Mechanismus der Hemmung der Podozyten-Apoptose durch Kemeng Fang bei Ratten mit membranöser Nephropathie über den PI3K/AKT-Signalweg

Der Schwerpunkt dieser Studie befasst sich mit dem Mechanismus der traditionellen chinesischen Medizin bei der Behandlung der membranösen Nephropathie. Mit experimentellen Methoden wird nachgewiesen, dass die Traditionelle Chinesische Medizin bei der Behandlung von MN eine nicht zu vernachlässigende Rolle spielt. Um den Mechanismus des Traumas bei der Behandlung von MN zu klären.

Es gibt viele Schritte, auf die Sie achten sollten, wie z. B. die Spannung und Zeit während der Elektrophorese sowie die Übertragung, die Konzentration und die Reaktionszeit von primären und sekundären Antikörpern usw., die sich auf Ihr Endergebnis auswirken.

Durch experimentelle Forschung wurde bestätigt, dass die Verschreibung die Podozyten-Apoptose verlangsamen und die MN verbessern kann, indem sie den PI3K AKT-Signalweg aktiviert. Moderne Forschungsmethoden wurden verwendet, um die Wirksamkeit der Verbindung der traditionellen chinesischen Medizin und die machbare Richtung für die Behandlung von MN zu bestätigen.

[Erzähler] Zu Beginn besorgen Sie sich das kationisierte Rinderserumalbumin oder C-BSA. Zur Vorimmunisierung der Ratte fassen Sie mit der linken Hand die Rückenhaut und drehen Sie den Bauch nach oben, wobei die Bauchhaut gestrafft wird. Injizieren Sie den C-BSA-Emulgator mit einer 2,5-Milliliter-Spritze subkutan in die Achselhöhle und die Leiste der Ratte. Für eine formelle Immunisierung nehmen Sie die Ratten aus ihren Käfigen und legen Sie sie mit dem Schwanz zum Experimentator auf den Drahtstangendeckel. Wischen Sie den Schwanz der Ratte mit einem Alkohol-Wattebausch ab und kneifen Sie beide Seiten des Schwanzes der Ratte mit dem Daumen und Zeigefinger der linken Hand zusammen, um die Vene zu füllen und sie nach oben zu halten. Halten Sie eine Ein-Milliliter-Spritze in der rechten Hand, so dass die Nadel in einem Winkel von 30 Grad zur Schwanzvene steht. Halten Sie nach dem sanften Einstechen in die Haut die Nadelspitze nach oben abgeschrägt und die Nadel parallel zum Gefäß. Drücken Sie dann mit einem trockenen Wattebausch etwa eine Minute lang auf den Injektionspunkt, um Blutungen zu stoppen. Nachdem sich das Tier erholt hat, fassen Sie mit der linken Hand die Haut der Ratte auf ihrem Rücken. Drehen Sie den Bauch nach oben und straffen Sie die Haut. Halten Sie die Nadel einer 10-Milliliter-Spritze in der rechten Hand und führen Sie sie von einer Seite in das Maul der Ratte ein, gleiten Sie entlang des Gaumens, der hinteren Rachenwand und weiter zum Magen. Verabreichen Sie mit dem Zeigefinger der rechten Hand jeder Tiergruppe langsam die entsprechenden Medikamente für eine Gesamtdauer von vier Wochen. Ziehen Sie die Magennadel heraus, nachdem die Verabreichung abgeschlossen ist. Zu Beginn wird das Nierengewebe für biochemische Assays von der membranösen nephropathischen Ratte gewonnen, die mit KMF behandelt wurde. Geben Sie 500 Mikroliter der vorbereiteten Lyselösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 100 Milligramm gefrorenes Nierengewebe in das Röhrchen mit der Lyselösung und mahlen Sie es gründlich mit einer Hochgeschwindigkeits-Gewebeschleifmaschine, bis keine sichtbare Gewebemasse mehr vorhanden ist. Legen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen 30 Minuten lang auf Eis und zentrifugieren Sie es dann 10 Minuten lang bei 15.984 g. Saugen Sie den Überstand an und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration gemäß den Anweisungen des Bicinchoninsäure-Proteinkonzentrations-Assay-Kits und fügen Sie PBS-Lösung tropfenweise hinzu, um eine konsistente Proteinkonzentration in jeder Gruppe zu gewährleisten. Inkubieren Sie dann die Probe 15 Minuten lang mit 5x Protein-Upsampling-Puffer bei 100 Grad Celsius, um die Proteine vollständig zu denaturieren. Trennen Sie die Proteine durch 12,5 % SDS-PAGE-Gelelektrophorese, zuerst mit 80 Volt und dann mit 130 Volt, bis das Bromphenolblau aus dem Boden der Gelplatte ausläuft. Befeuchten Sie das Filterpapier nach dem Entfernen des Gels mit Membrantransferpuffer. Aktivieren Sie die Membran aus Polyvinylidenfluorid oder PVDF in Methanol für 30 Sekunden. Ordnen Sie dann das Schwammnetz, das Filterpapier, das Gel und die PVDF-Membran für den Transfer in den Clip ein. Legen Sie das Gel in den Minuspol und die PVDF-Membran in den Pluspol, um die Membran 90 Minuten lang mit einem Strom von 200 Milliampere zu übertragen. Entfernen Sie dann die PVDF-Membran und waschen Sie sie einmal fünf Minuten lang mit TBST. Die Verschlusslösung bei Raumtemperatur unter 90-minütigem Schütteln zugeben. Dann dreimal jeweils fünf Minuten lang mit TBST waschen. Inkubieren Sie die Membran mit den Primärantikörpern über Nacht in einer Nassbox bei vier Grad Celsius. Nach dreimaligem Waschen mit TBST wird der Sekundärantikörper in einer Verdünnung von eins bis 10.000 Tropfen zugegeben und 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Dann dreimal jeweils drei Minuten lang mit TBST waschen. Entwickeln Sie schließlich mit der Entwicklungslösung die Membran auf der Maschine gemäß den Anweisungen. Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte die Modellgruppe einen signifikanten Anstieg der Expressionsniveaus von PI3K, PIK3CA, AKT, Phospho-AKT, BAD, BAX und C-Caspase-3, während die Expressionsniveaus von Phospho-BAD und BCL2 signifikant abnahmen. Die KMF-Behandlung reduzierte die Expressionsniveaus von PI3K, PIK3CA, AKT, Phospho-AKT, BAD, BAX und C-Caspase-3 und erhöhte die Expressionsniveaus von Phospho-BAD und BCL2.