Name: Chirurgisches Modell für einstufige Tissue-Engineering-Urotheltuben bei Minischweinen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-05T14:35:00.000+00:00
Duration: 4 min 5 s
Description: Erfahren Sie ein einstufiges Verfahren zur Harnableitung mit kollagenbasiertem Tubus und autologen Mikrotransplantaten bei Gottingen-Minischweinen. Diese Methode vereinfacht das Tissue-Engineering und ermöglicht die klinische Translation.

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Die Autoren danken den Mitarbeitern der Abteilung für Experimentelle Medizin (AEM) der Universität Kopenhagen für die Unterstützung bei der Planung und Durchführung von Tieroperationen und der Tierhaltung sowie ELLA-CS, s.r.o., Hradec Králové, Tschechische Republik, für die Bereitstellung von maßgeschneiderten biologisch abbaubaren Stents, die in der Studie verwendet wurden. Finanzielle Unterstützung gab es von der Schwedischen Gesellschaft für Medizinische Forschung, der Stiftung Promobilia, der Rydbeck-Stiftung, der Samariten-Stiftung, der Stiftung für pädiatrische Gesundheitsversorgung, der Stiftung Frimurare Barnhuset in Stockholm und der Novo Nordisk Stiftung (NNFSA170030576).

Dieses Experiment wurde in einer AAALAC-akkreditierten Versuchseinrichtung in Übereinstimmung mit der europäischen Gesetzgebung über die Verwendung von Tieren im Labor und nach ethischer Genehmigung des dänischen Ministeriums für Ernährung und Landwirtschaft (Ref.-Nr. 2022-15-0201-01206) durchgeführt.
1. Chirurgischer Eingriff
<ol><li>Zubereitung von Tieren<ol><li>Schnell ein weibliches, ausgewachsenes Göttinger Minischwein für mindestens 12 h präoperativ.</li>
		<li>Bereiten Sie den Operationstisch mit allen sterilen Utensilien wie unten beschrieben vor.</li>
		<li>Bei ausgewachsenen Minischweinen in Standardgröße sedieren Sie das Tier durch intramuskuläre Injektion mit 1,0-1,4 ml/10 kg mit einer Lösung von 125 mg Zolazepam und 125 mg Tiletamin, suspendiert in 1,25 ml Ketamin (100 mg/ml), 6,25 ml Xylazin (20 mg/ml), 1,25 ml Methadon (10 mg/ml) und 2 ml Butorphanol (10 mg/ml) (später als Sedierungsmischung bezeichnet).</li>
		<li>Führen Sie eine visuell geführte endotracheale Intubation durch. Bestätigung der Anästhesie durch Vitalparameter und Augen- und Interdigitalreflextests. Tragen Sie die Augensalbe beidseitig auf.</li>
		<li>Legen Sie beidseitige Ohrvenenkatheter an und halten Sie die Narkose mit Propofol (10-15 mg/kg/h) und Fentanyl (5-15 mg/kg/h) aufrecht.</li>
		<li>Legen Sie einen 8-Fr-Harnkatheter an und füllen Sie die Blase mit 250 ml isotonischer Kochsalzlösung mit einer Luer-Lock-Spritze in geeigneter Größe.</li>
		<li>Bringen Sie das Schwein in die Rückenlage, dann zerreißen und schrubben Sie den Bauch. Nach zwei weiteren Runden der Hautreinigung mit 70 % Ethanol wird das Operationsfeld mit einem sterilen Tuch umrahmt.</li>
	</ol></li>
	<li>Gewebeentnahme und chirurgische Gerüstimplantation<ol><li>Führen Sie eine standardmäßige Laparotomie der unteren Mittellinie mit Skalpell und Kauter durch, teilen Sie Haut, Muskeln und Bauchfell und ziehen Sie die intraperitoneale Harnblase zur Wunde.</li>
		<li>Führen Sie eine prophylaktische Blutstillung an der vorderen Blasenwand durch und exzitieren Sie ein 2 cm2 großes vollwandiges Segment, wobei eine proximale Öffnung von 1 cm2 verbleibt, während die verbleibende Blasenwand mit einer schnell resorbierbaren geflochtenen Laufnaht verschlossen wird.</li>
