau) sind eine Teilmenge der zentralen Gehirn-NBs, die sich während der gesamten Entwicklung kontinuierlich teilen (4 pro Gehirnhälfte). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63189/63189fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Als Reaktion auf die Tierfütterung werden PI3-Kinase- und TOR-Wachstumssignalwege in NBs und in ihrer Glia- und Trachealnische10,11,15,16 aktiv. Wenn Nährstoffe aus der Nahrung entzogen werden oder wenn der PI3-Kinasespiegel reduziert wird, können NBs nicht reaktiviert werden und das Wachstum von Glia und Luftröhre wird ebenfalls reduziert10,11,15,16. Das aktuelle Modell postuliert, dass die NB-Reaktivierung durch den Fettkörper an das Larvenwachstum gekoppelt ist, was ein systemisches Signal als Reaktion auf die Tierfütterungfreisetzt 12,17,18. Dieses Signal, das schwer fassbar bleibt, fördert wahrscheinlich die Expression und Freisetzung von Drosophila insulin-like peptide (Dilps) im Gehirn, was zur nachgeschalteten Aktivierung der PI3-Kinase in NBs und ihrer Glia- und Trachealnische führt. Um die Art der systemischen Cue(s) besser zu verstehen, haben wir eine Methode entwickelt, um ruhende NBs in kultivierten Gehirnexplantationen zu reaktivieren. Mit dieser Methode kann die Reaktivierung von NBs in Abwesenheit von systemischen Hinweisen für das gesamte Tier untersucht werden. Exogene Faktoren können den Kulturmedien wieder zugeführt und die NB-Reaktivierung basierend auf der Aufnahme des Thymidinanalogons EdU untersucht werden. Mit dieser Methode stellten wir fest, dass exogenes Insulin ausreicht, um ruhende NBs in Gehirnexplantaten zu reaktivieren. Zukünftige Arbeiten werden darauf abzielen, zusätzliche Faktoren zu identifizieren, die, wenn sie wieder hinzugefügt werden, entweder positiv oder negativ die NB-Ruhe in Gehirnexplantationen regulieren.

