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Abstract

Fuente: Garone, M. G. et al. Conversión de Células Madre Pluripotentes Inducidas (iPSCs) Humanas en Neuronas Motoras Espinales y Craneales Funcionales Utilizando Vectores PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra el procedimiento para generar neuronas motoras mediante la transfección de iPSCs humanas con el sistema de transposones PiggyBac mediante la expresión ectópica de factores de transcripción específicos del linaje.

Protocol

1. Generación de líneas iPSC inducibles NIL y NIP

1. Transfección celular
   1. Enjuague las células con PBS (libre de Ca²⁺/Mg²⁺).
   2. Añadir reactivo de disociación celular (ver Tabla de Materiales) (0,35 mL para una placa de 35 mm) e incubar a 37 °C hasta que las células individuales estén
   3. separados (5-10 min).
   4. Separación celular completa suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1000 3-4 veces.
   5. Recoger en un tubo de 15 mL y añadir PBS (Ca^2+/Mg²⁺ libre) a 10 mL. Cuenta las celdas.
   6. Pellet 10⁶ celdas y resuspender en 100 μl de Buffer R (incluido en el kit de electroporación de celdas, ver Tabla de Materiales).
   7. Añadir ADN plasmídico para la transfección: 4,5 μg de vector transponible (epB-Bsd-TT-NIL o epB-Bsd-TT-NIP) y 0,5 μg del plásmido transposasa piggyBac.
   8. Transfectar con el sistema de electroporación de celdas (ver Tabla de Materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con los siguientes parámetros: voltaje de 1.200 V, ancho de 30 ms, 1 pulso. Siembre las células en medio iPSC humano suplementado con 10 μM de Y-27632 (inhibidor de ROCK, ver Tabla de Materiales) en un plato recubierto de matriz de 6 mm.

Materials

B27	Miltenyi Biotec	 130-093-566	Serum free supplement for neuronal cell maintenance
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	Cell freezing medium for motor neuron progenitors
CaCl<sub>2</sub>	Sigma-Aldrich	C3881	Chemicals for electrophysiological solutions
Corning Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA	Biological Industries	05-710-1E	Freezing medium for human iPSCs
Dispase	Gibco	17105-041	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Basal medium for cell culture
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Commercial human iPSC line
GDNF	PreproTech	450-10	Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC Line	Thermo Fisher Scientific	A18945	Commercial human iPSC line
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	Chemicals for electrophysiological solutions
Laminin	Sigma-Aldrich	11243217001	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 &mu;L Kit	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Cell electroporation kit
Neon Transfection System	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Cell electroporation system
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049	Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the&nbsp; need for an astrocyte feeder layer
NutriStem-XF/FF	Biological Industries	05-100-1A	Human iPSC culture medium
PBS Ca<sup>2+</sup>/Mg<sup>2+</sup> free	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, w/o Calcium, w/o Magnesium
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005	Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival