Name: Xenograft-Hautmodell zur Manipulation menschlicher Immunantworten in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Lernen Sie die Xenotransplantation menschlicher Haut auf NSG-Mäuse für präklinische Studien zur Hautphysiologie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung immunologischer Reaktionen in vivo.

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Diese Arbeit wurde zum Teil durch gesponserte Forschungsvereinbarungen von TRex Bio und Zuschüsse des NIH finanziert (1R01AR075864-01A1). JMM wird von der Cancer Research Society unterstützt (Grant 26005). Wir erkennen den Parnassus Flow Cytometry Core an, der teilweise durch die Zuschüsse NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 und S10 1S10OD018040-01 unterstützt wird.

Die vorliegende Studie wurde in Übereinstimmung mit den Protokollen UCSF IACUC (AN191105-01H) und IRB (13-11307) genehmigt und durchgeführt. Hautproben, die im Rahmen routinemäßiger elektiver chirurgischer Eingriffe wie Hernienreparatur verworfen wurden, wurden für die vorliegende Forschung verwendet. Die Hautproben werden entweder anonymisiert und als Not Human Subjects Research zertifiziert oder, wenn klinisch identifizierende Informationen für nachgeschaltete Analysen erforderlich sind, haben die Patienten eine schriftliche Einwilligung gemäß IRB-Protokoll 13-11307 gegeben. Es wurden keine anderen Ein- oder Ausschlusskriterien verwendet. NSG-Mäuse beiderlei Geschlechts, 8-10 Wochen alt, wurden in der Studie eingesetzt. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle).
1. Verarbeitung der menschlichen Spenderhautprobe
HINWEIS: Die menschliche Hautprobe, die bei dieser Transplantation verwendet wurde, war eine große Probe, die aus dem Bauch eines gesunden Patienten entnommen wurde. Die Probe muss mindestens 15 cm x 7,5 cm groß sein. Größenbeschränkungen können sich auf die Anzahl der Mäuse auswirken, für die Haut verfügbar ist, und auf die Wahl der Transplantatgröße.
<ol><li>Halten Sie die Hautprobe vor der Vorbereitung und Transplantation bei kalten Temperaturen (auf Eis; 4°C). Halten Sie die Probe feucht in einem geschlossenen Probenentnahmebecher, wobei die Gaze in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) getränkt ist. HINWEIS: Es wird nicht empfohlen, die Hautprobe länger als 2 Tage bei 4 °C zu lagern. Es gibt jedoch Berichte, in denen die Hautproben länger gelagert werden12. VORSICHT: Behandeln Sie sämtliches menschliches Gewebe mit den üblichen Biogefahrenvorkehrungen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Dermatome der menschlichen Hautprobe in einer sterilisierten Unterdruck-Gewebekulturhaube auf einer sterilisierten Dissektionsplatte vor.</li>
	<li>Legen Sie die Hautprobe, Epidermis mit der Seite nach oben, auf die Dissektionsplatte. Wischen Sie die Epidermis mit einem sterilen Alkohol-Vorbereitungspad und dann mit PBS ab.</li>
	<li>Befestigen Sie den näheren Rand der Haut mit einem 1,5-Zoll-T-Stift (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Dermatome die Hautprobe in einer Dicke von 400 μm, wobei gleichmäßiger Druck ausgeübt wird, während in einem Winkel von 30°-45° nach vorne geschnitten wird. Befolgen Sie alle gerätespezifischen Anweisungen und Sicherheitsmaßnahmen (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Einzelheiten zur Dermatomtechnik finden Sie in einem zuvor veröffentlichten Bericht13.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 100 mm x 20 mm große Petrischale vor, indem Sie eine sterile, mit sterilem PBS getränkte Gaze auf den Boden der Schale legen. Legen Sie die Haut, Epidermis mit der Seite nach oben, auf die nasse Gaze.</li>
	<li>Versiegeln und bedecken Sie die Plattenkanten mit einer halbtransparenten Dichtungsfolie (siehe Materialtabelle), um sicherzustellen, dass die Probe nicht kontaminiert ist. Lagern Sie die Probe vor dem Pfropfen bei 4° C.</li>
</ol>2. Präoperative Konditionierung und Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie die sterilen Instrumente und eine sterile Operationsstation für die Transplantation vor. Verwenden Sie autoklavierte Papierhandtücher als sterile Oberflächen für die Platzierung von Instrumenten und Mäusen. HINWEIS: Mäuse können nach dem Absetzen transplantiert werden, werden aber vorzugsweise im Alter von 8-10 Wochen transplantiert. Mäuse beiderlei Geschlechts können gepfropft werden.</li>
	<li>Führen Sie die chirurgische Vorbereitung, wie z. B. die Haarentfernung, in einem Bereich durch, der physisch von der chirurgischen Station getrennt ist.</li>
	<li>Bereiten Sie den Anti-GR1 (siehe Materialtabelle) vor, indem Sie ihn auf 1 mg/ml in steriler Kochsalzlösung verdünnen. Dosieren Sie jede Maus mit 100 μg/100 μL der Anti-GR1-Lösung intraperitoneal nach Anäsieeinleitung.</li>
	<li>Betäuben Sie die Mäuse nacheinander mit Isofluran oder anderen institutionell zugelassenen Anästhetika. HINWEIS: Isofluran muss während der Induktion in einer Konzentration von 3% -5% verabreicht werden. Sobald die Maus unbeweglich ist, senken Sie die Isoflurankonzentration auf 1% -3%, um für die Dauer der Operation zu wirken.<ol><li>Überwachen Sie die Maus auf eine angemessene Anästhesietiefe, indem Sie die Atemfrequenz, das Fehlen einer Zehenklemmreaktion und eine angemessene rosa Färbung von Ohren und Mund beobachten. VORSICHT: Verwenden Sie geeignete Anästhesiemaschinen und Spülmethoden und vermeiden Sie die Exposition gegenüber Isoflurandämpfen.</li>
