Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)
20. Oktober 2008
Dieses Video zeigt neue Kultur, eine Methode, durch die Hühnerembryonen außerhalb der Eizelle bis zu 24 h kultiviert. Diese Methode ermöglicht ein bis frühen Entwicklung (Primitivstreifens bis 14 som.), Ein Zeitraum entsprechend E7-9 in der Maus zu studieren. Anwendungen dieser Technik sind die Elektroporation, in situ Hybridisierung und Immunhistochemie.
Dieses Verfahren beginnt mit der Isolierung des Eies von der Schale. Der Dottersack wird um das Ei geschnitten und die Membran geschält und über ein Uhrglas gelegt. Ein Ring wird über den Embryo gelegt.
Die Vilin-Membran wird über den Ring gehoben. Der Embryo wird in eine Kulturschale überführt. Die Kulturschale wird in eine Kulturbox überführt, die in einen Inkubator gestellt wird, und der Embryo wird kultiviert.
Hallo, ich bin Delphine von der Ture Brick Finn am Center for Environmental and Genomic Medicine an der Texas a and m University in Houston. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Kultivierung von Wangenembryonen außerhalb der Eizelle. Wir verwenden dieses Verfahren im Labor, um die Auswirkungen von Antiepileptika auf die U-Entwicklung im Wangenembryo zu untersuchen.
Also lasst uns loslegen. Dieses Embryokulturprotokoll beginnt mit Eiern, die 16 Stunden lang auf der Seite in einem befeuchteten Inkubator inkubiert wurden, bis hin zu Hamburgern und Hamilton. Stufe vier.
Um das Ei zu öffnen, klopfen Sie mit einer Pinzette auf die Schale und entfernen Sie Teile der Schale rund um die Schale. Entfernen Sie die Oberseite der Schale und entsorgen Sie sie im vierten Stadium HH. Der Embryo ist fast zwei Millimeter lang, hat einen gut definierten primitiven Streifen und ist von einer birnenförmigen Zona umgeben. Lucita.
Sammeln Sie das dünne Albumin, indem Sie die untere Schale auf die Seite kippen. Entfernen Sie dann das dicke Albumin mit einer Pinzette. Legen Sie den Embryo in eine Plastikschale in die Pyrex-Schale, die Panik-Compton-Kochsalzlösung enthält.
Zum Schluss entfernen Sie das restliche Albumin mit einer Pinzette. Nun ist der Embryo bereit, auf einem Ring zentriert zu werden. Der nächste Schritt besteht darin, den Embryo auf einen Ring zu setzen.
Kippen Sie dazu zunächst den Dottersack mit einer feinen Schere nach oben, sodass der Embryo nach oben zeigt. Schneide den Dottersack auf oder unter der Höhe des Äquators ein. Schälen Sie die Vilin-Membran schnell mit der Pinzette.
Richten Sie die Membran so aus, dass sie körnig oder nicht glänzend ist. Platzieren Sie die Membran auf dem Uhrglas. Platzieren Sie dann einen Glasring auf der Vilin-Membran und zentrieren Sie den Embryo.
Heben Sie zum Schluss die Membran an den Rändern des Glasrings an. Entfernen Sie diese Baugruppe aus der Kochsalzschale. Übertragen Sie es dann auf ein Mikroskop, um die Einrichtung der Kultur abzuschließen.
Die Embryokultur wird unter einem Präparierfernrohr aufgebaut. Stellen Sie mit einer feinen Pinzette sicher, dass die Zottenmembran fest über den Glasring angehoben wird. Schneiden Sie die überschüssige Zillinmembran von der Innenkante des Glasrings ab.
Achten Sie darauf, die Membran nicht mit der Pipette oder Pinzette zu durchstechen. Entfernen Sie anschließend die Kochsalzlösung mit einer sterilen Weidepipette vom äußeren Rand des Rings. Spülen Sie den Embryo vorsichtig mit Kochsalzlösung ab.
Um Dotterzellen und loses Membranmaterial zu entfernen, geben Sie 200 Mikroliter Kochsalzlösung an den äußeren Rand des Rings. Dies erleichtert den Transfer in eine Kulturschale. Decken Sie die Baugruppe schließlich mit einer umgedrehten Falcon 35-Millimeter-Kulturschale ab.
Jetzt ist der Embryo bereit, kultiviert zu werden. Um die Kultur des Embryos zu beginnen, geben Sie 2,5 Liter dünnes Albumin in eine Falcon 35-Millimeter-Kulturschale. Geben Sie anschließend 200 Mikroliter dünnes Albumin auf den inneren Rand des Deckels der Kulturschale.