		<li>Präparieren Sie vorsichtig die Schleimhautschicht der resezierten Probe und zerkleinern Sie eine 2 cm2 Schleimhautprobe in 1 mm2 Mikrotransplantate für die Gerüsteinbettung (siehe unten in Abschnitt 2).</li>
		<li>Nach Fertigstellung des Gerüsts anastomosieren Sie das röhrenförmige Konstrukt mit einer langsam resorbierbaren monofilen Laufnaht an der verbleibenden Öffnung an der vorderen Blasenwand.</li>
		<li>Verwenden Sie einen Peritoneallappen aus dem Schamband, um das röhrenförmige Gerüst zu flicken, und setzen Sie einen intraluminalen 14 Fr antegrade Dickdarmeinlauf (ACE) Stopper in das röhrenförmige Gerüst ein.</li>
		<li>Verschließen Sie das distale Ende des Kanals mit einer langsam resorbierbaren monofilen 4-0-Naht, um ein Austreten von Urin zu verhindern, und injizieren Sie insgesamt 250 ml sterile Kochsalzlösung mit Spritzen über den Blasenkatheter, um die Anastomosendurchgängigkeit zu bestätigen.</li>
		<li>Präparieren Sie einen transfaszialen Kanal stumpf lateral zur Mittellinie, 2-3 cm kaudal zur kaudalen Brustdrüse auf der rechten Seite, und platzieren Sie den Kanal in einer subkutanen Tasche. Fixieren Sie den distalen Kanal mit zwei transkutanen, nicht resorbierbaren monofilen Nähten, um die Stelle auf Hauthöhe zu markieren.</li>
		<li>Verschließen Sie die vordere Muskelfaszie des Bauchmuskels mit einer langsam resorbierbaren monofilen Laufnaht, passen Sie die Unterhaut mit einer schnell resorbierbaren geflochtenen Laufnaht an und verschließen Sie die Haut mit einer nicht resorbierbaren monofilen Laufnaht.</li>
		<li>Nach Absetzen der Anästhesie extubieren Sie das Tier und beobachten Sie es in den Ställen, bis es vollständig gehfähig und sicher in der Lage ist, zu trinken und zu fressen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Gerüstbau
<ol><li>Vorbereitung des Verbundgerüsts<ol><li>Bereiten Sie vor der Operation (maximal 2 Stunden) eine flüssige Lösung aus Rattenschwanzkollagen Typ I vor, wie zuvor beschrieben17. Kurz gesagt, fügen Sie der Kollagenlösung 4:1 mindestens 10x essentielles Medium (MEM) hinzu und nähern Sie sich dem pH-Wert auf 7,4 mit 1 M NaOH und fügen Sie schließlich 1x MEM hinzu, mit dem Ziel, eine endgültige Kollagenkonzentration von 1,64 mg/ml zu erreichen. Bewahren Sie die Lösung bis zur weiteren Verwendung in einem sterilen Fläschchen auf Eis auf.</li>
		<li>Nach der chirurgischen Geweberesektion und Zerkleinerung werden die Schleimhautpartikel (d. h. Mikrotransplantate) mit einer Pinzette manuell auf ein 2 cm x 6 cm großes, biologisch abbaubares Netz mit einer Expansionsrate von 1:6 gelegt (z. B. wird ein 2 cm2 großes Schleimhautgewebe auf ein 12 cm2 großes Netz expandiert).</li>
		<li>Bereiten Sie eine sterile rechteckige Stahlform mit den Maßen 1 cm x 3 cm x 6 cm (Höhe x Breite x Länge) auf einer sterilen Stahlplatte vor und legen Sie das Netz mit den Mikrotransplantaten nach oben in die Stahlform. Gießen Sie vorsichtig 20 ml der Kollagenlösung in die Form und achten Sie darauf, dass die Mikrotransplantate nicht vom Netz gespült werden. Das gesamte Konstrukt in eine sterile Heizkammer mit 38 °C Temperatur überführen und fünf Minuten lang erstarren lassen.</li>
		<li>Nach ausreichender Erstarrung schieben Sie das Hydrogel auf ein Nylonnetz, das auf einer perforierten Stahlplatte ruht, und entfernen Sie vorsichtig die Form.</li>
		<li>Stoßen Sie Wasser aus dem Hydrogel aus, indem Sie ein Nylonnetz und dann eine Stahlplatte auf das Gel legen und dann passiv mit einem Gewicht von 120 g (in diesem Fall entspricht der zum Einbetten verwendeten Stahlform) für 5 Minuten auf die Stahlplatte komprimieren.</li>
