In vivo und in vitro Infektion von Kartoffelwurzeln mit pflanzenparasitären Nematoden zur Beurteilung induzierter Strukturveränderungen

Das Protokoll beschreibt die Infektion der Wurzeln von Solanum tuberosum mit pflanzenparasitären Nematoden unter in vivo Gewächshausbedingungen und von in vitro transgenen Wurzeln von Kartoffeln für die histochemische Analyse der Wurzelstruktur durch optische Mikroskopie.

Die Forschung zu parasitären Nematodeninfektionen in Kulturpflanzen wird von der Variabilität der Umweltbedingungen beeinflusst, was sich erheblich auf die experimentellen Ergebnisse und die Reproduzierbarkeit der Daten auswirken kann.

Wir haben In-vitro-Kulturen von transgenen Wurzeln von Kartoffeln mit pflanzenparasitären Nematoden als zuverlässige Alternative entwickelt, die weniger Platz benötigt, weniger Zeit für die Gewinnung benötigt und frei von Kontamination oder genetischer Variabilität des Wirts ist.

Die Verfolgung des zeitlichen Fortschreitens der Nematodeninfektion in den Wurzeln der Kulturpflanzen ist nach wie vor eine Herausforderung. Differentielle Färbetechniken bieten eine zuverlässige Methode, um Infektionsstellen zu identifizieren und die Lebensstadien von Nematoden präzise zu unterscheiden.

Im Vergleich zu Gewächshausversuchen unterstützen kartoffelschwere Wurzeln ein kontinuierliches und kontrolliertes System, das alle Stadien der Nematodenentwicklung unabhängig von saisonalen oder klimatischen Schwankungen ermöglicht.

Das beschriebene Protokoll bietet also mehrere vielversprechende zukünftige Anwendungen. So ermöglicht es beispielsweise, die molekularen und zellulären Mechanismen detailliert zu untersuchen und Einblicke in die Art und Weise zu erhalten, wie pflanzenparasitäre Nematoden Wirte infizieren und manipulieren.