Dadurch wird die Kulturkammer versiegelt und eine Austrocknung des Embryos mit einer feinen Pinzette verhindert. Legen Sie den Embryo frei, indem Sie den Glasring am Rand des Uhrglases entlang schieben und die Montage in die Kulturschale übertragen. Entfernen Sie alle Salzreste von der Innenfläche des Rings mit einer Pasteurpipette.
Decken Sie die Schale mit einem Deckel ab und legen Sie den Embryo in eine befeuchtete Kammer. Der Embryo kann bis zu 24 Stunden bei 38 Grad Celsius kultiviert werden. Nachdem der Embryo 24 Stunden lang kultiviert wurde, kann er in Paraformaldehyd fixiert werden.
Bei anderen Verfahren, wie z. B. der In-situ-Hybridisierung, die im begleitenden Video beschrieben wird, nehmen Sie die Kultur aus dem Inkubator und legen Sie sie sofort auf Eis. Füllen Sie die Kulturschale mit eiskaltem PBS oder einem desy PBS, wenn die Embryonen für die In-situ-Hybridisierung aufbereitet werden sollen. Lösen Sie den Embryo mit einer Pinzette von der Vilinmembran.
Übertragen Sie den Embryo mit dem stumpfen Ende einer Weidepipette in eine frische Kulturschale mit Eis. Kaltes PBS oder desy PBS. Stecken Sie den Embryo mit einer stumpfen Pinzette fest und saugen Sie das PBS aus der Schale.
Frisch zubereitetes Eiskalt dazugeben. Das Fixiermittel Paraformaldehyd ist hochgiftig. Daher sollten diese Schritte in einer Chemikalienhaube mit Schutzbrille und Handschuhen durchgeführt werden.
Die Fixierungszeit und -temperatur hängen von der Anwendung ab, die für die In-situ-Hybridisierung verwendet werden soll. Über Nacht bei vier Grad Celsius für die Kryosektion fixieren. Fixieren Sie für sechs bis acht Stunden bei vier Grad Celsius für die gesamte Mount Immunohisto-Chemie.
Nach dem Fixieren für die entsprechende Zeit eine Stunde bei Raumtemperatur fixieren, die Fixierlösung entfernen und ordnungsgemäß als chemischen Abfall entsorgen. Dann die Form mit eiskaltem PBS oder dey PBS füllen. Wenn der Embryo für die In-situ-Hybridisierung oder Immunfärbung verwendet werden soll, ist es wünschenswert, den Kopf und das Herz mit einer Nadel oder einem Mikrodissektionsmesser zu durchstechen.
Dadurch wird verhindert, dass diese Strukturen in späteren Schritten die Sonde oder den Antikörper einfangen. Nachdem wir nun das Verfahren zur Fixierung von Embryonen durchlaufen haben, werfen wir einen Blick darauf, wie dieses Kultursystem verwendet werden kann, um Zellmigrationen in vitro zu verfolgen, bevor der Embryo kultiviert wird. Am Ende der Kulturperiode hat sich der Embryo zu HH 10 entwickelt, einer Länge von zwei bis drei Millimetern, und ist in der Mitte der Kulturschale sichtbar.
Es ist möglich, eine Gruppe von Zellen kurz vor der Kultur mit Carbo-Sanin, einem fluoreszierenden Farbstoffauge, zu markieren und ihre Bewegung während der gesamten Kultur zu verfolgen. In diesem Fall wurden Zellen unterhalb des Henson-Knotens mit Dai beschriftet. Es hat sich gezeigt, dass diese Zellen dazu beitragen, dass sich Somiten progressiv entwickeln und sich Somiten entwickeln.
Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Hühnerwurzeln außerhalb des Eies kultivieren können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, so schnell wie möglich zu arbeiten, um den Kontakt des Embryos mit der Raumtemperatur zu minimieren. Das war's also.
Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Übersicht
Dieses Video zeigt eine Methode zur Kultivierung von Hühnerembryonen außerhalb des Eis für bis zu 24 Stunden, die es ermöglicht, frühe Entwicklungsstadien zu untersuchen. Diese Technik eignet sich für verschiedene experimentelle Verfahren, einschließlich Elektroporation und Immunhistochemie.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Entwicklungsbiologie
- Embryologie
- Experimentelle Techniken
Hintergrund
- Hühnerembryonen stellen ein Modell zur Untersuchung der Wirbeltierentwicklung dar.
- Das Verständnis der frühen Entwicklungsstadien ist entscheidend für die Entwicklungsbiologie.
- Techniken wie die Elektroporation können zur gezielten Manipulation embryonaler Zellen angewandt werden.
- Mithilfe der Immunhistochemie ist die Visualisierung spezifischer Proteine während der Entwicklung möglich.
Zweck der Studie
- Die neue Kulturmethode für Hühnerembryonen demonstrieren.
- Die Untersuchung früher Entwicklungsprozesse ermöglichen.
- Verschiedene experimentelle Anwendungen in der Embryologie erleichtern.
