Trasplante de tumor ortotópico con homoinjerto: una técnica para generar modelos de ratón de tumores pancreáticos

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación para el trasplante de tumores

1. Alojamiento de animales
   1. Obtén ratones C57BL/6 genéricos de un proveedor comercial de cría.
   2. Ratones domésticos (5) en jaulas individuales ventiladas en las siguientes condiciones: Temperatura: 20-26 °C; humedad 30-70%; ciclo de iluminación: 12 h luz y 12 h oscuridad.
   3. Use ropa de cama de mazorca de maíz que se cambie semanalmente.
   4. Para la dieta, proporcione alimentos esterilizados con gránulos secos por irradiación durante todo el período de estudio.
   5. En cuanto al agua, proporcione a los animales libre acceso a agua potable estéril.
2. Preparación de fragmentos tumorales del donante
   1. Comience por controlar el peso corporal (PC), mediante el pesaje con una balanza, y el volumen tumoral (TV), mediante la medición con calibre, de ratones donantes portadores de tumores.
   2. Cuando el televisor alcance los 500-1.200^mm3, eutanasiar al animal en una capucha de riesgo biológico según el protocolo.
   3. Esterilizar la piel alrededor del tumor con hisopos de yodóforo.
   4. Extirpar quirúrgicamente el tumor según el protocolo.
   5. Inspeccionar visualmente y por palpación la presencia de tumores palpables antes de la terminación.
   6. Para la terminación, primero se practica la eutanasia a los ratones según el protocolo aprobado, se abre el abdomen y se examina visualmente el páncreas en busca de tumores.
   7. Cortar el tumor mediante cirugía postmortal y agregarlo al PBS frío. Coloque a todos los animales en una cámara de eutanasia limpia, sin carga y translúcida con una tapa especial con un puerto para la entrega del dióxido de carbono que se utilizará.
   8. Descargue el gas en la cámara a un caudal que produzca una rápida inconsciencia con un sufrimiento mínimo para el animal. El caudal óptimo de CO₂ debe ser de unos 2-2,5 L/min.
   9. Observe visualmente a cada animal durante el procedimiento de eutanasia para asegurarse de que todos los animales reciban concentraciones adecuadas de gas y no recuperen la conciencia durante el procedimiento de eutanasia.
   10. Mantenga el flujo de gas durante al menos 1 minuto después de la muerte clínica aparente para minimizar la posibilidad de que un animal se recupere (si está apneico pero no muerto).
   11. Extirpar los tejidos adyacentes no tumorales. El tumor limpio se puede fotografiar rápidamente.
       Coloque los tejidos tumorales en RPMI-1640 y manténgalos en hielo antes de la disociación.
       nota: Los cadáveres de los animales se embolsan y se almacenan en el congelador adecuado a la espera de su retirada.
   12. Coloque el tumor en una placa de Petri que contenga 20 mL de PBS (enfríe previamente el medio o tampón a 4 °C antes de sacrificar a los animales).
   13. Si hay sangre contaminante, transfiera el tumor a otra placa de Petri y lave el tumor con PBS.
   14. Cortar el tumor por la mitad, eliminando el exceso de piel, vasos, calcificación y/o necrosis.
   15. Elija solo fragmentos intactos del tumor y colóquelos en un tubo de centrífuga estéril de 50 mL y agregue 20 mL de PBS, luego transporte el tubo a una sala de animales separada para estudios de farmacología.

>2. Implante ortotópico pancreático

1. Anestesia y analgesia
   1. Utilice una inyección de 2 mL de ketamina y una inyección de xilacina de 0,42 mL (20 mg/mL) mezcladas en 5,91 agua estéril para inyección o solución salina a un volumen de dosis de 0,06-0,1 mL/20-25 g de peso corporal.
      NOTA: De acuerdo con el bienestar animal, la analgesia es necesaria tanto antes como después de la operación. 0,05–0,1 mg de buprenorfina/kg, SC. La primera dosis es previa a la operación y luego se dosifica 3 veces cada 4 horas después de la operación de forma continua.
2. Operación quirúrgica para la implantación ortotópica
   1. Anestesiar ratones mediante inyección intramuscular (IM). Anestesiar al animal receptor con isoflurano al 5%, que se mantiene mediante un cono nasal al 1%. El animal comenzará a relajarse, perderá su reflejo de enderezamiento y, finalmente, se volverá inmóvil. A esta profundidad de anestesia pueden ser fácilmente despertados por estímulos dolorosos; Permita que la anestesia se profundice hasta que tales respuestas al dolor estén ausentes.
   2. Después de que los animales estén completamente anestesiados, fije los ratones en una tabla de experimentos en la posición lateral derecha.
   3. Mantenga los ratones en la posición lateral derecha. Desinfecte la piel alrededor del bazo con yodo y luego desyodime con alcohol etílico al 75%.
   4. Encuentre el punto medio del bazo y haga una incisión vertical de 1 cm en el abdomen para exponer el bazo.
   5. Extraiga suavemente una parte del tejido del páncreas debajo del bazo con pinzas de punta plana y suture una pieza tumoral de homoinjerto de ratón a partir de un ratón semilla en el páncreas del ratón receptor con una sutura quirúrgica absorbible 9-0.
   6. Cerrar el abdomen con una sutura de seda 6-0 por doble costura. Lograr la homeostasis por compresión.
   7. Después de terminar la implantación del tumor, si no se produce sangrado ni fuga de tejido tumoral, mantenga a los animales en una jaula caliente.
   8. Monitoree al animal hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal; regrese al animal a la habitación del animal después de la recuperación completa de la anestesia. Monitoree a los ratones portadores de tumores palpando el abdomen cerca del bazo y seleccione los ratones portadores de tumores ortotópicos.

>3. Monitoreo de la salud de los ratones portadores de tumores

1. Controlar el consumo diario de agua y alimentos.
2. Examine la apariencia del ratón en busca de un pelaje sin arreglar, bultos, delgadez, aliento anormal o ascitis.
3. Palpar el abdomen para comprobar si hay tumores espontáneos en el hígado o el bazo.
4. Pesa a los ratones semanalmente usando una balanza.
5. Si se observa alguno de los siguientes signos clínicos, los ratones se sacrifican para la recolección de muestras y la necropsia: pérdida de peso corporal >20%; movilidad alterada (no pueden comer ni beber); incapacidad para moverse normalmente debido a una ascitis significativa y abdomen agrandado; esfuerzo en la respiración.