	</ol></li>
	<li>Übertragen Sie die Maus auf ein Heizkissen oder eine andere Wärmequelle (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Verabreichen Sie die Augensalbe, indem Sie einen kleinen Tropfen Salbe mit einem behandschuhten Finger auf das Auge tupfen.</li>
	<li>Die Analgetika Buprenorphin (0,08 mg/kg) und Carprofen (5 mg/kg) (siehe Materialtabelle) subkutan verabreichen, indem Sie die Haut kneifen und in einem Winkel parallel zum Körper injizieren. HINWEIS: Bereiten Sie die Analgesie vor der Behandlung nach institutionellen Protokollen vor. Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien für die Auswahl und Verabreichung von Analgetika. Die in dieser Studie verwendete Methode der Analgesie ist in Schritt 2.7 und ergänzender Abbildung 1 beschrieben.</li>
	<li>Verabreichen Sie das Anti-GR1 (hergestellt in Schritt 2.4) intraperitoneal, indem Sie die Maus leicht am Schwanz anheben, den Bauch freilegen und in einem Winkel von 30° mit einer Insulinspritze 1 ml (12,7 mm) injizieren.</li>
	<li>Verwenden Sie tiersichere elektrische Haarschneider (siehe Materialtabelle), um den mittleren und oberen Teil der Rückenseite der Maus zu rasieren.</li>
	<li>Reinigen Sie alle Haare und tragen Sie eine großzügige Menge Haarentfernungssalbe für 30 s bis 1 Minute auf die rasierte Haut auf.</li>
	<li>Wischen Sie die Haarentfernungssalbe mit einem Papiertuch und PBS vollständig ab.</li>
</ol>3. Transplantationsverfahren
<ol><li>Bringen Sie die Maus an einen sekundären chirurgischen Ort, weg von der Haarentfernungsstation.</li>
	<li>Sterilisieren Sie die Operationsstelle mit dem Jodtupfer in kreisenden Bewegungen, beginnend in der Mitte und trainieren Sie zum Rand des enthaarten Bereichs.</li>
	<li>Legen Sie ein Stück sterile Plastikfolie über die Maus und schneiden Sie ein Fenster in den Kunststoff, das etwas größer ist als die Größe des zu transplantierenden Bereichs.</li>
	<li>Schneiden Sie einen rechteckigen 10 mm x 10 mm großen Teil der Spenderhaut ab, der mit einem Skalpell transplantiert werden soll. Tun Sie dies, indem Sie die Spenderhaut fest mit der Rückseite der Pinzette halten und mit dem Skalpell neben der Pinzette schneiden.</li>
	<li>Schneiden Sie mit der chirurgischen Schere einen rechteckigen Bereich der Maushaut ab, der der Größe des Spenderhautstücks entspricht, wodurch ein Transplantatbett entsteht. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut vom Körper wegzuziehen, und schneiden Sie die Haut mit der Schere vom Körper weg, um zu vermeiden, dass sie tief in die Fassade einschneidet.</li>
	<li>Legen Sie das Spenderhautstück, Epidermis mit der Seite nach oben, auf das vorbereitete Transplantatbett.</li>
	<li>Manipulieren Sie die Haut mit der Rückseite der Pinzette und gleiten Sie hin und her, bis die Spenderhaut völlig flach gegen das Transplantatbett liegt.</li>
	<li>Fügen Sie Tropfen chirurgischen Klebstoffgewebeklebers hinzu (siehe Materialtabelle), wo die Spenderhaut auf die Maushaut trifft, und halten Sie die Maus und die Spenderhaut mit einer Pinzette für 1-2 s zusammen, so dass der Klebstoff am Gewebe haftet. Versiegeln Sie den Rand des Transplantats vollständig und lassen Sie den Klebstoff vollständig trocknen.</li>
	<li>Verbinden Sie die Mäuse (Abbildung 1), indem Sie die folgenden Schritte ausführen.<ol><li>Schneiden Sie ein Stück Petrolatumgaze (siehe Materialtabelle), das groß genug ist, um den Transplantatbereich vollständig abzudecken.</li>
		<li>Bedecken Sie das Transplantat mit der Vaselinegaze und drücken Sie die Gaze mit einer Pinzette leicht gegen die Haut.</li>
		<li>Schneiden Sie einen Streifen eines transparenten Filmverbandes der Länge nach ab, so dass die Breite groß genug ist, um die Wunde der Maus zu bedecken.</li>
		<li>Drücken Sie den transparenten Folienverband mit der Klebeseite nach unten fest über die Gaze. Rollen Sie schnell die Maus, um den Verband vollständig um den Oberkörper zu wickeln, um sicherzustellen, dass er fest sitzt, ohne die Atmung zu behindern und alle Gliedmaßen frei für die Bewegung sind.</li>
		<li>Setzen Sie die Maus in einen Wiederherstellungskäfig und überwachen Sie sie, bis sie wachsam ist und sich bewegt. Stellen Sie eine Wärmequelle auf einem Teil des Käfigs für mindestens 15 Minuten nach der Wiederherstellung bereit. HINWEIS: Es wird erwartet, dass sich die Tiere innerhalb von 1-5 Minuten erholen, nachdem sie in den Erholungskäfig gesetzt wurden.</li>
	</ol></li>
	<li>Einzeln beherbergen die Mäuse nach dem Pfropfen.</li>
	<li>Verabreichen Sie postoperative Analgesie gemäß den institutionellen Protokollen. HINWEIS: Buprenorphin (0,08 mg/kg) wurde 4-6 Stunden später während der vorliegenden Studie subkutan verabreicht.</li>
</ol>4. Postoperative Eingriffe
<ol><li>Injizieren Sie 100 μL (100 μg) Anti-GR1 intraperitoneal nach 4 Tagen, 7 Tagen und 11 Tagen nach der Transplantation, um eine Transplantatabstoßung zu verhindern (ergänzende Abbildung 1).</li>
	<li>Ersetzen Sie die Bandagen nach Bedarf und wenn sie von Mäusen entfernt werden.</li>
	<li>Verbinden Sie alle Mäuse am Tag 7.</li>
	<li>Entfernen Sie die Bandagen am 14. Tag.</li>
	<li>Überwachen Sie die Mäuse auf Anzeichen einer Transplantatabstoßung und systemischen Entzündungen (Gewichtsverlust, Haarausfall, extreme Lethargie).</li>
	<li>Ernten Sie die Mäuse zwischen 3 und 6 Wochen nach der Transplantation.<ol><li>Euthanasieren Sie die Mäuse durch regulatorgesteuerte Kohlendioxid (CO2) -Verabreichung, gefolgt von zervikaler Dislokation. HINWEIS: Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien für Sterbehilfe.</li>
		<li>Sezieren Sie die Hauttransplantate der Mäuse14. Legen Sie einen Teil des Transplantats für 24 Stunden in 10% Formalin, bevor Sie Paraffin einbetten und schneiden, um die Histologie zu färben9.</li>
		<li>Zerkleinern Sie die Hauttransplantate mit einer Schere und verdauen Sie sie enzymatisch mit 250 IE / ml Kollagenase IV und 0,02 mg / ml DNase in Zellkulturmedien über Nacht. Färbung der Zellen für Oberflächen- und intrazelluläre Marker nach dem zuvor beschriebenen Verfahren14.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Zomer, H. D., Trentin, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+wound+healing+in+humans+and+mice%3A+Challenges+in+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research.</a> Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).</li>
<li>Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+approaches+to+create+murine+models+of+human+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Surgical approaches to create murine models of human wound healing.</a> Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 969618(2011).</li>
<li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+not+men%3A+differences+between+mouse+and+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li>
<li>Pasparakis, M., Haase, I., Nestle, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+regulating+skin+immunity+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms regulating skin immunity and inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (5), 289-301 (2014).</li>
<li>Sun, H., Zhang, Y. -X., Li, Y. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+skin+organoids%3A+potential+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of skin organoids: potential opportunities and challenges.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3176(2021).</li>
<li>Cristóbal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+human+skin+transplantation%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Mouse models for human skin transplantation: a systematic review.</a> Cells Tissues Organs. 210 (4), 250-259 (2021).</li>
<li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+potential+in+organoid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li>
<li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD%2FSCID%2F%CE%B3cnull+mouse%3A+an+excellent+recipient+mouse+model+for+engraftment+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NOD/SCID/γcnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells.</a> Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).</li>
<li>Meraz, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+patient-derived+xenograft+humanized+mouse+model+for+evaluation+of+lung+cancer+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses.</a> Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).</li>
<li>Racki, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD-scid+IL2rgamma%28null%29+mouse+model+of+human+skin+transplantation+and+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection.</a> Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).</li>
<li>Meehan, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+xenograft+model+of+human+vasculature+in+the+mouse+ear+pinna%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna.</a> Scientific Reports. 10 (1), 2058(2020).</li>
<li>Gokkaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+graft+storage+in+platelet+rich+plasma+%28PRP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP).</a> Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178(2020).</li>
<li>Humeca, B. V. The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA">https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA</a> (2021).</li>
<li>Rodriguez, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+regulatory+T+cells+reside+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Memory regulatory T cells reside in human skin.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).</li>
<li>Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+rodent+aseptic+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Techniques in rodent aseptic surgery.</a> Current Protocols in Immunology. 82 (1), 12-14 (2008).</li>
<li>Karim, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+ischemia+and+neovascularization+in+a+murine+model+of+full+thickness+human+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%3A+Official+Publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).</li>
<li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenogeneic+graft-versus-host-disease+in+NOD-scid+IL-2R%CE%B3null+mice+display+a+T-effector+memory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rγnull mice display a T-effector memory phenotype.</a> PloS One. 7 (8), 44219(2012).</li>
<li>Souci, L., Denesvre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+skin+models+in+domestic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">3D skin models in domestic animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 21(2021).</li>
<li>Holtkamp, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+clocks+guide+dendritic+cells+into+skin+lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics.</a> Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).</li>
</ol>