Verwendete Methoden
- Isolierung des Eies aus der Schale.
- Öffnen des Dottersacks und Abziehen der Membran.
- Überführen des Embryos in eine Kulturschale.
- Inkubation der Kulturschale in einer kontrollierten Umgebung.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht eine erfolgreiche Kultivierung von Embryonen für bis zu 24 Stunden.
- Embryonen können für verschiedene experimentelle Techniken manipuliert werden.
- Frühe Entwicklungsstadien können effektiv beobachtet und untersucht werden.
- Zu den Anwendungen gehören die In-situ-Hybridisierung und die Immunhistochemie.
Schlussfolgerungen
- Die neue Kulturmethode ist ein wertvolles Werkzeug für die Forschung in der Entwicklungsbiologie.
- Sie liefert Einblicke in die frühe embryonale Entwicklung.
- Diese Technik kann experimentelle Ansätze in der Embryologie verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Diese ex vivo Hühnerembryokulturmethode ermöglicht die direkte Beobachtung früher Entwicklungsprozesse und unterstützt die Zielvalidierung in Entwicklungsprozessen, die für die Forschung zu angeborenen Störungen relevant sind. Durch die Aufrechterhaltung der Embryovitalität für bis zu 24 Stunden bietet sie ein reproduzierbares System zur mechanistischen Risikominderung von Substanzen, die die Embryogenese beeinflussen. Der Ansatz verbindet in vitro Modelle mit der Komplexität in vivo und bietet einen prädiktiven Wert für die präklinische Bewertung entwicklungstoxikologischer Wirkungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Genfunktion in der frühen Embryogenese durch Elektroporation von Nukleinsäurekonstrukten.
- Operationaler Wert: Unterstützt die phänotypische Untersuchung der Wirkung von Substanzen auf die Bildung der Primitivstreife und die Keimblattmusterung.
- Strategischer Wert: Erleichtert die Bewertung der Zielgenauigkeit in Signalwegen, die Somitogenese und Organogenese steuern.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet ein transparentes, zugängliches System für quantitative Immunhistochemie- und In-situ-Hybridisierungsanalysen an Ganzpräparaten.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Embryobearbeitung und Kulturbedingungen für reproduzierbare Untersuchungen zur Wirkstoffexposition.
- Strategischer Wert: Ermöglicht eine skalierbare Bewertung entwicklungsbiologischer Biomarker über verschiedene Behandlungsgruppen hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erhält die physiologische Relevanz des Hühnerembryos als Wirbeltiermodell für die Prüfung entwicklungstoxischer Wirkungen.
- Operativer Wert: Ermöglicht die kontinuierliche Nutzung vom frühen Screening bis hin zu GLP-konformen Embryotoxizitätstests.
- Strategischer Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem teratogene Potenziale früh im Entwicklungsprozess erkannt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in Entdeckungsbiologie-Arbeitsabläufe, indem sie ein veränderbares System zur Klärung von Signalwegen vor den Stadien der Leitstruktur-Optimierung bereitstellt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Entwicklungsgennetzwerken durch zeitlich gesteuerte Kultur und Fixierung.
- Screening: Ermöglicht quantitative, räumliche Aussagen über Veränderungen der Proteinexpression nach Behandlung mit Wirkstoffen.
- Analytik: Erzeugt messbare Entwicklungsendpunkte (z. B. Somitenanzahl, Schließen des Neuralrohrs) zur Modellierung von Dosis-Wirkungs-Beziehungen.
- Translationale Forschung: Verbindet frühe Einblicke in Wirkmechanismen mit Modellen der Fetalentwicklung über konservierte Wirbeltiersignalwege.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine standardisierte Embryologieplattform, die in mehreren therapeutischen Bereichen zur Untersuchung von Entwicklungsmechanismen eingesetzt werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen bei Studien zur Modulation von Entwicklungsprozessen.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Reproduzierbarkeit durch standardisierte Explantation und Abdichtung der Kulturkammer.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem embryotoxische Risiken vor Investitionen in Säugetiermodelle identifiziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die Priorisierung von Substanzen mit günstigen Entwicklungsverträglichkeitsprofilen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im mikrochirurgischen Umgang mit Embryonen und steriler Technik.
- Benötigt präzise Instrumente (Glasringe, Pasteur-Pipetten, befeuchtete Kammern).
- Setzt eine Standardisierung der Inkubationszeiten und der Albumin-Zubereitung über verschiedene Anwender hinweg voraus.
- Zu berücksichtigende Anpassungsaspekte sind artenspezifische Membraneigenschaften und Grenzen der Kulturdauer.
- Praktische Einschränkungen ergeben sich aus der Zerbrechlichkeit der Embryonen während der Übertragung und ihrer Empfindlichkeit gegenüber Temperaturschwankungen.