		<li>Rollen Sie nach der Kompression das abgeflachte Gerüst um einen biologisch abbaubaren Stent, wobei die Mikrotransplantate dem Stent zugewandt sind, messen Sie 5 cm x 0,6 cm (Länge x Innendurchmesser) und nähen Sie das Gerüst in Längsrichtung mit einer langsam resorbierbaren monofilen Laufnaht. Der fertige Schlauch ist nun bereit für die chirurgische Implantation.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Postoperatives Management
<ol><li>Analgesie und Antibiotikaprophylaxe<ol><li>Verabreichen Sie Buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg/8 h intravenös) für die ersten 3 Tage, Meloxicam (0,4 mg/kg/Tag intramuskulär oder oral) für die ersten 4 Tage und Trimethoprim (2,7 mg/kg/Tag intramuskulär oder 4,2 mg/kg/Tag oral) und Sulfadoxin (13,3 mg/kg/Tag intramuskulär oder 20,8 mg/kg/Tag oral) für die ersten 5 Tage. Verabreichen Sie die intramuskulären Injektionen postoperativ, während das Tier noch anästhesiert ist.</li>
		<li>Bringen Sie die Tiere in Einzelständen, um ein Knabbern der äußeren Venenkatheter und des Nahtmaterials zu vermeiden. Bieten Sie Sichtkontakt mit benachbarten Minischweinen durch Plexiglasfenster und die Möglichkeit des Schnauzenkontakts zwischen den Buchten. Täglich frisches Stroh und Heu sowie Spielzeug und Wasserversorgung ad libitum bereitstellen und zweimal täglich füttern.</li>
		<li>Überwachen Sie die Tiere täglich auf natürliches Verhalten, Fressgewohnheiten, Urin- und Stuhlproduktion und beurteilen Sie wöchentlich das Körpergewicht.</li>
		<li>Am Ende des Beobachtungszeitraums (6 Wochen) sedieren Sie die Tiere mit 1-1,4 ml/10 kg intramuskulärer Injektion eines Sedierungsgemisches und beenden Sie das Tier mit einer letalen Pentobarbital-Injektion (100 mg/kg intravenös).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Obduktion
<ol><li>Grobstoffliche Anatomie<ol><li>Nach der Terminierung präparieren Sie den distalen Conduit auf Hauthöhe und entfernen Sie den ACE-Stopfen. Verschließen Sie die Harnröhre mit einer Kunststoffklammer und injizieren Sie 250 mL einer 1:20-Kontrastlösung von Iohexol in isotonischer Kochsalzlösung über die distale Leitungsöffnung mit einem Katheter.</li>
		<li>Beurteilen Sie das Tier mit einem 64-Zeilen-Computertomographen. Visualisieren Sie Bilder mit multiplanarer Rekonstruktion und analysieren Sie alle Bilder mit medizinischer Bildverarbeitungssoftware.</li>
		<li>Führen Sie eine endoskopische Untersuchung der Blase und der Conduit lumina mit einem 16,2 Fr flexiblen Zystoskop über die native Harnröhre durch.</li>
		<li>Sezieren Sie die Leitung en bloc und bewerten Sie dabei alle groben anatomischen Befunde sorgfältig. Zusätzlich werden vollwandige Blasenbiopsien mit einem Rand von 2 cm zur Leitungsanastomose reseziert und auf ähnliche Weise für Referenzwerte verarbeitet.</li>
	</ol></li>
	<li>Histologische Aufbereitung<ol><li>Fixieren Sie die herausgeschnittene Probe 24 Stunden lang in 10 % Formalin.</li>
		<li>Teilen Sie den Conduit orthogonal mit einem Skalpell in gleich große separate Abschnitte aus proximalen, medialen und distalen Conduit-Segmenten. Dehydrieren Sie die Proben mit steigenden Ethanolkonzentrationen und betten Sie sie in Paraffin ein, bevor Sie sie in Mikrotome schneiden.</li>
		<li>Färben Sie 5-μm-Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) und Pancytokeratin CK-AE und scannen Sie mit einem digitalen Histologie-Objektträgerscanner.</li>
	</ol></li>
</ol>

Zugang zum Kollagengerüst für die einstufige Harnableitungsoperation bei Schweinen

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<li>Cranidis, A., Nestoridis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Urogynecol+J+Pelvic+Floor+Dysfunct%22%5BJournal%5D)">Bladder augmentation.</a> Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 11 (1), 33-40 (2000).</li>
<li>Atala, A., Bauer, S. B., Hendren, W. H., Retik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+gastric+augmentation+on+bladder+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">The effect of gastric augmentation on bladder function.</a> J Urol. 149 (5), 1099-1102 (1993).</li>
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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Dieses Protokoll stellt eine einfache und zugängliche Technik für zukünftige rekonstruktive Operationen dar. Ein häufiger Nachteil beim Tissue Engineering, einschließlich der autologen Zellexpansion, sind die teuren und umfangreichen Vorbereitungsschritte, die vor der chirurgischen Implantation erforderlich sind. Die autologe Mikrotransplantation kann viele dieser Schritte vereinfachen und möglicherweise einstufige Verfahren ermöglichen. Durch die Autotransplantation komplexer histologischer Einheiten wird eine pro-regenerative parakrine Signalgebung induziert18. In früheren Studien haben wir die Erfahrung gemacht, dass Mikrotransplantate allein anfällig für die physikalische Umgebung sind, wenn sie nicht angemessen an einem Gerüst befestigt sind15,19. Kollagen wurde als praktikable Umgebung für die Gewebeexpansion in vitro untersucht und wurde aufgrund seiner günstigen Biokompatibilität und kommerziellen Verfügbarkeit für unseren Zweck ausgewählt. Das hier vorgestellte Kompositgerüst wurde zuvor in In-vitro-Experimenten optimiert, in denen Variationen in der Mikrotransplantateinbettung und den Kollagenkonzentrationen untersuchtwurden 20,21,22. Vor der In-vivo-Testung wurden die Gerüsteigenschaften hinsichtlich Permeabilität, Biomechanik und Abbau in vitro bewertet 20. Darüber hinaus wurde die in vivo Gerüst-basierte Gewebeexpansion zuvor in Nagetier- und Kaninchenmodellen validiert21,22.
Das chirurgische Modell wurde gewählt, um eine röhrenförmige Version des Gerüsts zu evaluieren, die das klinische Setting einer Harnablenkung bei neurogener Blasenfunktionsstörung bei pädiatrischen oder jugendlichen Patienten nachahmt. Zu den kritischen Schritten gehören die exakte Dissektion der Schleimhaut-Mikrotransplantate und die Aufrechterhaltung einer feuchten Umgebung vom Zeitpunkt der Resektion bis zur Einbettung des Gerüsts. Ein weiterer kritischer Schritt ist die richtige Hydrogelverfestigung; Sorgfältiges Pipettieren des Kollagens stellt sicher, dass sich keine Luftblasen im Gel bilden, und die richtigen Temperatureinstellungen und Komponentenlösungen sorgen dafür, dass sich das Gel richtig verfestigt. Wenn es nicht gelingt, ein verfestigtes Gel zu erhalten, erhöht sich das Risiko einer Kollagendelamination und einer Ablösung von Mikrotransplantaten. Für den chirurgischen Teil ist eine sorgfältige Handhabung während der Implantation entscheidend, um eine Beschädigung der Mikrotransplantate durch mechanisches Trauma oder Dissoziation zu vermeiden. Vor dem Verschluss des Bauches sollte die Durchgängigkeit der Flüssigkeit sorgfältig behoben werden, indem die Blase mit Flüssigkeit insuffliert wird.
Zu den Einschränkungen der Technik gehört die Dicke des Gerüsts, die intuitiv Obergrenzen für die Diffusion von Nährstoffen aus der äußeren Umgebung zu den Mikrotransplantaten hat. Auf der anderen Seite kann eine Verringerung der Gerüstdicke zu einer unangemessen hohen Durchlässigkeit und Urinverlust führen. Unsere aktuelle Zusammensetzung basiert auf früheren In-vitro-Bewertungen , bei denen die Zellregeneration in unterschiedlichen Kollagenkonzentrationen verglichen wurde20. Die Mikrotransplantation von autologem Gewebe stützt sich ebenfalls auf gesundes Transplantatgewebe, so dass das derzeitige Verfahren für bösartige Erkrankungen, bei denen das Risiko einer erneuten Krebstransplantation nicht ordnungsgemäß ausgeschlossen werden kann, ungeeignet ist23; Nichtsdestotrotz wurde die derzeitige Technik für Fälle mit funktionellen Entleerungsbehinderungen entwickelt, bei denen dies nicht als Risiko angesehen wird. Obwohl das Modell mehrere Schritte aus dem klinischen Umfeld nachahmt (d. h. das Verfahren der Appendicovesikosotomie), wird in diesem Experiment kein voll funktionsfähiges Stoma für die Harnableitung verwendet, da der Kanal distal ligiert ist. Da klinische Komplikationen lebenslang auftreten können, kann ein 6-wöchiger Beobachtungszeitraum nur begrenztes Wissen über spezifische Ergebnisse bei Strikturen und Kontinenz liefern. Daher könnte der Studie eine zusätzliche 6-monatige Nachbeobachtungszeit hinzugefügt werden, nachdem der verheilte Kanal auf Hautebene anastomosiert wurde.
Die Perspektive dieser Technik bezieht sich auf das einfache Design, das universelle Anwendungen ermöglicht, falls das aus Mikrotransplantatgewebe stammende und unterstützende Biomaterial durch andere relevante Alternativen ersetzt wird. Diese Komponenten können modifiziert werden, um organspezifischen Zwecken in Bezug auf Gerüstfestigkeit, Elastizität und biologischen Abbau gerecht zu werden. Schließlich ermöglichen die zugänglichen und kostengünstigen Kosten eine Reproduzierbarkeit und eine breitere Übersetzung der Technik.

Bei urogenitalen Fehlbildungen kann eine rekonstruktive Operation erforderlich sein, um die funktionelle Anatomie wiederherzustellen, oft bei einer lebenswichtigen Indikation 1,2. Konventionelle chirurgische Ansätze haben native Gewebe aus anderen Organsystemen (wie dem Magen-Darm-Trakt) verwendet, um die missgebildeten oder fehlenden Organe zu rekonstruieren. Allerdings oft mit dem Risiko schwerer postoperativer Komplikationen 3,4. Bei der Harnableitung bei Patienten mit neurogener Blasenfunktionsstörung, die eine Langzeitkatheterisierung benötigen, werden häufig der Blinddarm oder neu zugeschnittene Dünndarmsegmente verwendet, um einen Harnkanal zu konstruieren 5,6. Das Tissue Engineering bietet eine alternative Gewebetransplantation, die auf organspezifische Eigenschaften zugeschnitten werden kann und dadurch die postoperative Morbidität für die Patienten minimiert 7,8. Während Gerüste verschiedener Art allein implantiert werden können, hat sich gezeigt, dass eine zusätzliche Gerüstzellularisierung, vorzugsweise mit autologen Zellen, die regenerativen Ergebnisse nach der Implantation verbessert 9,10,11,12,13,14. Nichtsdestotrotz bestehen Tissue-Engineering-Gerüste oft aus komplexen und kostspieligen Komponenten, und zum anderen sind die Anforderungen an die ex vivo-Zellkultivierung und die Gerüstaussaat aufwendig und ressourcenintensiv. Diese Faktoren haben die klinische Umsetzung von Tissue-Engineering-Gerüsten trotz mehrerer Jahrzehnte der Forschung in diesem Bereich behindert. Durch die Reduzierung der Komplexität sowie der monetären und materialistischen Anforderungen könnten Tissue-Engineering-Gerüste in der modernen Chirurgie auf breiter Ebene eingesetzt werden, wobei sowohl seltene als auch häufigere Eingriffe abgedeckt werden können.
Kollagen wurde zuvor als praktikable Plattform für die Zellexpansion etabliert und wirkt darüber hinaus als günstiger Bioklebstoff beim Befestigen von Zellen oder Gewebe an einem Gerüst für die chirurgische Implantation 15,16,17. Bei der perioperativen autologen Mikrotransplantation wird die Notwendigkeit einer ex vivo-Zellkultivierung umgangen, indem das interessierende Gewebe während des primären Eingriffs entnommen und direkt wieder implantiert wird. Durch das Zerkleinern des resezierten Gewebes in kleinere Partikel wird die Oberfläche und das Wachstumspotenzial vergrößert, was ein größeres Expansionsverhältnis auf das Gerüst18 ermöglicht. Das kollagenbasierte Gerüst haftet nicht spezifisch an urogenitalen Rekonstruktionen, kann aber theoretisch auf mehrere Bereiche der Rekonstruktion von Hohlorganen angewendet werden.
In diesem Manuskript präsentieren wir sowohl ein Protokoll für die Konstruktion eines röhrenförmigen Gerüsts, das Kollagen mit eingebetteten autologen Urothel-Mikrotransplantaten kombiniert, als auch ein Minipig-Modell, das die technische Machbarkeit und Sicherheit sowie die regenerative Leistung des Gerüsts in vivo bewertet. Das Modell wurde an 10 ausgewachsenen weiblichen Minischweinen unter Verwendung des hier vorgestellten Protokolls und der hier vorgestellten Methode evaluiert. Der Hauptvorteil des Gerüsts ist die Einfachheit des Konstrukts und die einstufige Implantation, die dem Patienten mehrere nachfolgende chirurgische Eingriffe erspart. Der Eingriff kann in konventionellen chirurgischen Umgebungen von regulärem chirurgischem Personal durchgeführt werden und erfordert Standardgeräte und -materialien. Das Tiermodell ermöglicht eine kontrollierte Umgebung für die Untersuchung der Implantation, während das Tier bereitwillig zu seinem normalen Verhalten zurückkehrt, mit der zusätzlichen Möglichkeit, Variationen am Gerüst und am Verfahren vorzunehmen.