MDR ist Gründer von TRex Bio und Sitryx. MDR und MML erhalten Forschungsgelder von Sitryx, Q32 und TRex Bio.

Das Maus-Xenograft-Hauttransplantationsmodell ist eine Schlüsseltechnik zur mechanistischen Analyse menschlicher Hautimmunantworten in einer In-vivo-Umgebung 14. Erfolgreiche Xenograft-Hauttransplantationen beruhen auf der geeigneten Vorbereitung von Mäusen und Hautproben und Mäusen und der Einhaltung aseptischer Nagetierchirurgiemethoden15. Eine schnelle Abkühlung und ordnungsgemäße Lagerung von Hautproben bei kalten Temperaturen in Medien (z. B. sterile Kochsalzl...

Mausmodelle werden häufig verwendet, um Rückschlüsse auf die menschliche Biologie und Krankheiten zu ziehen, teilweise aufgrund ihrer experimentellen Reproduzierbarkeit und Fähigkeit zur genetischen Manipulation. Die Physiologie der Maus rekapituliert jedoch menschliche Organsysteme, insbesondere die Haut, nicht vollständig und hat daher Einschränkungen für die Verwendung als präklinisches Modell in der Arzneimittelentwicklung1. Anatomische Unterschiede zwischen Maus- und menschlicher Haut umfassen Unterschiede in der Epitheldicke und -architektur, das Fehlen von ekkrinen Schweißdrüsen der Maus und Variationen im Haarzyklus2. Darüber hinaus unterscheiden sich sowohl die angeborenen als auch die adaptiven Arme des Immunsystems zwischen den beiden Spezies3. Maushaut enthält eine einzigartige Immunpopulation von dendritischen epidermalen T-Zellen (DETCs), hat eine höhere Häufigkeit von dermalen γδ-T-Zellen und variiert in der Lokalisierung von Immunzellen im Vergleich zu menschlichem Gewebe4. Daher profitieren experimentelle Erkenntnisse zur menschlichen Hautbiologie und Entzündung von der Validierung mit menschlichem Gewebe. Während In-vitro - und Organoid-Kultursysteme weit verbreitete Werkzeuge zur Untersuchung von menschlichem Gewebe sind, sind diese Systeme durch fehlende oder unvollständige Immunrekonstitution und eine fehlende Verbindung zum peripheren Gefäßsystem begrenzt5. Das humanisierte Xenograft-Hauttransplantationsmodell zielt darauf ab, die therapeutische oder biologische Manipulation von Immun- und Nicht-Immunwegen in menschlichem Gewebe in vivo zu ermöglichen.
Das Xenograft-Modell der menschlichen Haut wurde verwendet, um die Hautphysiologie und Pharmakologie zu untersuchen, Immunabstoßung und -reaktionen zu analysieren, menschliche Hautkrebsmechanismen zu analysieren und Hautkrankheiten und Wundheilung zu verstehen6. Obwohl das Xenograft-Modell auf mehrere Bereiche der Hautforschung anwendbar ist, hat es einen geringeren Durchsatz als In-vitro-Studien und verfügt nicht über die Leichtigkeit der genetischen Manipulation, die in Mausmodellen verwendet wird. Die Zeitpunkte innerhalb dieses Modells können von Wochen bis Monaten reichen, und eine erfolgreiche Transplantation erfordert geeignete Einrichtungen und Geräte, um diese Operationen durchzuführen. Das Xenograft-Modell liefert jedoch biologischen und physiologischen Kontext für Experimente, während organoide Kultursysteme wie Gewebeexplantate oft die Replikation einer Vielzahl von beweglichen Teilen, wie z. B. exogenen Signalen, in bestimmten Zeitintervallen erfordern7. Daher wird dieses Modell am besten verwendet, um Befunde, die in vitro und in Mausmodellen beobachtet wurden, weiter zu validieren oder für Arbeiten, die ansonsten biologisch nicht machbar sind. Die angemessene Verwendung des Xenograft-Modells bietet eine einzigartige Gelegenheit, intaktes menschliches Gewebe in vivo zu untersuchen und zu manipulieren.
Die Optimierung des Xenograft-Hauttransplantationsmodells stützt sich auf jahrzehntelange Forschung, um die Integrität des Transplantats im Laufe der Zeit zu erhalten. Entscheidend für diesen Prozess ist die Verwendung der nicht-adipösen diabetischen (NOD)-scid-Interleukin-2-Gamma-Kettenrezeptor-Maus (NSG), der B- und T-adaptive Immunzellen, funktionelle NK-Zellen fehlen und die Mängel an Makrophagen und dendritischen Zellen aufweist8. Die immundefiziente Natur dieser NSG-Wirte ermöglicht die Transplantation von menschlichen hämatopoetischen Zellen, von Patienten abgeleiteten Krebserkrankungen und Haut 8,9,10. Trotz dieser immunsuppressiven Wirtsumgebung ist eine zusätzliche Unterdrückung der neutrophilen Immunantwort der Maus durch Anti-GR1-Verabreichung für den Transplantaterfolg erforderlich10. Die Haupthindernisse bei der Transplantation von intaktem Gewebe sind Infektionen, Abstoßungsreaktionen und Schwierigkeiten bei der Wiederherstellung des Blutflusses zum Transplantat, was manchmal zum Verlust der dermalen und epidermalen Integrität führt11. Techniken wie die Verabreichung von Anti-FR1 und die Verwendung einer geeigneten Transplantattiefe verbessern das Überleben des Transplantats10. Eine sorgfältige Optimierung ermöglicht es, menschliche Xenograft-Hauttransplantationen an NSG-Mäusen mit hoher Effizienz und Überlebensraten von 90% bis 100% durchzuführen.