<table><tbody><tr><td>10 & Mikro; L Pipettenspitzen</td><td>Denville Sci</td><td>P2102</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Pipettenspitzen</td><td>Denville Sci</td><td>P2103-N</td><td></td></tr><tr><td>1000 & micro; L Pipettierer</td><td>Gilson</td><td>P1000</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd (10 x 10 mL)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>2912.60.0000</td><td>Zur Fixierung von Larvengehirnen</td></tr><tr><td>20 & Mikro; L Pipette</td><td>Gilson</td><td>P20</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L Pipettenspitzen</td><td>Denville Sci</td><td>1158U56</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Multiwell-Kulturplatten</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-197-4477</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petrischalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td>Traubenplatte Zutaten</td></tr><tr><td>4 > C Kühlschrank</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Bietet eine ideale Temperatur für >24 h Inkubationen in Antikörperlösung</td></tr><tr><td>63x Objektiv</td><td>Lecia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Active Trockenhefe</td><td>Die meisten Supermärkte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>214010</td><td>Traubenplatte Zutaten</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Zellproliferationskit für die Bildgebung, Alexa Fluor 647 Farbstoff</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10340</td><td>zur Beschriftung proliferierender Zellen</td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10er Pack à 4 oz</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-10</td><td>Zwei Deckgläser werden mit Sekundenkleber auf die Enden des Objektträgers geklebt. Dadurch entsteht ein Raum, in dem das Gehirn während der Abbildung in Antifade schweben kann.</td></tr><tr><td>Deckgläser, 22 mm x 50 mm x 1 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545E</td><td>Das Deckglas wird auf zwei quadratische Deckgläser auf dem Objektträger platziert, um sicherzustellen, dass sich das Gehirn im Antifade während der Bildgebung nicht bewegt.</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 Gallone Flasche</td><td>Fisher Scientific</td><td>2701</td><td>Wird verwendet, um die Larven vor dem 24-stündigen Halten in Kulturmedium abzuwaschen</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (10%)</td><td>Sigma</td><td>F4135-100ML</td><td>Ergänzung für Zellkulturmedien.</td></tr><tr><td>Feine Pinzette zum Sezieren</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-20</td><td>Rezepte für die Sektion. Sie funktionieren am besten, wenn sie geschärft sind.</td></tr><tr><td>Fliegenflaschen für die Überquerung</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-130</td><td>Diese Flasche wird als Behälter verwendet, der es den Fliegen ermöglicht, Eier auf der Traubenplatte abzulegen.</td></tr><tr><td>Glasdissektionsschale (3 Well)</td><td>Diese sind nicht mehr erhältlich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutathion</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td>Bietet oxidativen Schutz während der Zellkultur.</td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Sigma</td><td>G9023- 10ML</td><td>Blockierungsmittel</td></tr><tr><td>Traubenplatten</td><td>Hergestellt im Haus</td><td>Hergestellt im Haus Traubensaft</td><td>/ Agarose-Platten zum Sammeln frisch geschlüpfter Eier</td></tr><tr><td>Image J</td><td>Imagej.net/fiji/downloads</td><td>Kostenloser Download:&nbsp; https://fiji.sc</td><td>Bildgebungsplattform, die zum Zählen von Zellen und Edu-Reaktivierung</td></tr><tr><td>verwendet wird Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Stellt sicher, dass Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Lichteinwirkung während des gesamten Experiments genau gleich sind.</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>Unabhängig vom Experiment</td></tr><tr><td>Laminar-Flow-Haube</td><td></td><td></td><td>Zur Aliquotierung von Kulturmedien</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>Bietet Unterstützung während der Zellkultur</td></tr><tr><td>Nunc 72-Well-Microwell-Mini-Tabletts</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-154</td><td>Immunfärbeschritte werden in diesem Tablett durchgeführt</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher</td><td>Scientific S37440</td><td>Folie zum Versiegeln von Platten, um Verdunstung zu verhindern</td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Sigma</td><td>P4458-100ml</td><td>Antibiodika zur Verhinderung einer bakteriellen Kontamination von Zellen während der Kultur.</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer, pH7,4</td><td>Im Haus</td><td>hergestellt Im Haus hergestellt</td><td>Lösungsmittel zum Waschen des Gehirns nach den Fixier- und Färbeschritten</td></tr><tr><td>Pick</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td>Wird verwendet, um Larven von der Traubenplatte zu pflücken</td></tr><tr><td>Propionsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-258</td><td>Zutaten für die Traubenplatte</td></tr><tr><td>Kaninchen 405</td><td>Abcam</td><td>ab175653</td><td>Antikörper für die Immunfärbung</td></tr><tr><td>Rat 555</td><td>Abcam</td><td>ab150166</td><td>Antikörper für die Immunfärbung</td></tr><tr><td>Rb Scribble</td><td>Ein Geschenk von Chris Doe</td><td></td><td>Antikörper für die Immunfärbung</td></tr><tr><td>Rt Deadpan</td><td>Abcam</td><td>ab195173</td><td>Antikörper für die Immunfärbung</td></tr><tr><td>Schneiders Culture Medium</td><td>Life Tech</td><td>21720024</td><td>Enthält Nährstoffe, die den Zellen beim Wachstum und der Vermehrung helfen</td></tr><tr><td>SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL)</td><td>Life Tech</td><td>S36963</td><td>Reagenz, das Schutz vor verblassenden Fluorophoren bietet</td></tr><tr><td>Steriles Wasser</td><td>Autoklav Milli-Q Wasser aus eigener</td><td></td> Herstellung <td>Benötigt für Lösungen</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher</td><td>S2-12</td><td>Traubenplatte Zutaten</td></tr><tr><td>Superfrost Objektträger Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Sekundenkleber</td><td>Die meisten Supermärkte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-259</td><td>Traubenteller Zutaten</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284-100ML</td><td>PBT</td></tr><tr><td>Welch's 100% Traubensaft</td> Die <td>meisten Supermärkte</td><td></td><td>Traubenteller Zutaten</td></tr></tbody></table>

reaktivierung neuronaler stammzellen in kultivierten drosophila-hirnexplantationen

Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants

Neurale Stammzellen (NSCs) haben die Fähigkeit, sich zu vermehren, zu differenzieren, Apoptose zu durchlaufen und sogar in die Ruhephase einzutreten und sie zu verlassen. Viele dieser Prozesse werden durch das komplexe Zusammenspiel von NSC-intrinsischen genetischen Programmen mit NSC-extrinsischen Faktoren, lokalen und systemischen, gesteuert. Im genetischen Modellorganismus Drosophila melanogaster wechseln NSCs, bekannt als Neuroblasten (NBs), während des Übergangs von Embryo zu Larve von Ruhe zu Proliferation. Während dieser Zeit tauchen Larven aus ihren Eierschalen auf und beginnen zu krabbeln, um Nährstoffe zu suchen. Als Reaktion auf die Tierernährung produziert der Fettkörper, ein endokrines Organ mit Lipidspeicherkapazität, ein Signal, das systemisch in die zirkulierende Hämolymphe abgegeben wird. Als Reaktion auf das Fettkörper-abgeleitete Signal (FBDS) werden Drosophila insulinähnliche Peptide (Dilps) produziert und aus neurosekretorischen Neuronen und Gliazellen des Gehirns freigesetzt, was zu einer nachgeschalteten Aktivierung der PI3-Kinase-Wachstumssignale in NBs und ihrer Glia- und Trachealnische führt. Obwohl dies das aktuelle Modell dafür ist, wie NBs von Ruhe zu Proliferation wechseln, bleibt die Art des extrinsischen FBDS-Hinweises schwer fassbar. Um besser zu verstehen, wie extrinsische systemische Hinweise auf NB den Austritt aus der Ruhephase regulieren, wurde eine Methode entwickelt, um frühe Larvengehirne in vitro vor der Tierernährung zu kultivieren. Mit dieser Methode können exogene Faktoren an die Nährmedien abgegeben und NB-Austritt aus der Ruhezeit untersucht werden. Wir fanden heraus, dass exogenes Insulin ausreicht, um NBs aus der Ruhephase in Ganzhirnexplantaten zu reaktivieren. Da sich diese Methode gut für großflächige Bildschirme eignet, wollen wir zusätzliche extrinsische Hinweise identifizieren, die die NB-Ruhephase im Vergleich zu Proliferationsentscheidungen regulieren. Da die Gene und Signalwege, die NSC-Proliferationsentscheidungen regulieren, evolutionär konserviert sind, könnten die Ergebnisse dieses Assays einen Einblick in die Verbesserung regenerativer Therapien in der Klinik geben.

Frisch geschlüpfte OregonR-Wildtyp-Gehirne wurden seziert und 24 Stunden lang in Schneiders Medien (SSM) mit Insulin kultiviert. Gewebe wurden gemäß dem Protokoll fixiert und gefärbt. Primäre Antikörper, die gegen Deadpan (Dpn) zum Nachweis von NBs und Scribble zur Markierung von Zellmembranen erzeugt wurden, wurden verwendet. Das Thymidinanalogon 5-Ethynyl-2′-Desoxyuridin (Edu) wurde hinzugefügt, um den Eintritt in die S-Phase und die NB-Reaktivierung nachzuweisen. Wir fanden großformatige Edu positive und Dpn positive ...

Eine Methode zur Reaktivierung ruhender neuraler Stammzellen in kultivierten Drosophila-Hirnexplantationen wurde etabliert. Mit dieser Methode kann die Rolle systemischer Signale von gewebeintrinsischen Signalen bei der Regulation der Ruhe, des Eintritts und des Austritts neuronaler Stammzellen entkoppelt werden.

Reaktivierung neuronaler Stammzellen in kultivierten Drosophila-Hirnexplantationen

Neural stem cells (NSCs) have the ability to proliferate, differentiate, undergo apoptosis, and even enter and exit quiescence. Many of these processes ...

