Isolierung von microRNAs aus Zecken-Ex-vivo-Speicheldrüsenkulturen und extrazellulären Vesikeln

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, eine reduzierte Anzahl von Zecken zu verwenden, was die Kosten für die Erhaltung der Kolonie reduziert und die Anzahl der für die Zeckenfütterung benötigten Wirbeltiere verringert. Dieses Protokoll erfordert ungefähr 20 Zecken. Der Hauptvorteil neben der Verwendung einer kleinen Stichprobengröße besteht jedoch darin, dass dieses Protokoll auf mehrere Zeckenarten und verschiedene Lebensstadien angewendet werden kann.

Abgesehen von Zeckendissektionen oder der Anwendung auf Wirt-Parasit-Interaktionen ist die Wirkung einer Erregerinfektion auf die microRNA-Sekretion und die Wirkung physiologischer Veränderungen auf die von Zecken sezernierte microRNA die Sekretion. Bereiten Sie zunächst vesikelfreie Medien vor, indem Sie fötales Rinderserum, Tryptosephosphatbrühe, 10% Lipoproteincholesterinkonzentrat, 5% Natriumbicarbonat, HEPES und L15C300-Medium in eine 26,3-Milliliter-Polycarbonat-Zentrifugenflasche geben und das Volumen nach Bedarf anpassen. Nun ultrazentrifugieren Sie das Medium bei 100.000 mal G bei vier Grad Celsius für 18 Stunden.

Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören, und geben Sie den Überstand in ein frisches Zentrifugenröhrchen. Ultrazentrifugieren Sie das Röhrchen erneut. Nehmen Sie den Überstand und leiten Sie ihn durch einen 0,22-Mikrometer-Filter, um Verunreinigungen zu entfernen.

Pipetten Sie den Überstand in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und lagern Sie ihn bei minus 20 Grad Celsius bis zu Bedarf oder bis zu drei Jahre. Fügen Sie eine angemessene Menge Antibiotika zu 500 Mikrolitern des vesikelfreien Mediums in jeder Vertiefung einer 24-Well-Kulturplatte hinzu. Fügen Sie nun PBS mit Rifampicin zu den Vertiefungen hinzu, die kein vesikelfreies Medium enthalten, um Bakterienwachstum zu verhindern.

Legen Sie die Zecken auf einen Glasobjektträger mit doppelseitigem Teppichband unter einem Seziermikroskop. Vor der Dissektion PBS, das Rifampicin enthält, zur Zecke hinzufügen und mit einer Vier-Millimeter-Vannas-Schere einen Schnitt von etwa einem Millimeter an der Seite jedes Weibchens machen. Entfernen Sie nun die Rückenseite und die Speicheldrüsen der Zecke und legen Sie dann 20 bis 40 Zeckenspeicheldrüsen in 500 Mikroliter vesikelfreies Medium, das zu einer einzigen Vertiefung in eine mit 24-Well-Gewebekultur behandelte Platte gegeben wird.

Inkubieren Sie die Speicheldrüsenproben bei 32 Grad Celsius für 24 Stunden, um die Sekretion der extrazellulären Vesikel zu ermöglichen. Am Ende der Inkubation das gesamte Medium, das die Speicheldrüsen enthält, in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren und 10 Minuten lang bei 300 mal G bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.

Resuspendieren Sie das Pellet mit den Speicheldrüsen später in RNA und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius, bis es verwendet wird oder auf unbestimmte Zeit. Entfernen Sie nun die Zelltrümmer, indem Sie den Überstand bei 2.000 mal G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten zentrifugieren und den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren. Als nächstes zentrifugieren Sie bei 10.000 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius, um apoptotische Körper und größere extrazelluläre Vesikel zu entfernen und den Überstand in ein frisches 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen.

Montieren Sie dann einen Ein-Mikrometer-Nylon-Spritzenfilter auf einer 10-Milliliter-Spritze und halten Sie ihn auf einem Ultrazentrifugenröhrchen. Dann fügen Sie die Probe hinzu und füllen Sie die Spritze mit 10 Milliliter PBS. Führen Sie den Überstand durch den Filter in das Rohr.

Nachdem Sie die Röhrchen gefiltert und ausgewuchtet haben, legen Sie sie in einen 70 Ti-Rotor und ultrazentrifugieren Sie die Röhrchen bei 100.000 Mal G für 18 Stunden bei vier Grad Celsius. Die konzentrierten extrazellulären Vesikel bilden nach der Ultrazentrifugation ein Pellet. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren Sie das Pellet in PBS.

Pipettieren Sie 500 Mikroliter des extrazellulären Vesikels in einen 300 K Zentrifugalfilter und zentrifugieren Sie bei 8.000 mal G für 10 Minuten bei Umgebungstemperatur und wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle extrazellulären Vesikel gefiltert sind. Schließlich fügen Sie 400 Mikroliter sterilisiertes PBS zur Säule hinzu und mischen Sie gründlich, um extrazelluläre Vesikel zu entfernen, die an der Membran befestigt sind. Dann geben Sie die Probe in ein 1,5 Milliliter DNAase RNAse freies Röhrchen.

Die Konzentration und Größe der extrazellulären Vesikel variierte je nach Geschlecht und Lebensstadium der Zecken zwischen den biologischen Replikaten für Weibchen, Männchen und Nymphen. Für alle kombinierten biologischen Replikate wurden ähnliche Ergebnisse beobachtet. Die Analyse kleiner RNAs, die aus der Speicheldrüse isoliert wurden, zeigte Banden, die ribosomalen RNAs und microRNAs entsprechen.

Die ribosomalen RNAs fehlten jedoch in den aus den Speicheldrüsen isolierten Vesikel, und microRNA-Proben, die aus extrazellulären Vesikeln gereinigt wurden, zeigten mehr Abbau. Nach der Anreicherung zeigten die aus EVs gereinigten microRNA-Proben einen minimalen Abbau und eine ausreichende microRNA-Konzentration für die cDNA-Bibliothekssynthese. Die erwartete Bandengröße von etwa 150 Basenpaaren nach Erhalt der cDNA-Bibliotheksvorbereitung bedeutet kleine RNA-cDNA-Bibliotheken.

Stellen Sie während der vesikelfreien Zubereitung sicher, dass Sie die Schritte befolgen, um eine Kontamination mit externen Vesikeln zu verhindern. Achten Sie während der Brunnenplattenvorbereitung darauf, Antibiotika hinzuzufügen, um eine bakterielle Kontamination durch das Zeckenmikrobiom zu verhindern. Die mit diesem Protokoll extrahierten microRNAs können für Profiling- und Funktionsexperimente verwendet werden, um microRNA-Rollen zu validieren, z. B. die Vorhersage von microRNA-Signalwegzielen, Hemmungs- und Mimikry-Experimenten.