<table><tbody><tr><td>10x MEM</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>2517592</td><td>Kollagenpräparat</td></tr><tr><td>1x MEM</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>2508924</td><td>Kollagenpräparat</td></tr><tr><td>Ambu aScope 4 Cysto</td><td>Ambu A/S, Ballerup, DK</td><td>1000682507</td><td>Cystoscope</td></tr><tr><td>Aquaflush ACE Stopper</td><td>Abena, Taastrup, DK</td><td>ACE12/220501</td><td>ACE Stopper</td></tr><tr><td>Borgal vet inj opl 200 + 40 mg/mL</td><td>Ceva Animal Health A/S</td><td>510460</td><td>Sulfonamid / Trimethoprim</td></tr><tr><td>Bupaq multidose vet 0,3 mg/mL</td><td>Salfarm Danmark A/S, DK 502763</td><td></td><td>Buprenorphin</td></tr><tr><td>Butomidor vet inj 10 mg/mL</td><td>Salfarm Danmark A/S, DK 531943</td><td></td><td>Buthorphanol</td></tr><tr><td>Comfortan vet inj 10 mg/mL</td><td>Dechra Veterinary Products A/S, DK 492312</td><td></td><td>Metadone</td></tr><tr><td>Ethilon Naht 3-0</td><td>Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, USA</td><td>SGBCXV</td><td>Monofilament nicht resorbierbares</td></tr><tr><td>Fentanyl inj 50 & micro; g/mL(hamel)</td><td>Hameln Pharma ApS, DK</td><td>432520</td><td>Fentanyl</td></tr><tr><td>Ketador vet inj 100 mg/mL</td><td>Salfarm Danmark A/S, DK</td><td></td> 115727 <td>Ketamin</td></tr><tr><td>Metacam inj 20 mg/mL t.Rind/Schwein/Pferd</td><td>Boehringer Ingelheim Animal, DE</td><td>6443</td><td>Meloxcicam</td></tr><tr><td>Metacam Suspension zum Einnehmen 15 mg/ml Schweine</td><td>Boehringer Ingelheim Animal, DE</td><td>482780</td><td>Meloxcicam</td></tr><tr><td>Omnipaque</td><td>GF Healthcare, Oslo, NO</td><td>16173849</td><td>Kontrastmittel für CT</td></tr><tr><td>Pancytokeratin CK-AE</td><td>DAKO Agilent, US</td><td>GA053</td><td>Klon AE1/AE3</td></tr><tr><td>PDS Naht 3-0</td><td>Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, USA</td><td>SEMMTQ</td><td>Monofilament langsam resorbierbares</td></tr><tr><td>Prolene-Nahtmaterial 4-0</td><td>Ethicon, Johnson & Ltd Johnson, New Brunswick, US</td><td>PGH187</td><td>Monofilament nicht resorbierbares</td></tr><tr><td>Propolipid t.inj/inf 10 mg/mL</td><td>Fresenius Kabi, DK</td><td>21636</td><td>Propofol</td></tr><tr><td>Rattenschwanzkollagen Typ I</td><td>First Link Ltd, Wolverhampton, UK</td><td>60-30-810</td><td>2,06 mg/ml Protein in 0,6 % Essigsäure</td></tr><tr><td>Suprim vet&nbsp; 20 + 100 mg (Lösung zur Verwendung im Trinkwasser)</td><td>Dechra Veterinary Products A/S, DK</td><td>33661</td><td>Sulfonamid/Trimethoprim</td></tr><tr><td>SX-ELLA Abbaubarer biliärer DV-Stent</td><td>ELLA-CS, Trebes, CZ</td><td>S23000056-01</td>&<td>oslash; 6 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>Vicryl-Netz</td><td>Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, USA</td><td>VM1208</td><td>Mesh</td></tr><tr><td>Vicryl Naht 4-0</td><td>Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, USA</td><td>SMBDGDR0</td><td>Geflochtenes, schnell resorbierbares</td></tr><tr><td>Xysol vet inj 20 mg/mL</td><td>ScanVet Animal Health A/S, DK</td><td>54899</td><td>Xylazin</td></tr><tr><td>Zoletil 50 vet plv/sol t.inj 25 + 25 mg/mL</td><td>Virbac Danmark A/S, DK</td><td></td> 568527 <td>Tiletamine und Zolazepam</td></tr></tbody></table>

