Im lebenden Organismus Kalzium-Bildgebung von geschmacksinduzierten neuronalen Reaktionen bei adulten Drosophila

Unser Labor nutzt die Fruchtfliege als Modellorganismus, um zu untersuchen, wie Geschmacksinformationen durch neuronale Schaltkreise verarbeitet werden, von der Erkennung von Chemikalien bis hin zu den Auswirkungen auf das Verhalten. Wir verwenden dieses Bildgebungsprotokoll, um Geschmackszellen zu identifizieren, die auf Aminosäuren reagieren, und um festzustellen, ob verschiedene interne Zustände die Reaktion von Geschmackszellen auf diese essentiellen Nährstoffe modulieren. Ein Vorteil dieses Calcium-Imaging-Ansatzes besteht darin, dass er die Aufzeichnung von geschmacksinduzierten neuronalen Reaktionen von spezifischen Zellen bei wachen Tieren ermöglicht, bei denen die inneren Zustände intakt bleiben.

Wir können nun mutmaßliche Geschmacksschaltkreise im neuen Drosophila-Konnektom des gesamten Gehirns identifizieren und die funktionelle neuronale Dynamik in vivo mit diesem Calcium-Imaging-Ansatz verifizieren. Zu Beginn legen Sie die betäubte Fliege unter ein Präpariermikroskop. Entfernen Sie mit einer Präparierschere die Mittel- und Hinterbeine am Oberschenkelgelenk und die vier Beine am Trochanter.

Nehmen Sie die Fliege mit einer stumpfen Pinzette an den Flügeln auf, um sie mit dem Kopf über dem anvisierten Gebärmutterhalsschlitz der Bildgebungskammer zu positionieren, während Sie den Körper unten halten. Schieben Sie mit der stumpfen Seite der Schere und der stumpfen Pinzette den Kopf und den Thorax gleichzeitig vorsichtig in den Schlitz. Sobald sich der Flügel sicher im Schlitz befindet, schieben Sie ihn nach hinten und positionieren Sie ihn vorsichtig neu, sodass er zur Vorderseite der Kammer zeigt.

Sammeln Sie ein kleines Tröpfchen Nagellack auf das Ende eines Zahnstochers und tragen Sie eine dünne Schicht auf, um den Kopf der Fliege in der Bildgebungskammer zu befestigen. Nimm den Wachser mit einer Hand an und sammle ein kleines Tröpfchen Wachs auf der Spitze. Greifen Sie hingegen mit einer halbscharfen Pinzette nach einer Oberkieferpalpe und ziehen Sie den Rüssel vorsichtig heraus und halten Sie ihn in voller Streckung.

Berühre die Spitze des Wachsers mit der Kammer in der Nähe der Basis des Rüssels, bis das Wachs zu fließen beginnt. Bewegen Sie sich, um Kontakt mit der Basis des Rüssels herzustellen und auf halber Höhe des Schaftes zu wachsen, wobei Sie den Kontakt mit den Labellusillen vermeiden sollten. Strecken Sie dann den Rüssel so gerade wie möglich vollständig aus.

Legen Sie nun die montierten Fliegen für 60 Minuten in eine Feuchtigkeitskammer, um sich zu erholen. Entfernen Sie die Fliegen aus der Feuchtigkeitskammer. Kneifen Sie mit einer sehr scharfen Pinzette beide Antennen ab, kneifen Sie die Nagelhaut zusammen, um ein Loch zu erzeugen, und führen Sie eine Seite der scharfen Pinzette ein.

Führen Sie die Pinzette unter die Nagelhaut, um sie aus der Region zu entfernen, die den interessierenden Hirnbereich bedeckt. Um das exponierte Gehirn zu waschen, geben Sie etwa 100 Mikroliter künstliche Hämolymphlösung oder AHL auf den Kopf. Entfernen Sie nach dem Waschen das AHL und lassen Sie eine dünne Schicht zurück, um ein Austrocknen des Gehirns zu verhindern.

Entfernen Sie mit einer scharfen Pinzette Luftsäcke und alle großen Ablagerungen, die das Gehirn bedecken. Um die subösophageale Zone (SEZ) spezifisch abzubilden, schneiden Sie die Speiseröhre an der Basis in der Nähe des Rüssels und an der Stelle, an der er durch das Gehirn verläuft, mit einer sehr scharfen Pinzette. Entfernen Sie dieses Teil, um die SWZ freizulegen.

Positionieren Sie den 10 x 20 Millimeter großen Deckdeckel unter dem Präpariermikroskop in den abgewinkelten Schlitz der Bildgebungskammer. Laden Sie etwa zwei Mikroliter Wasser oder eine andere Negativkontrolle in das Kapillarrohr. Lokalisieren Sie die präparierte Fliege und fokussieren Sie sich mit einem 10-fachen Luftimmersions-Hellfeldobjektiv auf das Labellum.

Richten Sie die Kapillare unter der 10x-Ansicht mit dem Labellum aus. Verlassen Sie die Kapillarposition direkt vor der Labellum und stellen Sie sicher, dass sie sich in der Nähe, aber nicht berührend befindet. Bewegen Sie die Bühne, um die interessierende Gehirnregion zu zentrieren.

Wechseln Sie zu einem Wasserimmersionsobjektiv mit höherer Vergrößerung, wie z. B. dem 40-fach-Objektiv. Geben Sie etwa 200 Mikroliter AHL auf das Gehirn, um den Kontakt mit dem Immersionsziel sicherzustellen. Schalten Sie auf 488 Nanometer Laserleistung um, um die GCaMP-Expression im interessierenden Bereich zu lokalisieren.

Nachdem Sie mindestens fünf Sekunden Ausgangsfluoreszenz gesammelt haben, bewegen Sie den Stimulator manuell so, dass die Kapillare das Labellum fünf Sekunden lang bedeckt. Entfernen Sie den Reiz und fahren Sie so lange wie gewünscht mit der Aufnahme fort. Entfernen Sie als Nächstes das AHL und kehren Sie zum 10-fachen Hellfeld zurück, um zu bestätigen, dass der Deckglas, der Stimulator und das Labellum in der richtigen Position bleiben.

Entfernen Sie dann die Bildgebungskammer und verwenden Sie ein fusselfreies Tuch, um die erste Lösung aus der Kapillare zu entfernen. Spülen Sie die Pipette mit Wasser und pipettieren Sie etwa zwei Mikroliter des nächsten Geschmacks in das Kapillarröhrchen. Die relative Fluoreszenzänderung bei Gr64f GCaMP-Fliegen war bei der Saccharosestimulation signifikant höher als bei Wasser, was eine starke und anhaltende Reaktion der rezeptor-Neuronen des süßen Geschmacks zeigt.

Die relative Spitzenfluoreszenz für die Saccharosestimulation war signifikant größer als die für Wasser. Die Fluoreszenzänderung bei Gr66a GCaMP-Fliegen war bei der Koffeinstimulation signifikant höher als bei Wasser, was eine Reaktion auf den Beginn und die Entfernung von Koffein zeigt. Das Projektionsmuster der Axonendigungen in Gr66a-Fliegen unterschied sich von dem von Gr64f, was die anatomische Segregation von Bitter- und Zucker empfindenden Geschmacksrezeptorneuronen zeigt.