[Erzähler] Waschen Sie zunächst eine Karotte unter fließendem Leitungswasser und dann mit einer gängigen Waschmittellösung, um Rückstände zu entfernen. Nach dem Trocknen mit Küchenpapier führst du einen sterilisierten Metallspieß etwa ein bis zwei Zentimeter nach innen in die Oberseite der Karotte ein. Befeuchten Sie die Karotte mit einer Waschflasche mit einer Düse mit 96 % Ethanol. Tupfen Sie die untere Spitze der Karotte auf ein sterilisiertes Filterpapier. Führen Sie es dann vorsichtig durch eine Flamme. Mit einem sterilen Sparschäler die Karotte von oben nach unten schälen und das Abflammen wiederholen. Nachdem Sie den oberen und unteren Teil entsorgt haben, legen Sie den mittleren Teil in eine sterile Petrischale. Schneiden Sie mit einer sterilen Klinge und einer Pinzette einen Zentimeter dicke Abschnitte ab. Übertragen Sie die Schnitte in sterile Petrischale. Nachdem Sie die Platte versiegelt haben, halten Sie sie auf jeder Seite 60 Minuten unter UV-Licht, um die Karottenscheiben zu sterilisieren. Inkubieren Sie die Karottenscheiben bei 25 Grad Celsius im Dunkeln für ein bis zwei Wochen. Machen Sie dann mit einer sterilen Klinge einen X-förmigen Schnitt in der Mitte der Karottenscheibe und schneiden Sie nur halb tief. Pipettieren Sie 50 Mikroliter Nematodensuspension mit mindestens 50 gemischten Lebensstadien in den Schnitt. Nachdem Sie die Petrischale verschlossen haben, inkubieren Sie sie bei 25 Grad Celsius im Dunkeln bis zu drei Monate lang. Um die Nematoden der Wurzelläsionen zu extrahieren, geben Sie die Karottenscheiben mit sichtbarer Nekrose in ein 75-Mikrometer-Maschensieb mit acht Zentimetern Durchmesser, das in eine sterile Glasschüssel gegeben wird. Gießen Sie anschließend eine Antibiotikalösung über das Sieb, bis die Scheiben bedeckt sind. Nach der Inkubation über Nacht im Dunkeln verwenden Sie eine sterilisierte Pipette, um die Nematoden vom Boden der Schüssel in einen sterilisierten Glasfärbeblock zu übertragen. Pipettieren Sie einen Milliliter Antibiotikalösung in den Färbeblock und lassen Sie die Nematoden 30 bis 40 Minuten lang einwirken. Pipettieren Sie die verwendete Antibiotikalösung aus und wiederholen Sie den Waschvorgang vier- bis fünfmal. Verwenden Sie die Nematodensuspension für Wurzelläsionen sofort oder lagern Sie sie bei 11 Grad Celsius. Wählen Sie Kartoffelknollen der gleichen Größe aus und entsorgen Sie alle mit Löchern, Druckstellen oder weichen Stellen. Füllen Sie fünf Liter Töpfe mit einer Eins-zu-Eins-Mischung aus Autoklaviererde und Sand und mischen Sie 22,5 Gramm NPK-Dünger mit langsamer Freisetzung unter. Säen Sie die Kartoffeln dann in einer Tiefe von neun Zentimetern unter der Erdoberfläche aus. Stellen Sie die Töpfe in ein Gewächshaus mit einer Luftfeuchtigkeit von 50 bis 70 %. Gießen Sie häufig, um die Bodenfeuchtigkeit bei 70 % der maximalen Wasserspeicherkapazität zu halten und extreme Temperaturen zu vermeiden. Sobald die Kartoffelpflanzen aufgegangen sind, legen Sie gleichmäßig verteilte vier bis sechs Löcher um jede Pflanze an, um die Tiefe zu sehen. Pipettieren Sie acht Milliliter Suspension mit 30.000 lebenden Nematoden mit gemischten Wurzelläsionen im Lebensstadium in die Löcher. Decken Sie dann die Löcher mit Erdmischung ab. Bei Kontrolltöpfen und Töpfen, die Nematoden für Wurzelläsionen enthalten, ist die Bewässerung am Tag der Impfung nicht zu unterbrechen. Nach zwei Monaten Kultur entwurzeln Sie die Kartoffelpflanzen und trennen die Triebe und Wurzeln zum Wiegen. Waschen Sie das Wurzelsystem sorgfältig. Untersuchen Sie die Wurzeln auf RLN-Angriffsstellen mit geeigneten Färbetechniken. Legen Sie die gewaschenen und sterilisierten Kartoffelknollen in einen Behälter. Bedecken Sie die Knollen mit einer 25%igen handelsüblichen Bleichlösung. Den Behälter verschließen und 15 Minuten lang mixen. Sobald das Bleichmittel entsorgt ist, spülen Sie die Knollen dreimal mit sterilisiertem Leitungswasser aus. Tauchen Sie die Knollen anschließend in