chirurgisches modell für einstufige tissue-engineering-urotheltuben bei minischweinen

Surgical Model for Single-Staged Tissue-Engineered Urothelial Tubes in Minipigs

Rekonstruktive Operationen werden oft durch einen Mangel an Transplantationsgewebe erschwert. Bei der Behandlung von urogenitalen Fehlbildungen ist die konventionelle Lösung die Entnahme von Magen-Darm-Gewebe für die nicht-orthotope Rekonstruktion, da es zur Wiederherstellung der normalen Funktion des Patienten im Überfluss vorhanden ist. Die klinischen Ergebnisse nach der Neuanordnung von nativem Gewebe im Körper sind oft mit einer signifikanten Morbidität verbunden; Das Tissue Engineering birgt daher ein spezifisches Potenzial in diesem Bereich der Chirurgie. Trotz erheblicher Fortschritte haben sich Tissue-Engineering-Gerüste noch nicht als valide chirurgische Behandlungsalternative etabliert, was vor allem auf die kostspieligen und komplexen Anforderungen an Material, Produktion und Implantation zurückzuführen ist. In diesem Protokoll stellen wir ein einfaches und zugängliches kollagenbasiertes röhrenförmiges Gerüst vor, das in autologe organspezifische Gewebepartikel eingebettet ist und als Kanal für die Harnableitung konzipiert ist. Das Gerüst wird während des primären chirurgischen Eingriffs konstruiert, besteht aus allgemein verfügbaren chirurgischen Materialien und erfordert konventionelle chirurgische Fähigkeiten. Zweitens beschreibt das Protokoll ein Tiermodell, das entwickelt wurde, um die kurzfristigen In-vivo-Ergebnisse nach der Implantation zu bewerten, mit der Möglichkeit zusätzlicher Variationen des Verfahrens. Ziel dieser Veröffentlichung ist es, das Verfahren Schritt für Schritt zu demonstrieren, mit besonderem Augenmerk auf die Verwendung von autologem Gewebe und einer tubulären Form.