Wir haben eine Methode entwickelt, um ruhende neurale Stammzellen in kultivierten Drosophila-Hirnexplantaten zu reaktivieren. Diese Methode kann exogene Faktoren an die Kulturmedien liefern und die Reaktivierung von Neuroblasten untersuchen. Bessere Stammzelltherapien könnten durch ein besseres Verständnis entwickelt werden, wie ruhende Stammzellen auf extrinsische Hinweise reagieren und in den Zellzyklus eintreten.Das Verfahren wird Susan Doyle, eine Forscherin aus meinem Labor, demonstrieren. Um zu beginnen, pflücken Sie vorsichtig etwa 20 bis 25 frisch geschlüpfte Larven aus der Traubenagarplatte unter einem Seziermikroskop. Füllen Sie eine Petrischale mit etwa zwei Millilitern PBS und tauchen Sie die Spitze des Werkzeugs mit Larven für zwei Minuten in PBS.Nach zwei Minuten kippen Sie die Schale in einem Winkel, um die Flüssigkeit am Boden zu sammeln, und bürsten Sie die Larven mit einem kleinen Pinsel aus der Flüssigkeit auf den Boden der Petrischale. Sammeln Sie alle Larven auf dem Pinsel und spülen Sie die Larven kurz in 70% Ethanol ab, bevor Sie sie zurück in die Petrischale mit PBS geben. Besprühen Sie den Arbeitsbereich, die Sezierwerkzeuge, die Pinzette und zwei Glasuhrenschalen mit 70% Ethanol und lassen Sie sie auf der Bank trocknen.Machen Sie das ergänzte Schneider'sche Kulturmedium, kurz SSM, und legen Sie es auf Eis. Pippen Sie einen Milliliter des Mediums in jede Glasuhrenschüssel. Übertragen Sie die frisch geschlüpften Larven mit einer Mikropipette mit steriler Spitze von der PBS-Platte in die SSM in der ersten Glasuhrenschüssel.Sezieren Sie die Gehirne aus den Larven, die in der zweiten Glasuhrenschale mit SSM platziert sind, mit einer Pinzette unter einem Seziermikroskop und passen Sie die Vergrößerung nach Bedarf an. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Mundhaken zu greifen, und greifen Sie mit der anderen vorsichtig den Körper auf halber Höhe nach unten und ziehen Sie in die entgegengesetzte Richtung, um die Larve in zwei Stücke zu teilen. Nachdem Sie 15 bis 20 Gehirne seziert haben, fügen Sie einen Milliliter SSM in eine Vertiefung einer sterilen 24-Well-Kulturschale hinzu.Mit einer Mikropipette und einer sterilen Spitze die frisch sezierten Gehirne in den SSM überführen, gefolgt von der Inkubation der Medien mit Gehirnen für 24 Stunden bei 25 Grad Celsius. Pipettieren Sie 10 Mikroliter eines 10-Millimolaren Vorrats von 5-Ethynyl-2'desoxyuridin oder EDU mit 990 Mikrolitern SSM in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen, mischen Sie, pipettieren Sie dann einen Milliliter EDU SSM in eine Vertiefung der sterilen 12-Well-Kulturschale. Übertragen Sie die Gehirne mit einer Mikropipette mit steriler Spitze von der Welle, die SSM enthält, in die neue Welle, die die EDU SSM-Lösung enthält, und inkubieren Sie für eine Stunde bei 25 Grad Celsius.Als nächstes übertragen Sie die EDU-markierten Gehirne in eine andere Vertiefung in derselben Kulturschale, die einen Milliliter Fixiermittel enthält, und lassen Sie die Gehirne für 20 Minuten fixieren. Übertragen Sie das Gehirn nach der Fixierung schnell mit einer Mikropipette in eine Minitray-Vertiefung mit 72 Wells. Spülen Sie das Gehirn dreimal in 10 Mikrolitern PBT und wiederholen Sie drei Wäschen für jeweils 10 Minuten, um sicherzustellen, dass das Gehirn immer mit etwas Flüssigkeit bedeckt ist.Pipette 10 Mikroliter blockierende Lösung auf das Gehirn. Decken Sie das Tablett ab und verschließen Sie es mit einem Streifen Parafilm um den Rand. Die Abbildung zeigt großformatige EDU-positive und tote pan-positive Neuroblastenzellen nach 24 Stunden Kultivierung in SSM mit Insulin und Färbung.Nach 24 Stunden in ergänzten Schneider-Medien ohne Insulin hatten die frisch geschlüpften Oregon R-Wildtyp-Gehirne keine großformatigen EDU-positiven und toten-positiven Neuroblastenzellen, außer den Vier-Pilzkörper-Neuroblastenzellen und einer ventrolateralen Neuroblastenzelle. Während der konfokalen Bildgebung wurden gelegentlich einige Gehirnhälften mit Schäden, wie kleine bis große Löcher im explantierten Hirngewebe, beobachtet. Alle Gehirne mit Löchern wurden nicht für die Analyse verwendet.Sezieren Sie das Gewebe vorsichtig und pipettieren Sie es vorsichtig, um Gewebeschäden zu vermeiden. Versuchen Sie auch, so steril wie möglich zu sein und Ihre Kulturen nicht zu kontaminieren. Da die Kulturmedien leicht manipuliert werden können, indem verschiedene Faktoren hinzugefügt werden, kann diese Technik verwendet werden, um zukünftige Hypothesen bezüglich extrinsischer Signalgebung und Neuroblastenstillstandseintritt und -austritt aufzustellen.

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