einer Strömungshaube 15 Minuten lang unter kräftigem Rühren in 80%ige Ethanollösung. Nach dem Pipettieren des Ethanols dreimal mit sterilisiertem Leitungswasser spülen. Entfernen Sie mit einem sterilen Skalpell die peripheren Teile der Knollen. Das innere Mittelstück in 0,5 Zentimeter dicke Segmente schneiden. Um die Schnitte zu impfen, mischen Sie zunächst einen Milliliter Rhizobium rhizogenes-Suspension mit neun Millilitern SH-Medium. Tauchen Sie die Spitze eines sterilen Skalpells in die verdünnte Suspension und wickeln Sie die Oberfläche der Kartoffelsegmente fünfmal. Sobald die Segmente getrocknet sind, legen Sie sie auf halbfestes SH-Medium und inkubieren Sie drei Tage lang bei 25 Grad Celsius im Dunkeln, um die Plasmidtransfektion zu erleichtern. Am Ende des dritten Tages werden die infizierten Segmente auf Platten mit halbfestem SH-Medium übertragen, das mit Antibiotika versetzt ist. Verwenden Sie nach drei Monaten eine sterile Pinzette, um einen ein Gramm schweren Cluster transgener Wurzeln zu sammeln. Übertragen Sie die Wurzeln mit frischem, halbfestem, antibiotikafreiem SH-Medium in die Mitte der Platte. Um die Nematoden-Eimassen zu sammeln, besorgen Sie sich die Wurzelgallen. Verwenden Sie eine sterile Pinzette mit ultrafeiner Spitze, um die Eimassen vorsichtig unter einem binokularen Stereomikroskop mit 20-facher Vergrößerung zu extrahieren. Legen Sie die Eimassen in eine abgedeckte Petrischale mit fünf Millilitern sterilem Leitungswasser und lassen Sie sie 48 Stunden lang schlüpfen. Anschließend pipettieren Sie in einer Strömungshaube fünf Milliliter der J2-Suspension, die 100 Nematoden pro Milliliter enthält, auf ein 20-Mikrometer-Maschensieb. Tauchen Sie nach dem Waschen mit sterilem Leitungswasser die untere Hälfte des Siebs mit J2-Nematoden in eine 20%ige Wasserstoffperoxidlösung und mischen Sie es 15 Minuten lang in kreisenden Bewegungen. Geben Sie steriles Leitungswasser durch das Sieb über die Nematoden und wiederholen Sie den Waschvorgang zweimal. Kippen Sie das Sieb so, dass sich die Nematoden beim letzten Waschen am Rand sammeln. Pipettieren Sie dann einen Milliliter steriles Reinstwasser vom Siebrand, um die Nematoden zu gewinnen. In einer Fließhaube wird ein ein Gramm schwerer Klumpen transgener Kartoffelwurzeln auf SH-Platten mit 100 sterilen Nematoden subkultiviert. Überwachen Sie die Co-Kultur regelmäßig unter einem inversen Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung. Wenn Eimassen sichtbar werden, subkulturieren Sie die Wurzeln auf eine neue SH-Mediumplatte. Die Verwendung von Karottenscheiben führte zu einer durchschnittlichen 100-fachen Zunahme der Nematodenpopulationen innerhalb von drei Monaten. Kartoffelpflanzen zeigten keine sichtbaren Symptome bei geringer Anzahl von Nematodenpopulationen mit Wurzelläsionen. Nach der Färbung mit saurem Fuchsin wurden mehrere Lebensstadien von Pratylenchus penetrans in der Wurzelrinde beobachtet, was auf eine Penetration des Gewebes und die damit verbundenen nekrotischen Läsionen in infizierten Bereichen hindeutet. Die Entwicklung transgener Wurzeln der Kartoffel zeigte ein anfängliches Wachstum der Zellmasse entlang skalpellinduzierter Wunden in der Kartoffelknollensektion, gefolgt von der Entstehung transgener Wurzeln. Im Nährmedium wurde ein anhaltendes Wachstum der Wurzeln beobachtet und die Wurzelklumpen wurden erfolgreich auf ein frisches Kulturmedium übertragen, um das Wachstum fortzusetzen. Transgene Wurzelkulturen von Kartoffeln wurden erfolgreich mit Meloidogyne chitwoodi Jungtieren im zweiten Stadium infiziert, um Pflanzennematoden-Cokulturen zu etablieren. In den infizierten Kulturen wurden Wurzelgallen mit adulten Weibchen und Eimassen beobachtet. Gallengewebe, das von Meloidogyne chitwoodi gebildet wurde, war nach Infektion transgener Kartoffelwurzeln sichtbar, wobei unterschiedliche Stadien der Nematodenentwicklung und -fortpflanzung erkennbar waren, einschließlich der Bildung von Eimassen und Eiern.