<table><tbody><tr><td>10% neutrales gepuffertes Formalin</td><td>Fisher</td><td>SF100-20</td><td>Fixiermittel für die Histologie</td></tr><tr><td>3M Vetbond Tissue Adhesive</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>chirurgischer Kleber</td></tr><tr><td>Alexa 700 CD45 monoklonaler Antikörper (Klon 30F11)</td><td>Thermo Fischer</td><td>56-0451-82</td><td>Durchflusszytometrische Analyse: Oberflächenproteinfärbung</td></tr><tr><td>Anti-GR1-Klon RB6-8C5</td><td>BioXcell</td><td>BE0075</td><td>Anti-Abstoßung</td></tr><tr><td>APC-Maus Anti-Human-CD25&nbsp; (Klon 2A3)</td><td>BD Biosciences</td><td>340939</td><td>Durchflusszytometrie-Analyse: Oberflächenproteinfärbung</td></tr><tr><td>APC-eFluor 780 Anti-Human-HLA-DR (Klon LN3)</td><td>eBioscience</td><td>47-9956-42</td><td>Durchflusszytometrische Analyse: Oberflächenproteinfärbung</td></tr><tr><td>Autoklavenbeutel</td><td>VWR&nbsp;</td><td>89140-800</td><td>Für Autoklavierwerkzeuge und Papiertücher</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 60 Anti-Human-CD4-Antikörper (Klon OKT4</td><td>Biolegend</td><td>317438</td><td>Durchflusszytometrie-Analyse: Oberflächenproteinfärbung</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 65 Anti-Human-CD8a-Antikörper (Klon RPA-T8)</td><td>Biolegend</td><td>301042</td><td>Durchflusszytometrie-Analyse: Oberflächenproteinfärbung</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 711 Anti-Human-CD3-Antikörper (Klon OKT3)</td><td>Biolegend</td><td>317328</td><td>Durchflusszytometrische Analyse: Oberflächenproteinfärbung</td></tr><tr><td>Buprenex 0,3 mg/mL</td><td>Covetrus</td><td>059122</td><td>Analgesie</td></tr><tr><td>Carprofen 50 mg/mL</td><td>Zoetis</td><td>NADA # 141-199</td><td>Analgesie</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ IV</td><td>Worthington</td><td>4188</td><td>Hautverdauung</td></tr><tr><td>D42 Dermatomklinge</td><td>Humeca</td><td>5,D42BL10</td><td>Dermatom (1 Klinge pro Probe)</td></tr><tr><td>Dermatome D42</td><td>Humeca</td><td>4.D42</td><td>Dermatom</td></tr><tr><td>Einweg-Skalpell</td><td>Bard-Parker</td><td>371610</td><td>Hautvorbereitung</td></tr><tr><td>Präparieren von T-Pins; 1-1/2 Zoll, 1000/CS 1,5</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-10915-03</td><td>Zum Anstecken von Hautproben für Dermatome</td></tr><tr><td>Dissektionsschere</td><td>medicon</td><td>02.04.10</td><td>Probenvorbereitung und Mausdissektion</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-1G</td><td>Hautverdauung</td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3 / Transkriptionsfaktor-Fixierungs-/Permeabilisierungskonzentrat und Verdünnungsmittel</td><td>eBioscience</td><td>00-5521-00</td><td>Durchflusszytometrische Analyse: Zellfixierung und Permeabilisierung</td></tr><tr><td>eFluor-450 FOXP3 monoklonaler Antikörper (Klon PCH101)</td><td>eBioscience</td><td>48-4776-42</td><td>Durchflusszytometrische Analyse: Intrazelluläre Proteinfärbung</td></tr><tr><td>Elektrische Clippers</td><td>Kent</td><td>CL8787-KIT</td><td>Haarentfernung</td></tr><tr><td>Epredia&nbsp; Shandon Instant Eosin</td><td>Fisher Scientific</td><td>6765040</td><td>H& E</td></tr><tr><td>Epredia&nbsp; Shandon Instant Hämatoxylin</td><td>Fisher Scientific</td><td>6765015</td><td>H& E</td></tr><tr><td>FITC Anti-Human-CD45 (Klon HI30)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0459-T100</td><td>Durchflusszytometrische Analyse: Oberflächenproteinfärbung</td></tr><tr><td>Pinzetten&nbsp;</td><td>medicon</td><td>07.60.07</td><td>Probenvorbereitung und Mausdissektion</td></tr><tr><td>Gaze</td><td>Fisherbrand</td><td>22-362-178</td><td>Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>Heizlampe</td><td>Morganville Scientific</td><td>HL0100</td><td>Postoperative Pflege</td></tr><tr><td>Heizkissen 4" x 10"</td> <td>Pristech</td><td>20415</td><td>Chirurgische Wärmeversorgung</td></tr><tr><td>Insulin 1cc 12,7 mm Spritzen</td><td>BD</td><td>329410</td><td>Medikament Verabreichung</td></tr><tr><td>von Isofluran</td><td>United States Pharmacopeia (USP)</td><td>NDC 66794-013-25</td><td>Anästhesie&nbsp;</td></tr><tr><td>Isofluran-Gerät</td><td>VetEquip</td><td>911103</td><td>Anästhesie</td></tr><tr><td>Nair für Männer</td><td>Nair</td><td>&lrm; 10022600588556</td><td>Haarentfernung</td></tr><tr><td>Neomycin und Polymyxin Bisulfate und Bacitracin Zink Augensalbe</td><td>Dechra</td><td>&nbsp; NDC 17478-235-35</td><td>Augensalbe zur Verhinderung des Austrocknens</td></tr><tr><td>von NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>005557</td><td>Mäuse</td></tr><tr><td>Papierhandtücher</td><td>Kleenex</td><td>100848</td><td>Kann für sterile Oberflächen autoklaviert werden</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td>Halbtransparente Siegelfolie</td></tr><tr><td>PE Maus Anti-Human-CD127 (Klon HIL-7R-M21)</td><td>BD Biosciences</td><td>557938</td><td>Durchflusszytometrie-Analyse: Oberflächenproteinfärbung</td></tr><tr><td>PE-Cy-7 Maus Anti-Ki-67 (Klon B56)</td><td>BD Biosciences</td><td>561283</td><td>Durchflusszytometrie-Analyse: Intrazelluläre Proteinfärbung</td></tr><tr><td>PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoklonaler Antikörper (Klon 14D3)</td><td>eBioscience</td><td>46-1529-42</td><td>Durchflusszytometrische Analyse: Intrazelluläre Proteinfärbung</td></tr><tr><td>Permeabilisierungspuffer 10x</td><td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td>Durchflusszytometrische Analyse: Intrazellulär Puffer für Proteinfärbemittel</td></tr><tr><td>Petrischale 150 mm</td><td>Corning</td><td>430597</td><td>Probenlagerung</td></tr><tr><td>Plastikfolie</td><td>Fisherbrand</td><td>22-305-654</td><td>Standortvorbereitung</td></tr><tr><td>Providon-Jod-Tupfer-Stick</td><td>PDI</td><td>S41350</td><td>Sterilisation vor Ort</td></tr><tr><td>Soft-Feed und orale Hydratation (Napa Nectar)</td><td>Se Lab Group Inc</td><td>NC9066511&nbsp;</td><td>Zur Ergänzung von sich schlecht erholenden Mäusen nach der Operation</td></tr><tr><td>Probenentnahmebecher</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-150-266</td><td>Probenlagerung</td></tr><tr><td>Steriles Alkoholvorbereitungspad</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-750</td><td>Hautvorbereitung</td></tr><tr><td>Steril PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Medien für die Probenlagerung</td></tr><tr><td>Sterile Kochsalzlösung</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-4888-02</td><td>Zur Medikamentenverdünnung</td></tr><tr><td>Tegaderm Film 4" x 43/4&rdquo; &nbsp;</td><td>3M</td><td>1626</td><td>transparente Folie Wundverband</td></tr><tr><td>Vaseline Vaseline Gaze 3" x 8" &nbsp;</td><td>Kendall</td><td>414600</td><td>Wundverband</td></tr><tr><td>Violet 510 Ghost Dye&nbsp;</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>13-0870-T100</td><td>Durchflusszytometrische Analyse: Viabilitätsfarbstoff</td></tr></tbody></table>