In dieser Studie wird eine in vivo Urothelgewebsexpansion in einem kollagenbasierten röhrenförmigen Gerüst erreicht. Durch die Einbettung des Gerüsts mit autologen Gewebepartikeln, die perioperativ entnommen und verarbeitet werden, ermöglicht das Verfahren eine einstufige Gerüstimplantation, ohne dass eine begleitende immunsuppressive Behandlung postoperativ erforderlich ist. Die chirurgische Handhabung wird durch die Verstärkung des Gerüsts mit einem biologisch abbaubaren Netz und Stent ermöglicht (Abbildung 1). Nach 6-wöchiger Beobachtung ergab die makroskopische Gewebebeurteilung keine Anzeichen einer Abstoßung oder Infektion durch den Wirt, und das röhrenförmige Gerüst zeigte sich offen und ungehindert (Abbildung 2). Aus histologischen Untersuchungen geht hervor, dass ein geschichtetes luminales Epithel Urothel-Ursprungs das gesamte Gerüst bedeckt, und Reste der verstärkenden Biomaterialien sind nach 6 Wochen immer noch sichtbar (Abbildung 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66936/66936fig01.jpg"> Abbildung 1: Gerüstbau und Implantation. Das Blasengewebe wird perioperativ präpariert (oben links). Die gehackten Schleimhaut-Mikrotransplantate werden auf ein chirurgisches Netz (oben Mitte) expandiert und in verfestigtes Kollagen eingebettet (oben rechts). Das Kollagen wurde komprimiert, um Wasser auszustoßen, und ein Stent wird vorbereitet (unten links). Das Gerüst wird rohrförmig um den Stent herum angeordnet und ein ACE-Stopper wird in den Stent eingesetzt (unten Mitte). Die Blase wird teilweise verschlossen und das Konstrukt schließlich an der ursprünglichen Stelle der Gewebeexzision (unten rechts) in die Blase eingebaut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66936/66936fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66936/66936fig02.jpg"> Abbildung 2: Gerüstmakroskopische Auswertung. Nach 6 Wochen wird das Tier eingeschläfert und das Gerüst (Pfeil) auf Hauthöhe (oben links) präpariert. Die Blase wird mit Kontrastmittel gefüllt (gelb) und es wird eine CT-Untersuchung durchgeführt, um den Kanal (Pfeil) auf Durchgängigkeit und Anzeichen von Strikturbildung zu untersuchen (oben rechts). Eine Blasenspiegelung wird über die Harnröhre durchgeführt, um die Blase und die Anastomose (Pfeil) nach 6 Wochen zu beurteilen (unten links). Der Schlauch wird noch einmal auf Durchgängigkeit geprüft, indem ein Katheter (Pfeil) über die äußere Öffnung in die Blase (unten rechts) eingeführt wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66936/66936fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66936/66936fig03.jpg"> Abbildung 3: Gerüstmikroskopische Auswertung. Der resezierte Schlauch wird fixiert, und es werden orthogonale Querschnitte durchgeführt, um den Schlauch in proximal-distaler Richtung zu beurteilen. Nach 6 Wochen wird das Conduit-Lumen (1) ausgewertet, um die Epithelisierung zu bestätigen (obere Vergrößerung). Reste des biologisch abbaubaren Stents (2) und der Netzmaterialien (vergrößerte Unterseite) sind an dieser Stelle noch sichtbar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66936/66936fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Tissue-Engineering-Implantate für die rekonstruktive Chirurgie kommen aufgrund der aufwendigen Ex-vivo-Kultivierung , die komplexe und teure Gerüstkomponenten umfasst, selten über präklinische Studien hinaus. Hier stellen wir ein einstufiges Verfahren vor, das für die Harnableitung konzipiert ist, mit einem zugänglichen röhrenförmigen Gerüst auf Kollagenbasis, das autologe Mikrotransplantate enthält.

Chirurgisches Modell für einstufige Tissue-Engineering-Urotheltuben bei Minischweinen

Reconstructive surgeries are often challenged by a lack of grafting tissue. In the treatment of urogenital malformations, the conventional solution has ...

surgical-model-for-single-staged-tissue-engineered-urothelial-tubes

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Blasentumoren sind bei weiblichen Mäusen in eine minimal-invasive Weise durch Katheterisierung, lokale Verätzungen und späteren Haftung von Karzinomzellen, um den Brennvorgang Standorten etabliert.

Einem orthotopen Modell des Murine Blasenkrebs

Die etablierte Technik, um primäre invasive orthotopen Blasenkrebs Xenografts impfen erfordert Laparotomie und Mobilisierung der Blase. Dieses Verfahren verursacht eine signifikante Morbidität auf Mäuse, ist technisch anspruchsvoll und zeitaufwendig. Wir haben deshalb eine hohe Präzision, die perkutane Ansatz verwendet Ultraschallkontrolle.

Minimal Invasive Gründung von murinen orthotopen Blasen Xenografts

Das murine Modell der irreversiblen einseitigen Harnleiterobstruktion (UUO) wird zusammen mit dem Modell der reversiblen UUO vorgestellt, bei dem die Harnleiterobstruktion durch Anastomose des durchtrennten Harnleiters in die Blase aufgehoben wird. Diese Modelle ermöglichen die Untersuchung von Nierenentzündungen und Narbenbildung sowie des Gewebeumbaus.

Ein Mausmodell der irreversiblen und reversiblen Einseitige Ureterobstruktion

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Auswertung der Prozedur für die Durchführung einer wachen Zystometrie in einem Mausmodell

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Induktion einer Harnröhrenstriktur mit anschließender Urethroplastik der Wangenschleimhauttransplantation im Rattenmodell

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein schrittweises, reproduzierbares Modell der einseitigen Harnleiterobstruktion.

Ein unreifes Mausmodell einer reversiblen einseitigen Harnleiterobstruktion

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