Banca cerebro y el muestreo sistemático de la materia biológica constituye la base para estereología imparcial y maximiza el potencial de los datos obtenidos de cada ejemplar.
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Artículo de método
Banca cerebro: Aprovechar al máximo las muestras de su investigación
En este artículo
Resumen
Resumen
Estereología imparcial es un método de forma precisa y eficiente la estimación del número de neuronas total (o otro tipo de células) en un área de interés
Protocolo
Parte 1: Pre-procesamiento de tejidos
- Tejido debe ser buena perfusión con paraformaldehído, glutaraldehído, o formalina. Esto se puede lograr a través de la perfusión estándar transcardial normalmente se utiliza para la cosecha de otros órganos. En el presente estudio el tema fue profundamente sedado con clorhidrato de ketamina (10 mg / kg, im), sacrificados con una sobredosis de pentobarbital sódico (25 mg / kg, iv) y perfundidos transcardially con PBS 0,1 M hasta que esté completamente desangrado. Esto es seguido por una solución de paraformaldehído al 4% en PBS durante 5 minutos (aproximadamente 1 litro).
- El cerebro debe ser stereotaxically bloqueado, removido del cráneo, pesado y determinado volumen 2. El tejido debe ser crioprotegieron en soluciones de sacarosa calificado con una concentración final de 30% de sacarosa en tampón fosfato. Bloques de tejido deberá congelarse en isopentano a -65 º C y almacenadas a -80 ° C hasta que esté listo para cortar.
Parte 2: Muestreo sistemático
- El muestreo sistemático se basa en un plan adecuado antes de cortar. Toda la región de interés, tanto en la extensión rostral-caudal y dorsal-ventral deben estar bien definidos. Un atlas estereotáxico de la especie en uso es útil para definir la región de interés y para determinar la longitud de la región de interés. Una vez que la longitud de la región de interés se determina que es necesario establecer el intervalo de muestreo. Por ejemplo, desde el atlas estereotáxico a determinar que todo el rostro-caudal extensión de la región de interés es de aproximadamente 3 mm de longitud cuando se corte en el plano coronal. A continuación, decide establecer el criostato a la sección a 50 micras, a este paso, tendrá 60 secciones que abarcan la extensión rostral-caudal de la región de interés. Para un típico estudio imparcial estereológicos 10.06 secciones muestreados de manera sistemática se requiere para obtener resultados fiables. En este ejemplo, 10 secciones igualmente espaciados a lo largo de la medida resultado rostro-caudal en un intervalo de muestreo de 1 / 6 secciones.
Parte 3: Creación de un banco de cerebros
- Una vez que la frecuencia de muestreo de la sección se ha determinado, el siguiente paso es determinar que las manchas se llevará a cabo de inmediato. Por ejemplo, si usted es la tinción con violeta de cresilo que captará 6.1 secciones en una diapositiva. Esta será la serie 1. Si usted sabe que hay quizá varias posibles anticuerpos que le gustaría correr, pero, o bien quieren ver los datos que proporciona la principal mancha o simplemente no tienen el tiempo para llevar a cabo la inmunohistoquímica, coloque el restante 5 series de secciones en el orden en que se cortan en preservar los pozos que contienen antígeno (1 polivinilpirrolidona%, 50% de glicol de etileno en o.1M PBS, pH 7,4). La siguiente tabla muestra un esquema de muestreo que consta de un tobogán y una placa (placa estándar de 48 pocillos) de las secciones como parte de un banco de cerebros (Tabla 1).
Tabla 1. La frecuencia de muestreo sección aquí es 1 / 6. La primera sección se coloca en un portaobjetos para la tinción de violeta de cresilo y los próximos cinco secciones se colocan en el antígeno preservar. Número de la sección 7 es capturado en la diapositiva y las secciones se colocan en 9.12 antígeno preservar. Este ciclo se repite hasta la región de interés o un bloque de tejido se agota en secciones. - El siguiente paso es exhaustiva sección del bloque de tejido. Coloque una pequeña cantidad de medio de inclusión en el plato y deje que se congele. Coloque el plato en la cabeza del microtomo y afeitarse suficiente del medio congelados para tener una superficie plana. Quitar el plato de la cabeza microtomo y lugar plano en el criostato. Verter medio de inclusión en el plato y colocar el bloque con firmeza el cerebro con la parte cortada stereotaxically posicionado rotundamente en el plato. Lenta y completamente integrar el cerebro en medio de montaje. Coloque el plato con el cerebro en la cabeza del microtomo y la sección con los parámetros predeterminados para la frecuencia de muestreo de la sección.
- Una vez que el bloque de tejido ha sido exhaustivamente seccionado y las secciones se colocan en los pozos, cubrir la placa con la tapa, ponga la tapa con parafilm, y colóquelo en un congelador a -20 ° C. Registrar el número total de secciones tomadas de cada serie, el intervalo de la sección de muestreo, y el número de serie de cada animal. Este registro será de vital importancia para realizar un seguimiento de la posterior retirada de las secciones del banco de cerebros de la inmunohistoquímica en el futuro.
Parte 4: Resultados del representante:
Muestreo sistemático de esta manera ha sido una práctica habitual en nuestro laboratorio durante los últimos 3 años. Hemos tenido un gran éxito la realización de inmunohistoquímica en el material que ha sido almacenado en el antígeno de preservar tres años después de que fue cortado, sin deterioro de la señal (Figura 1). Además, como parte de nuestro banco de cerebros que han registrado cerca de 20.000 secciones sistemática de los no humanoscerebro de los primates (Figura 2) como parte de nuestros planes de investigación a largo plazo. 
Figura 1. Esta es una sección del polo occipital de los primates no humanos immunostained para NeuN que muestra tanto la capa VI e intersticiales neuronas de sustancia blanca. Esta sección en particular se almacena en el antígeno conservar a -20 ° C por un período de 2 años. Barra de escala = 100μm. 
Figura 2. Nuestro banco de cerebros de los monos verdes se compone actualmente de cerca de 20.000 secciones sistemática de más de 30 monos.
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Discusión
El muestreo sistemático es un método barato destinado a maximizar el material de investigación. Esta estrategia de muestreo se ha diseñado para cumplir con las normas de estereología imparcial que requiere un muestreo sistemático en toda la región. Es muy importante que el orden de las secciones de cada serie se mantiene. En nuestro laboratorio hemos utilizado con éxito este método para la banca de los hamster y no humanos, cortes de cerebro de los primates. Hasta ahora, hemos recogido cerca de 20.000 monos verdes (...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Ikiel Ptito por su apoyo técnico continuo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Glicol etilénico | Fisher Scientific | E178-4 | |
| Poli(vinil pirrolidona) | Fisher Scientific | BP431-500 | |
| Medio de inclusión Thermal Scientific | Fisher Scientific |
Referencias
- West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space. J Vis Exp. , (2009).
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Reimpresiones y permisos
