Inyección intratorácica: administración de compuestos al corazón del pez cebra adulto

1. Preparación del pez para la inyección intratorácica

1. Atrapa un pez cebra adulto (Danio rerio) con una red y transfiérelo a la solución anestésica.
2. Después de 1-2 minutos, cuando el pez deje de nadar y el movimiento del opérculo se reduzca, toque el pez con una cuchara de plástico para asegurarse de que no reaccione a ningún contacto.
3. Transfiera rápida y cuidadosamente el pescado con la cuchara a la ranura de la esponja húmeda, con la parte ventral hacia arriba. La cabeza del pez debe apuntar en dirección opuesta a la mano dominante del operador.

2. Microinyección en el pericardio

1. Bajo el microscopio estereoscópico, observe cuidadosamente el movimiento del corazón latiendo debajo de la piel del pez. Determine visualmente el punto de inyección por encima del corazón latiendo y en el centro del triángulo definido por las placas cartilaginosas ventrales (Figura 1D). Inserte la punta del capilar en un ángulo de 30-45° grados con respecto al eje del cuerpo (Figura 1E). Penetrar suavemente en la piel con la punta del microcapilar hasta el pericardio (Figura 1C). Un punto de entrada óptimo es más cerca del abdomen que de la cabeza.
   nota: No inserte el capilar demasiado profundamente en el cuerpo y el corazón, ya que esto causará lesiones en el órgano. En caso de punción cardíaca, la aguja generalmente se llena de sangre. Si esto sucede, retire el capilar y excluya a los peces del experimento.
2. Una vez que la aguja esté dentro del pericardio, complete la inyección presionando el pedal del dispositivo de microinyector.
   nota: Tenga cuidado de no inyectar aire en la cavidad torácica.
3. Después de la inyección, retire suavemente el capilar del tórax e inmediatamente transfiera a los peces a un tanque con agua del sistema para su recuperación.
4. Monitoree a los peces hasta la recuperación total de la anestesia.
5. Recoja el corazón en el punto de tiempo deseado y prepárelo para un análisis posterior.
   nota: En caso de que el pez no reanude el movimiento del opérculo dentro de los 30 segundos, reanime al pez exprimiendo agua en las branquias con una pipeta de plástico.

Figura 1: Inyección intratorácica (IT) en pez cebra adulto. (A) Fotografía de un capilar de microinyección estirado con filamento (6", 1,0 mm de diámetro) y valores del programa de extracción de aguja utilizado. (B) Fotografía de un capilar de microinyección estirado con filamento (6", 1,0 mm de diámetro) relleno con 2,5 μL de solución que contiene un 10% de rojo fenol. La punta tirada de la aguja tiene una longitud máxima de 7 mm. C) Representación esquemática del procedimiento de inyección de IT. (D) Fotografías del procedimiento de inyección de IT. Esta cifra ha sido modificada de Bise et al. Los números en los paneles C y D corresponden a los mismos pasos del procedimiento: (1) el pescado se coloca con el lado ventral hacia arriba sobre una esponja humidificada. El sitio de punción (punto rojo en el triángulo) se encuentra en el centro del tórax, cerca de las branquias. (2) Penetración de la aguja en el pericardio. El punto rojo indica el sitio de la punción. (3) La inyección se controla observando la propagación de la solución roja en la cavidad pericárdica. e) Esquema de inyección de TI. El ángulo entre el capilar de inyección y el eje del cuerpo debe estar entre 30° y 45° para evitar la punción cardíaca. (F) Fotografías del tórax de los peces 1 hora después de la inyección IT de los volúmenes indicados. Las flechas blancas apuntan al tejido rojizo, lo que podría indicar una hemorragia interna