xenograft-hautmodell zur manipulation menschlicher immunantworten in vivo

Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo

Das Xenograft-Modell der menschlichen Haut, bei dem menschliche Spenderhaut auf einen immundefizienten Mauswirt transplantiert wird, ist eine wichtige Option für die translationale Forschung in der Hautimmunologie. Murine und menschliche Haut unterscheiden sich wesentlich in der Anatomie und der Zusammensetzung der Immunzellen. Daher haben traditionelle Mausmodelle Einschränkungen für die dermatologische Forschung und Arzneimittelforschung. Erfolgreiche Xenotransplantationen sind jedoch technisch anspruchsvoll und erfordern eine optimale Vorbereitung der Proben- und Maustransplantatstelle für das Überleben des Transplantats und des Wirts. Das vorliegende Protokoll bietet eine optimierte Technik zur Transplantation menschlicher Haut auf Mäuse und diskutiert notwendige Überlegungen für nachgeschaltete experimentelle Ziele. Dieser Bericht beschreibt die geeignete Vorbereitung einer menschlichen Spenderhautprobe, die Zusammenstellung eines chirurgischen Aufbaus, die Vorbereitung von Mäusen und Operationsstellen, die Hauttransplantation und die postoperative Überwachung. Die Einhaltung dieser Methoden ermöglicht die Aufrechterhaltung von Xenotransplantaten für mehr als 6 Wochen nach der Operation. Die unten beschriebenen Techniken ermöglichen eine maximale Transplantationseffizienz aufgrund der Entwicklung von technischen Kontrollen, steriler Technik und prä- und postoperativer Konditionierung. Eine angemessene Leistung des Xenograft-Modells führt zu langlebigen menschlichen Hauttransplantatproben für die experimentelle Charakterisierung der menschlichen Haut und die präklinische Prüfung von Verbindungen in vivo.

Xenotransplantate mit menschlicher Haut wurden an NSG-Mäusen in einer Superbarriere-Tiereinrichtung durchgeführt. Der Erfolg wurde durch das verlängerte Transplantat- und Mausüberleben und die Verhaltensgesundheit von Mäusen nach der Transplantation definiert. Ein schlechtes Überleben in der Woche nach der Operation wurde zunächst als größtes Hindernis für den experimentellen Erfolg beobachtet, wobei bis zu 50% der Mäuse Euthanasie benötigten. Die Verbesserung der sterilen Technik und eine bessere Unterstützung der Körpe...

Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie menschliche Haut auf nicht-adipöse diabetische (NOD)-scid-Interleukin-2-Gamma-Kettenrezeptor-Mäuse (NSG) transplantiert werden kann. Eine detaillierte Beschreibung der Vorbereitung der menschlichen Haut für die Transplantation, der Vorbereitung von Mäusen für die Transplantation, der Transplantation der Split-Thickness der menschlichen Haut und des Wiederherstellungsverfahrens nach der Transplantation sind in dem Bericht enthalten.

Xenograft-Hautmodell zur Manipulation menschlicher Immunantworten in vivo

The human skin xenograft model, in which human donor skin is transplanted onto an immunodeficient mouse host, is an important option for translational ...

Wir skizzieren Techniken, die für das humane Xenograft-Hauttransplantationsmodell erforderlich sind, ein wichtiges Werkzeug für die Manipulation von Immun- und Nicht-Immunwegen in menschlichem Gewebe in vivo. Diese Technik rekapituliert die menschliche Hautphysiologie besser als In-vitro-Methoden und ermöglicht eine präklinische experimentelle Manipulation in vivo. Xenograft-Hauttransplantate können für präklinische Tests von Verbindungen verwendet werden, die auf menschliche Hautentzündungen in vivo abzielen.Das Verbinden von Mäusen kann besonders schwierig sein, daher empfehlen wir, den Verbandsprozess an gesunden anästhesierten Mäusen vor der Durchführung von Operationen zu üben. Um zu beginnen, bereiten Sie die menschliche Hautprobe in einer sterilisierten Unterdruck-Gewebekulturhaube auf einem sterilisierten Dissektionsbrett vor, um sie zu dermatomieren. Legen Sie die Hautprobe mit der Epidermisseite nach oben auf das Präzierbrett und wischen Sie die Epidermis mit einem sterilen Alkohol-Vorbereitungspad ab, gefolgt von PBS.Verwenden Sie nun einen 1,5 Zoll großen T-Stift, um den näheren Rand der Haut zu fixieren. Dann dermatome die Hautprobe in 400 Mikrometer Dicke und übe glei

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Allogene Hauttransplantation ist ein Standard-Modell zum Testen Host T-Zell-Antworten auf MHC-disparate Spender-Antigene. Dieses Video-Artikel bietet eine visuelle Anleitung für jeden Schritt bei der Durchführung einer BALB/c--&gt; C57BL / 6 Hauttransplantat beteiligt.

Murine Hauttransplantation

Vergleichende In vivo Studium der gp96 Adjuvantizität in the Frog Xenopus laevis</em

In diesem Video werden vom Menschen stammende Melanomzellen subkutan in die Flankenregion einer immungeschwächten Maus implantiert. Das PDX-Modell ermöglicht die präklinische Untersuchung von Melanomzellen, die die in  vivo beobachtete Tumorheterogenität und Melanomaggressivität besser rekapitulieren.

Patienten-abgeleitete Xenotransplantat-Modellierung: Eine Technik zur Generierung von Melanom-Mausmodellen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Transplantation menschlicher Haut auf eine immundefiziente Maus mit einer unterdrückten Neutrophilenreaktion. Bei der Methode wird menschliche Spalthaut auf das Transplantatbett der Maus aufgetragen, versiegelt und für die Genesung abgedeckt. Schließlich haftet die menschliche Haut an der Haut der Maus, wodurch Vaskularisierung und Durchblutung hergestellt werden, was zu einer erfolgreichen Haut-Xenotransplantation führt.

Eine Technik zur Transplantation menschlicher Haut in einem Mausmodell

Dieses Video zeigt einen Assay zur Generierung eines humanisierten Xenotransplantat-Mausmodells. Einer immungeschwächten Maus wird Cyclophosphamid injiziert, um eine Depletion der Immunzellen zu verursachen. Vom Patienten stammende Tumorzellen, die mit humanen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) in einem Hydrogel vermischt sind, werden subkutan in die Maus injiziert, wodurch ein Tumor mit infiltrierenden T-Zellen entsteht.

Eine Technik zur Generierung eines humanen PBMC-transplantierten humanisierten Xenotransplantat-Mausmodells

Hier stellen wir ein Protokoll zur Induzieren und Bewertung von Krankheiten bei einem xenogenen Transplantat-versus-Host-Krankheitsmodell (XenoGVHD) vor. xenoGVHD bietet ein In-vivo-Modell zur Untersuchung der Immunsuppression menschlicher T-Zellen. Darüber hinaus beschreiben wir, wie man menschliche T-Zellen in Geweben mit digitaler PCR als Werkzeug zur Quantifizierung der Immunsuppression erkennt.

Induktion und Bewertung der Graft-Versus-Host-Krankheit in einem xenogenen Murine-Modell und Quantifizierung menschlicher T-Zellen in Mausgeweben mit digitaler PCR

Wir beschreiben eine menschliche periphere Mononuklezelle (PBMC) – basierendes humanisiertes Xenograft-Mausmodell für translationale Immunonkologieforschung. Dieses Protokoll könnte als allgemeine Leitlinie für die Erstellung und Charakterisierung ähnlicher Modelle für die Bewertung von I-O-Therapien dienen.

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

Komplexe menschliche Krankheiten können in traditionellen Labormodellsystemen eine Herausforderung darstellen. Hier beschreiben wir einen chirurgischen Ansatz zur Modellierung menschlicher Muskelerkrankungen durch die Transplantation menschlicher Skelettmuskelbiopsien in immundefizienten Mäusen.

Durchführung von Human Skeletal Muscle Xenografts bei immundefizienten Mäusen

Die Studie zeigt die Rolle der Haut bei der Modulation der Immunantwort bei Mäusen durch epikutane (EC) Immunisierung. Die EC-Immunisierung mit einem Proteinantigen kann in Kombination mit erregerassoziierten molekularen Mustern Immunantworten bei Kontaktüberempfindlichkeit unterdrücken oder die hautinduzierte Suppression rückgängig machen. Die EC-Immunisierung ist vielversprechend und bietet einen wirksamen, nadelfreien Ansatz für die Immuntherapie.

Mausmodell der epikutan induzierten Immunmodulation

Diese Studie etabliert zwei standardisierte Maus-Xenotransplantationsmodelle, um gezielt akute zelluläre Abstoßung und akute antikörpervermittelte Abstoßung zu replizieren. Diese Modelle dienen als verlässliche Plattform zur Untersuchung von Mechanismen der Xenograft-Immunabstoßung, zur Bewertung immunsuppressiver Strategien und zur Weiterentwicklung präklinischer Xenotransplantationsforschung.

Ein standardisiertes Mausmodell mit einem drei-Personen-Arbeitsablauf zur Untersuchung akuter zellulärer und antikörpervermittelter Abstoßung bei Xenotransplantation

Lernen Sie die Xenotransplantation menschlicher Haut auf NSG-Mäuse für präklinische Studien zur Hautphysiologie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung immunologischer Reaktionen in vivo.

Xenograft-Hautmodell zur Manipulation menschlicher Immunantworten in vivo

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